乳酸菌與酵母菌互作對蘿卜泡菜發酵進程及風味品質的影響

黃玉立，葛黎紅，馬思堯，梅 源，盧 偉，趙 楠*

（1.四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101；3.四川老壇子食品有限公司，四川 眉山 620010）

泡菜是以乳酸菌為主發酵而成的一種“冷加工”蔬菜制品。在厭氧的環境條件中，乳酸菌作為優勢菌群不斷生長并生成有機酸等一系列代謝產物，賦予泡菜獨特的口感[1]；酵母菌在泡菜中含量較少，也不是優勢菌群，研究過程其重要性常被忽略，但研究表明酵母在發酵過程產生的乙醇不但有效的抑制泡菜生花，還能與有機酸等物質反應生成酯類等芳香物質，豐富了泡菜的香氣[2]。且過去研究發現乳桿菌屬（Lactobacillus）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）是泡菜中的主要乳酸菌屬和酵母屬[3]。

乳酸菌和酵母菌處于同一發酵體系中，可以通過代謝產物交換或者細胞交流實現微生物種間的相互作用[4-5]。已有關于酸奶[6]、酸面團[7]、開菲爾乳[8]等的研究表明，酵母菌在富含氮源的生長環境中，其TORC1信號通路受到刺激，代謝產生的氨基酸可為乳酸菌提供生長所需的營養物質，促進乳酸菌的生長[9]；而乳酸菌分解乳糖所產生的葡萄糖和半乳糖同時可被酵母菌利用[10]。乳酸菌和酵母菌的代謝互補機制使得微生物即使處于營養物質較匱乏的發酵環境中仍然能夠生長，使得復雜體系發酵過程更加高效、穩定和可控[11]。泡菜作為典型的多菌種參與的復雜發酵體系，目前合成微生物群落的研究已經受到研究者的關注[12]。泡菜中關注點對于乳酸菌與乳酸菌或環境因素之間的影響或關系較多，然而關于泡菜中乳酸菌與酵母的互作對發酵進程和品質的影響研究還較少，仍需要深入探究。

因此，該研究通過采用無菌鹽水發酵蘿卜作為對照組，分別接種了植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）、甘草乳桿菌（Liquorilactobacillus nagelii）和少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）單菌和混菌于蘿卜泡菜中，測定了發酵過程中蘿卜泡菜鹵水的微生物數量（乳酸菌數量、酵母菌數量和菌落總數）和理化參數（pH、總酸、還原糖、亞硝酸鹽）。通過頂空固相微萃取-氣質聯用（headspace-solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）方法檢測發酵終點泡蘿卜的揮發性風味物質，使用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）方法分析了風味化合物差異，解析了乳酸菌和酵母菌混合發酵對蘿卜泡菜風味的影響，以期為泡菜工業化生產過程中品質提升提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮紅皮蘿卜：成都市錦江區某果蔬市場。

植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）（Lp）、甘草乳桿菌（Liquorilactobacillus nagelii）（Ln）與少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）（Ke）：篩分自泡菜鹵水，并保存于四川省農業科學院農產品加工研究所微生物菌種保藏庫。

1.1.2 試劑

氯化鈉、鹽酸：成都金山化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸：廣州和為醫藥科技有限公司；四硼酸鈉、α-萘乙二胺二鹽酸鹽、乙酸鋅、無水對氨基苯磺酸和亞硝酸鈉：成都市科隆化學品有限公司；亞鐵氰化鉀：成都市科龍化工試劑廠。試驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、乳酸菌（man rogosa sharpe，MRS）培養基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SynergyTMHTX多功能酶標儀：美國博騰儀器有限公司；Centrifuge5810R冷凍離心機：艾本德（上海）國際貿易有限公司；LRH-150生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；S210SevenCompact pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；Metrohm855全自動滴定儀：瑞士萬通有限公司；Intuvo9000-5977b氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將乳酸菌Lp和Ln分別劃線接種到MRS固體培養基中，于37 ℃恒溫倒置培養24 h；酵母Ke劃線接種到YPD固體培養基中，于30 ℃恒溫倒置培養24 h。在恒溫培養箱中培養24 h之后，分別挑取Ln和Lp的單菌落接入MRS液體培養基中，挑取Ke的單菌落接入YPD液體培養基中，進行24 h的富集培養，使所有菌體濃度達到7（lg CFU/mL）。

1.3.2 泡菜發酵模擬培養液的制備

無菌紅皮蘿卜汁的制備：挑選新鮮的紅皮蘿卜進行洗凈、切分，與純凈水按1∶1的比例混合榨汁，然后過濾掉紅皮蘿卜殘渣，將過濾紅皮蘿卜汁煮沸、撇去浮沫，最后使用紗布再次進行過濾、分裝，高壓蒸汽115 ℃、15 min滅菌后待用。用該蘿卜汁模擬泡菜發酵營養液作為菌種培養液。

1.3.3 單菌組和混菌的發酵母液制備

將Lp、Ln和Ke按照1%的接種量分別接種于模擬營養液中；混菌發酵分別為Lp+Ke組、Ln+Ke組（1∶1）和Lp+Ln+Ke組（1∶1∶1），各組中微生物均按總接種量1%混合接種于模擬營養液中，所有培養液于30 ℃恒溫培養24～48 h分別得到單菌和混菌發酵母液，各組處理菌體濃度均為7（lg CFU/mL）。

1.3.4 生長曲線測定

按照1%的總接種量分別接種1.3.3中的單菌組Lp、Ln、Ke以及混菌組Lp+Ke、Ln+Ke和Lp+Ln+Ke的菌體發酵母液于泡菜發酵模擬培養液中，25 ℃恒溫培養菌液48 h，期間每隔2 h取樣用酶標儀在波長600 nm條件下測定吸光度值，以時間為橫坐標，吸光度值（OD600nm）為縱坐標，繪制不同處理組的生長曲線。

1.3.5 蘿卜泡菜制作

將新鮮的紅皮蘿卜洗凈、晾干、切分后與4%的鹽水以1∶2的比例裝入500 mL的壇中，將1.3.3中的發酵母液各取50 mL菌液，在8 000 r/min條件下進行離心10 min，收集離心沉淀菌體，用生理鹽水沖洗并接種于蘿卜泡菜中；CK組為無菌4%的鹽水發酵紅皮蘿卜。將制備好的蘿卜泡菜放置于25 ℃，發酵0～7 d，并在0、1 d、3 d、5 d、7 d取樣進行理化和微生物分析，取發酵終點7 d的蘿卜樣品進行揮發性風味物質的檢測。

1.3.6 理化指標分析檢測

取發酵過程中0、1 d、3 d、5 d、7 d的蘿卜泡菜鹵水進行理化指標分析：采用電位法測定pH值[13]；采用酸、堿中和滴定法測定總酸[14]；采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖[15]；采用GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的分光光度法測定亞硝酸鹽。

1.3.7 微生物分析檢測

取0.5 mL蘿卜泡菜鹵水于4.5 mL無菌生理鹽水中混合均勻，經梯度稀釋后，分別涂布于MRS平板，厭氧條件下37 ℃經72 h培養后計數乳酸菌數量，采用孟加拉紅平板，30 ℃條件下培養72 h后計數真菌數量，采用PCA平板，37 ℃經72 h培養后計數菌落總數。

1.3.8 揮發性風味物質檢測[16]

（1）樣品前處理

取5 g泡蘿卜樣品，并加入1.5 g的NaCl于20 mL的頂空進樣瓶中。

（2）GC-MS測定條件

萃取條件：50 ℃振搖加熱20 min，新萃取頭需經270 ℃老化5 min，然后插入頂空瓶吸附30 min，隨后在氣相進樣口250 ℃下解吸5 min。

氣相色譜條件：DB-wax色譜柱（30m×250μm×0.25μm），柱溫50 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速度升至150 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至220 ℃并保持2 min，載氣（He），流速1 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍：35～550 m/z。

（3）定性定量

由GC-MS得到的譜圖，在美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）2001標準譜庫的檢索及標準品比對進行物質定性，使用面積歸一化法進行物質的相對定量。

1.3.9 數據處理

采用SPSS20.0軟件進行皮爾遜相關性分析，使用GraphPad Prism9.0.0軟件繪制折線圖，OPLS-DA分析使用SIMCA14.1。

2 結果與分析

2.1 單菌和混菌在蘿卜泡菜模擬營養液中的生長曲線

生長曲線可以反映微生物的生長速度，為探究乳酸菌和酵母互作關系對其生長情況的影響，分別測定了Lp、Ln和Ke三種單菌的生長曲線以及Lp+Ke、Ln+Ke、Lp+Ln+Ke混菌的生長曲線，結果見圖1。

圖1 單菌和混菌在培養液中的生長曲線Fig. 1 Growth curves of single and mixed strains in culture solution

由圖1可知，乳酸菌和酵母菌在共培養下，生長情況較單獨培養時有明顯差異，該研究結果同洪家麗等[17-18]的研究結果一致。在單乳酸菌體系的生長曲線結果中，Lp生長較Ln更快，26 h后逐漸進入平臺期，OD600nm值不再有明顯的變化。乳酸菌和酵母菌混合體系相較于單酵母菌Ke體系延遲了4～6 h進入平穩期。且乳酸菌和酵母的混合體系的生長速率最快，在8 h就進入對數期。其中，3種混菌體系的吸光度值普遍比單菌體系的吸光度值高，表明乳酸菌Lp、Ln和酵母Ke共培養時存在互作關系，對兩類菌的生長均有促進作用。

2.2 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發酵過程中微生物數量變化

單菌和混菌發酵制作蘿卜泡菜過程中微生物數量變化情況結果見圖2。

圖2 單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中微生物變化情況Fig. 2 Changes of microorganisms in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖2A和B可知，單菌組和混菌組在蘿卜泡菜發酵過程中細菌和乳酸菌數量隨著發酵時間的增加差異逐漸減小。發酵第7天時，Lp+Ln+Ke組的乳酸菌數量最高，其次是Ke單菌組，并且Lp+Ke組的乳酸菌數量比Lp單菌組的乳酸菌數量高，同時，Lp+Ln+Ke組和Lp+Ke組發酵過程中乳酸菌的數量均高于乳酸菌單菌發酵蘿卜泡菜中的乳酸菌數量，可以得出乳酸菌Lp與Ln和酵母菌Ke的混合發酵有利于促進發酵體系中乳酸菌的生長。這可能是由于酵母菌代謝產生的CO2、氨基酸和維生素等物質能刺激乳酸菌的生長[19]。

由圖2C可知，乳酸菌單菌組和CK組的酵母菌數量一直呈下降趨勢，且在整個發酵過程中均與接種酵母組的蘿卜泡菜中酵母菌數量存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，混菌接種與酵母菌單菌接種發酵體系之間的酵母菌數量在發酵第3天也存在顯著性差異（P＜0.05），且發酵第7天時，混菌接種蘿卜泡菜組中的酵母菌數量較酵母菌單菌接種組更高，表明乳酸菌Ln和Lp對酵母菌Ke的生長起到一定促進作用。研究表明，乳酸菌代謝產生的乳酸過多會抑制酵母生長，但適量的乳酸能螯合陽離子，減輕體系中陽離子對酵母菌細胞的影響[20-21]。

2.3 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發酵過程中還原糖含量變化

還原糖是泡菜中的微生物的主要碳源物質，單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中的還原糖含量變化見圖3。

圖3 單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中還原糖變化情況Fig.3 Changes of reducing sugar contents in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖3可知，Lp、Ke組和其他混菌組發酵蘿卜泡菜在發酵周期內還原糖含量都呈現先增加后減少的趨勢。而Ln和CK組還原糖含量在發酵周期中的變化不同于其它組別，在0～5 d無明顯變化，5～7 d呈增加趨勢，表明CK組和Ln組中的微生物對還原糖的消耗速度小于紅皮蘿卜中還原糖的溶出速度，此現象和Ln的生長速率有關（見圖1）。Lp組在3～5 d過程中還原糖的增加速度高于其他組，此現象結合Lp的生長曲線和產酸情況可以說明Lp在蘿卜泡菜發酵體系中3～5 d時生長較快，期間代謝產物如乳酸、纖維素酶積累量增加，對植物細胞壁破壞更快，植物中的還原糖溶出速度也更快[22]。但乳酸菌相較于酵母菌對還原糖的利用更慢，5～7 d還原糖的降低速度明顯含有酵母Ke組的要更快，且發酵第7天時Lp+Ln+Ke組、Ln+Ke組和Ke組的還原糖基本消耗殆，與CK組、Ln組和Lp組存在顯著性差異（P＜0.05）。相比于單菌發酵，混合菌發酵蘿卜泡菜消耗還原糖速率更快，表明混菌發酵更能提高蘿卜泡菜的發酵速率。

2.4 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發酵過程中pH和總酸變化

pH和總酸反映的是泡菜發酵過程中的產酸情況和乳酸菌的產酸能力，單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中pH和總酸（以乳酸計）含量的變化情況見圖4。

圖4 單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中pH（A）和總酸（B）變化情況Fig. 4 Changes of pH (A) and total acid (B) in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖4A可知，各處理組下蘿卜泡菜的pH值均隨著發酵的進行而逐漸降低。其中Lp+Ln+Ke組在7個處理組中表現出了最快的產酸進程，發酵3 d后pH降至4.50以下，發酵第7天時蘿卜泡菜產品的pH為3.53，表現出了較好的發酵產酸效果。由圖4B可知，7個組的蘿卜泡菜在整個發酵周期中的總酸含量都呈逐漸上升的趨勢，與pH的變化趨勢相符。在發酵3 d后，總酸的增加趨勢表現出了差異，其中含有Lp的發酵組總酸含量普遍較高，說明植物乳桿菌為發酵蘿卜泡菜中主要的產酸菌之一。同時，三個混菌組在發酵第7天時的總酸含量普遍高于單菌組及CK組，其中產酸效果最好的體系是Lp+Ln+Ke混菌體系，在第7天時總酸含量達0.31 mL/100 mL，達到較佳的即食效果[23]。結果說明，兩菌、三菌混合發酵可以協同產酸，提高了蘿卜泡菜的發酵進程。

2.5 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化

亞硝酸鹽是泡菜中的安全指標之一，單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中亞硝酸鹽含量的變化情況見圖5。由圖5可知，CK組在發酵第3天出現亞硝峰含量高達12.34 mg/kg，雖低于國家對醬腌菜中亞硝酸鹽的限量要求（不超過20 mg/kg），但顯著高于其他組（P＜0.05）。Ln+Ke組和Lp+Ke組在發酵第1天出現亞硝峰，含量略高于其余單菌組和三菌混合組，隨后與其余接菌組的亞硝酸鹽含量接近，且在發酵第5天之后所有接菌組的亞硝酸鹽含量基本都接近于0。乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的基因[24]，因此接種發酵可在5 d后可獲得幾乎不含亞硝酸鹽的蘿卜泡菜。

圖5 單菌和混菌發酵蘿卜泡菜過程中亞硝酸鹽含量變化情況Fig. 5 Changes of nitrite contents in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

2.6 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發酵終點揮發性風味物質組成

揮發性風味物質是泡菜風味的重要組成部分，為了探究乳酸菌與酵母互作發酵對蘿卜泡菜揮發性風味物質的影響，利用HS-SPME-GC-MS對7組處理發酵第7天的蘿卜泡菜揮發性風味物質進行檢測，共檢測到包括酯類、醇類、醚類、酸類、醛酮類等109種風味物質。以化合物含量指標為變量X，不同發酵組樣本作為分類變量Y，對發酵第7天的7組樣品進行OPLS-DA。結合化合物在圖中的分布差異以及HCA能夠獲得不同組中的差異代謝物[25]，結果見圖6。

圖6 單菌和混菌發酵蘿卜泡菜第7天的揮發性風味物質正交偏最小二乘法判別分析（A）和層次聚類分析（B）Fig. 6 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (A) and hierarchical clustering (B) of volatile flavor compounds of radish Paocai fermented by single and mixed strains on the 7th day

模型中R2和Q2分別代表模型可解釋的變量和可預測度，可對模型的優劣進行判別，理論上擬合優度（R2）、預測優度（Q2）數值越接近1，說明模型越好，越低說明模型的擬合準確性越差。通常情況下，R2、Q2高于0.5較好，高于0.4可接受，Q2在Y軸的截距小于0.05，可認為模型沒有出現過擬合。

由圖6A可知，模型對X軸的解釋度（R2X）為0.734、模型對Y軸的解釋度（R2Y）為0.97、Q2（cum）為0.804，置換檢驗結果顯示R2=0.508，Q2=-0.764，表明該模型穩定可靠[25]。圖6A中的CK組和單乳酸菌組的風味物質主要集中在醛酮類物質和烴類物質周圍，其中三芥子酸甘油酯和二甲基三硫為十字花科蔬菜（如紅皮蘿卜）的特征揮發性風味物質，表明發酵進程緩慢，發酵不完全[26]。單乳酸菌組與含有酵母菌的發酵組的風味輪廓則表現出明顯差異，含有酵母菌的發酵組風味物質種類更加豐富。且圖6A和圖6B中的Ke組和Ln+Ke組均與第三主成分呈正相關且聚類在第二分支，風味成分結構更相似，周圍含有具有強烈芳香氣味的正辛醇和具有水果香味的庚醛，這可能與酵母菌發酵代謝、蛋白質分解及氨基酸的代謝有關[27]，但依舊含有紅皮蘿卜本身的辛辣刺激風味物質，如二甲基二硫等[26]。Lp+Ke組和Lp+Ln+Ke組的揮發性風味物質在HCA中分離于其他組，物質主要集合在第二象限，有3-己烯-1-醇、異戊醇、苯乙醇、正丁酸、硫代乙酸甲酯、丁酸甲硫醇酯等，這可能由于Lp代謝更快，與Ke互作會促進酸和醇類物質生成酯類物質，從而提升蘿卜泡菜的復合香氣。值得注意的是乙酸乙酯僅在Lp+Ln+Ke組中檢測到，表明多乳酸菌與酵母菌互作更有利于酯類揮發性風味物質的產生。由圖6B可知，CK組、Ln組和Lp組在HCA中都在第一分支，揮發性成分特征趨于一致。研究表明相較于單菌種，多菌種微生物群落具有更廣泛的代謝靈活性，菌種間的溝通和交流增強能更有效地催化許多復雜代謝過程，對待外界環境的擾動具有更高的抵抗性[28-29]。

3 結論

本實驗采用鹽水發酵蘿卜作為對照組，分別接種Lp、Ln和Ke單菌，Lp+Ke、Ln+Ke、Lp+Ln+Ke混菌作為菌種發酵蘿卜泡菜，并在發酵過程中測定不同接種發酵方式下蘿卜泡菜的微生物數量、理化指標以及發酵終點的揮發性風味物質。單菌和混菌接種發酵蘿卜泡菜在發酵過程中，經不同微生物群落的代謝作用，理化指標的變化存在顯著差異，主要體現在混菌發酵的糖代謝速率和產酸速率更快。在揮發性風味物質方面，混菌發酵可以豐富蘿卜泡菜的風味化合物組成，其中乙酸乙酯僅在Lp+Ln+Ke組中檢測到。多乳酸菌與酵母菌互作發酵，增加了揮發性風味物質的種類，可以提高蘿卜泡菜的復合香。酵母和不同的乳酸菌混合發酵表現出的理化性質以及風味代謝上均有差異。OPLS-DA和HCA結果表明，可以將不同菌種發酵的泡菜進行有效區分。因此，酵母菌和多乳酸菌互作體系具有發酵產酸速度快、風味成分更豐富的優勢，為提升泡菜品質提供一定的理論依據。