釀酒酵母發酵白芨產水溶性多糖工藝優化及抗氧化活性研究

高 超，劉 姝*，高志賢，張 磊，張財順

（遼寧石油化工大學 石油化工學院，遼寧 撫順 113001）

白芨（Bulbophyllum albicana）為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bulbophyllum）植物，又名白給、及草[1]，擁有1 000多年的藥用歷史[2-3]，具有收斂止血、清除濕熱、消腫生肌等藥理作用[4]。多糖是中藥白芨的主要活性成分，具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]、調節免疫力[8]、抗炎[9]、降血糖[10]、降血脂[11]等生理功能。廣泛應用在保健食品、醫藥、化妝品等領域。當前，白芨多糖的提取方法較多主要包括物理法[12]與化學法[13]，利用上述兩種方法提取多糖會一定程度破壞多糖的生物活性，因此選擇有效的提取方法提高活性產物的收率是開發利用白芨多糖的關鍵[14]。

近些年，隨著生物學與生物工程學的發展，微生物發酵在中藥生物轉化研究領域有大量的應用，中藥經過微生物發酵后，能夠更好的發揮中藥的藥效[15]。酵母菌是常用的發酵劑，其生長過程中可以產生淀粉酶和蛋白酶等多種酶系，能夠水解中藥中的淀粉與蛋白質，從而為其生長提供氮源與碳源；同時酵母菌能夠生成纖維素酶等代謝產物，破壞細胞壁，使有效成分得以溶出[16]。李暄[17]利用釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵麩皮，其體外抗氧化活性顯著增高。陳秉彥等[18]利用釀酒酵母菌與乳酸桿菌混合發酵龍須菜，其多糖的抗氧化能力顯著增加。劉艷芳等[19]利用釀酒酵母發酵靈芝，發酵后的靈芝多糖分子質量顯著降低，免疫活性顯著提高。然而，釀酒酵母發酵白芨制備多糖目前尚鮮見報導，因此有必要對其進行研究。

本研究以耐高溫釀酒酵母發酵白芨制備水溶性多糖。以多糖含量為評價標準，采用單因素試驗與響應面優化試驗，優化最佳的發酵工藝條件，并與水提法進行對比，考察發酵法提取的水溶性糖的抗氧化能力。旨在為未來以白芨為原料生產或開發功能性產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

耐高溫釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；白芨（自然晾干，粉碎，過250目篩）：市售。

1.1.2 試劑

無水乙醇（分析純）：天津富宇精細化工有限公司；濃硫酸（分析純）：沈陽化學試劑廠；乙酸乙酯（分析純）；江蘇強盛功能化學股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；蒽酮（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

722S紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；ASCENDTM400型核磁共振波譜儀：德國Bruker（布魯克）公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JA5003N分析天平：上海精密儀器科技有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器：哈爾濱東明醫療儀器廠；Spectrum GX傅立葉紅外光譜儀：美國Perkin-Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 白芨水溶性多糖的制備

耐高溫酵母菌培養液的制備：稱取5 g YEPD培養基粉末，加入100 mL超純水溶解，加入0.4 g菌種（干種）耐高溫釀酒酵母菌，在溫度為35 ℃，搖床轉速為120 r/min的條件下培養1 d，測得其活化菌種濃度為1.06×108CFU/mL，備用。

發酵組多糖的制備[16，20]：稱取2 g白芨粉末，加入100 mL超純水，接種10%的菌種培養液，設定溫度為38 ℃，初始pH值為5.5，搖床轉速為120 r/min的條件下，培養24 h。取50 mL白芨發酵液，3 000 r/min離心30 min，取發酵上清液40 mL，置于-20 ℃的冰箱中冷凍1 d，然后放入冷凍干燥機的干燥箱中，冷凍干燥4 d，得到發酵組水溶性多糖凍干粉末。

水提組多糖的制備[20]：稱取2 g白芨粉末，加入100 mL超純水，不接菌，設定溫度為38 ℃，初始pH值為5.5，搖床轉速為120 r/min的條件下，培養24 h，取50 mL水提液，3 000 r/min離心30 min，取水提上清液40 mL，置于-20 ℃的冰箱中冷凍1 d，然后放入冷凍干燥機的干燥箱中，冷凍干燥4 d，得到水提對照組水溶性多糖凍干粉末。

1.3.2 分析檢測

（1）發酵液中的酵母菌細胞數測定

參照文獻[21]的方法，取0.1 mL的發酵液稀釋100倍，滴加在血球計數板上，用顯微鏡觀察計數。

（2）白芨發酵液中水溶性多糖含量的測定

參照文獻[22]的方法，配制0.2 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別準確移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL葡萄糖標準溶液，各試管加入純凈水補至2 mL。加入0.5 mL乙酸乙酯、0.01 g蒽酮、5.0 mL濃硫酸反應10 min，以2.0 mL的純凈水同等操作為空白對照，用紫外分光光度計，測定波長620 nm條件下的吸光度值。以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y=0.061x+0.042，相關性系數R2=0.996 3。取10.0 mL白芨發酵液，3 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液，依據標準曲線回歸方程，計算出白芨發酵產水溶性多糖含量。

（3）紅外光譜分析

取1 mg發酵組水溶性多糖凍干粉末與100 mg溴化鉀固體混合，然后將混合物進行充分研磨，壓片。利用紅外光譜儀在波數范圍為400～4 000 cm-1，進行掃描[23]。

（4）水溶性多糖對DPPH自由基清除能力測定

參照文獻[24]的方法，并稍作改進。量取DPPH粉末1 mg溶于20 mL體積分數95%的乙醇中，超聲5 min，配制0.5 mmol/L的DPPH測試液。取DPPH溶液2.0 mL加入試管中，加入體積分數95%的乙醇2.0 mL。避光靜置30 min后，在波長517 nm處測定吸光度值A0。發酵組和水提對照組凍干上清液后獲得的水溶性多糖對DPPH自由基清除能力的測定：首先稱取一定質量水溶性多糖凍干粉配制成0、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的樣品液，然后向試管中加入1 mL不同質量濃度的水溶性多糖溶液，最后依次加入2.0 mL0.5 mmol/L的DPPH溶液與1.0 mL體積分數95%的乙醇，避光靜置30 min后，在波長517 nm處測定吸光度值A。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：A0為沒加樣品反應體系的吸光度值；A為加入待測樣品反應體系的吸光度值。

（5）核磁共振碳譜分析

采用ASCENTM400核磁共振波譜儀，對多糖進行核磁共振碳譜分析（13C NMR分析），采用氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）為溶劑，化學位移相對于內標物DMSO化學位移值低場百萬分數來確定。脈沖寬度為10 μs，采樣時間3.27 s，采樣次數64次，延遲時間10 s。

1.3.3 耐高溫酵母菌發酵白芨工藝優化

（1）單因素試驗

以料液比1∶50（g∶mL），接種量為10%，發酵時間24 h，發酵溫度為30 ℃，搖床轉速為120 r/min，初始pH值為5.5為基礎，依次考察培養條件：接種量（5%、10%、15%、20%）、發酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）、發酵溫度（30 ℃、32.5℃、35 ℃、37.5 ℃、40 ℃）、搖床轉速（100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min）和初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對多糖含量和酵母菌細胞數的影響。

（2）響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化發酵工藝條件，應用Box-Behnken試驗設計，以發酵溫度（A）、搖床轉速（B）、初始pH值（C）3個因素為自變量，多糖含量（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面優化試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 白芨發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for Bletilla striata fermentation conditions optimization

1.3.4 數據處理

每組試驗進行3次平行試驗，試驗數據通過Microsoft Excel 2019、Design-Expert 13.0、采用Orgin2022進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量的確定

改變接種量，考察不同接種量對水溶性多糖含量和耐高溫酵母菌細胞數的影響，結果見圖1。

圖1 接種量對多糖含量及酵母菌細胞數的影響Fig. 1 Effect of inoculum on the polysaccharides contents and number of yeast cells

由圖1可知，多糖含量隨著接種量的升高，呈現先上升后下降的趨勢。當接種量為10%時，多糖含量達到最高值，為1.29 mg/mL。出現這種情況原因可能是：接種量在5%～10%之間時，細胞數增長適宜，有利于次級代謝產物多糖的產生。當接種量＞10%時，細胞數目增長太快，會促進初級代謝產物的產生，抑制次級代謝產物多糖的產生，導致酵母菌細胞數目增多，多糖含量下降。因此，選擇最佳接種量為10%。

2.1.2 發酵時間的確定

酵母菌的生長過程，主要包括延滯期、對數期、穩定期、衰亡期四個階段[25]。不同發酵時間目標產物的產量會有所不同，因此改變發酵時間，考察不同發酵時間對水溶性多糖含量和耐高溫酵母菌細胞數的影響，結果見圖2。

圖2 發酵時間對多糖含量及酵母菌細胞數的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on the polysaccharides contents and number of yeast cells

由圖2可知，耐高溫酵母菌發酵12～24 h為對數生長期，24～36 h為穩定期，36～60 h為衰亡期。對數生長期的末期即發酵時間為24 h，多糖產量最高，為1.29 mg/mL。24 h之后，多糖產量逐步降低。出現這種原因可能是發酵處于對數生長期階段營養充足，利于產物的積累，所以多糖產量顯著升高，隨著發酵時間的延長，培養基內的營養物質消耗殆盡，多糖產量下降，菌種代謝活力下降。因此，選擇最佳發酵時間為24 h。

2.1.3 發酵溫度的確定

適宜的溫度是保證菌種正常生理活動的前提，溫度偏低，酶活性達不到最佳的催化效果[26]。溫度偏高，酶活與酶量降低，導致目標產物產量降低。因此改變發酵溫度，考察不同發酵溫度對水溶性多糖含量和耐高溫酵母菌細胞數的影響，結果見圖3。

圖3 發酵溫度對多糖含量及酵母菌細胞數的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the polysaccharides contents and number of yeast cells

由圖3可知，在30～37.5 ℃溫度區間之內，酵母菌產酶活性與產酶量逐漸升高，當溫度達到37.5 ℃時，此溫度下的酶量與酶活都達到最高，目標產物多糖與酵母菌細胞數均達到最高值，分別是2.80 mg/mL和3.5×107CFU/mL。溫度高于37.5 ℃時，酶活力均下降，導致多糖產量降低。因此，選擇最佳發酵溫度為37.5 ℃。

2.1.4 搖床轉速的確定

改變搖床轉速，考察不同搖床轉速對水溶性多糖含量和耐高溫酵母菌細胞數的影響，結果見圖4。

圖4 搖床轉速對多糖含量及酵母菌細胞數的影響Fig. 4 Effect of shaker speed on the polysaccharides contents and number of yeast cells

由圖4可知，在搖床轉速100～120 r/min范圍內，多糖含量與酵母菌細胞數隨著搖床轉速升高而升高；當搖床轉速達到120 r/min時，目標產物多糖與酵母菌細胞數均達到最高值，分別是2.80 mg/mL和3.5×107CFU/mL。當搖床轉速超過120 r/min后，多糖含量與酵母菌細胞數明顯降低，可能是由于搖床轉速過高，導致剪切力過高，細胞破碎，產生泡沫，從而降低溶氧量，影響菌體生長。因此，選擇最佳搖床轉速為120 r/min。

2.1.5 初始pH的確定

pH不僅影響細胞膜的通透性，還會影響酶的活性以及菌種的正常生理代謝活動，是影響菌種的生長與產物合成的重要因素。因此改變基礎培養基的初始pH值，考察初始pH值對水溶性多糖含量和耐高溫酵母菌細胞數的影響，結果見圖5。

圖5 初始pH值對多糖含量及酵母菌細胞數的影響Fig. 5 Effect of pH on the polysaccharide content and number of yeast cells

由圖5可知，初始pH值在4.0～5.5之間，多糖含量與酵母菌細胞數隨著pH值的升高而升高；當初始pH值為5.5時，多糖產量與酵母菌細胞數達到最大值，分別為2.80 mg/mL和3.5×107CFU/mL；初始pH值＞5.5時多糖產量與酵母菌細胞數明顯降低。出現這種情況的原因可能是耐高溫酵母菌最適合的生長pH值為5.0～5.5，初始pH值超過5.5不適合酵母菌生長，酶活性與酶量均快速下降，導致多糖產量降低。因此，選擇最佳初始pH值為5.5。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken試驗設計以及結果

在單因素分析的基礎上，應用SPSS 25.0軟件進行多元線性回歸分析，計算5個因素的標準化回歸系數，即標準化回歸系數越大，對多糖產量影響越大。標準化分析結果表明，發酵溫度（A）、搖床轉速（B）、初始pH值（C）對多糖產量影響程度較大，因此選擇這3個因素為自變量，以水溶性多糖的含量（Y）為響應值進行試驗。試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 白芨發酵條件優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for Bletilla striata fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

將表2中的試驗數據采用Design-Expert 13.0軟件進行多元回歸擬合分析，得到回歸模型方程為：Y=0.281+0.207 5A-0.095 0B-0.072 5C-0.005 0AB-0.045 0AC-0.050 0BC-0.420 0A2-0.335 0B2-0.325 0C2。

由表3可知，該模型P＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，說明該模型擬和程度好[27]，能夠充分解釋多糖含量的變化。決定系數R2=0.983 5，說明98.35%的多糖含量變化可以用回歸模型方程來解釋。調整決定系數R2Adj＞0.9，也表示了該回歸模型相關性高，擬合程度好。變異系數（coefficient of variation，CV）描述試驗的可信度以及精確度。CV系數越小，可信度越高、精確度越好，該試驗的變異系數CV為3.18%（CV＜10%表明實驗具有弱變異性），說明實驗結果真實可靠。綜上所述，該模型可以很好的預測水溶性多糖產量。

由F值可知，發酵溫度（A）、搖床轉速（B）、初始pH值（C）三個因素對多糖產量影響程度由大到小次序為A＞B＞C。由P值可知，發酵溫度（A）、搖床轉速（B）對多糖產量影響極顯著（P＜0.01）。初始pH（C）對多糖產量影響顯著（P＜0.05）。交互項AB、AC、BC對多糖產量影響均不顯著（P＞0.05）。二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應面分析

響應面坡面陡峭程度反應兩個因素交互作用的強弱以及多糖含量的影響程度，響應面坡面越陡，兩個因素交互作用越強。等高線反應各因素之間交互作用的強弱，等高線是橢圓，表示兩因素之間交互作用強；等高線是圓形，表明兩因素之間交互作用弱。各因素交互作用對多糖含量影響的曲面圖以及等高線見圖6。

圖6 各因素之間交互作用對多糖含量影響的響應曲面與等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on polysaccharide content

由圖6可知，所有曲面呈凸面，開口向下，說明最大值覆蓋在響應面范圍之內。由圖6a可知，發酵溫度與搖床轉速的曲面坡度較為平緩，等高線為圓形，說明發酵溫度與搖床轉速之間的交互作用弱，對多糖產量的影響程度低。由圖6c可知，搖床轉速與初始pH值的曲面坡度較為陡峭，說明交互項BC相較于交互項AB、AC交互作用強，對多糖產量影響程度較高。因此，交互作用強弱依次為：BC＞AC＞AB，但交互作用對結果影響均不顯著，這與方差分析結果一致。

2.3 驗證試驗結果

根據回歸模型得出最佳發酵工藝條件預測結果為：發酵溫度37.8 ℃、轉速119 r/min、初始pH值5.45，在此條件下多糖含量預測值為2.847 mg/mL。為方便試驗實際操作，對發酵工藝參數進行了修正，白芨2 g，超純水100 mL，接種量為10%，發酵時間為24 h，發酵溫度為38 ℃、初始pH值為5.5、轉速為120 r/min。重復試驗3次，此條件下得到多糖的平均實際值為2.80 mg/mL。與預測值比較，相對誤差為1.7%，證明該模型預測多糖產量的可靠性與準確性。

2.4 提取物紅外光譜特征

對提取物進行紅外光譜測定，結果見圖7。由圖7可知，在波數3 390 cm-1處出現強吸收峰，歸屬于-OH伸縮振動；在波數2 950 cm-1與1 450 cm-1處存在吸收峰，歸屬于-CH2伸縮振動峰；在波數1 650 cm-1處存在吸收峰，歸屬于羰基的伸縮振動峰。在1 512 cm-1處出現吸收峰，說明樣品中存在蛋白質[28]；波數在1 000～1 200 cm-1范圍內存在吸收峰，說明了C-OH鍵的存在；波數在715 cm-1處存在吸收振動峰，說明分子中存在4個或者4個以上-CH2。本實驗發酵組的提取物IR譜圖特征與胡楠楠等[20，29]描述多糖的特征峰基本一致，說明發酵組提取物中存在多糖類物質。

圖7 多糖提取物紅外光譜測定結果Fig. 7 Determination results of infrared spectrum of polysaccharides extracts

2.5 水溶性多糖抗氧化能力分析

將發酵組和水提對照組上層清液凍干后得到的水溶性多糖粉末，配制成不同質量濃度的多糖溶液，測定其DPPH自由基清除率，結果見圖8。

圖8 水溶性多糖的DPPH自由基清除率測定結果Fig. 8 Determination results of DPPH free radical scavenging rates of water-soluble polysaccharides

由圖8可知，水溶性多糖對DPPH自由基清除能力存在濃度依賴關系，在多糖含量1～2 mg/mL范圍內，DPPH自由基清除率隨質量濃度的增加而增大，在多糖含量3～4 mg/mL范圍內，DPPH自由基清除率隨著多糖質量濃度的升高基本保持不變。水提對照組最大DPPH自由基清除率為30.9%，發酵組的最大DPPH自由基清除率為66.5%，發酵組是對照組的2.15倍，說明發酵后抗氧化能力提高。通過核磁共振碳譜（13C NMR）分析發酵組與水提對照組的水溶性多糖對DPPH自由基清除率存在差異的原因，結果見圖9。

圖9 發酵組（A）及水提對照組（B）水溶性多糖13C NMR分析Fig. 9 13C NMR analysis of water-soluble polysaccharides in fermentation group (A) and water extraction group (B)

由圖9A與圖9B對比可知，發酵組A水溶性多糖的化學位移在150～210 ppm之間出現明顯的吸收峰，而水提對照組B水溶性多糖未出現吸收峰，說明二組的水溶性多糖結構不同，進而導致對DPPH自由基清除率存在明顯差異。

3 結論

本研究采用單因素試驗與響應面優化試驗，以多糖含量為評價指標，對耐高溫釀酒酵母菌發酵白芨的工藝條件進行優化，最佳發酵工藝條件為：接種量10%、搖床轉速120 r/min、發酵溫度38 ℃、初始pH值為5.5、發酵時間24 h。該優化條件下，得到的水溶性多糖含量為2.80 mg/mL，與響應面預測值相近，說明該響應面模型能夠很好的預測多糖產量。對提取物進行紅外光譜分析，結果表明其紅外光譜圖具有糖類物質特征吸收峰。抗氧化能力分析結果表明，優化后發酵多糖對DPPH自由基清除率最高為66.5%，具有一定的抗氧化活性。后續研究可以對多糖進行純化及單糖組分分析。