模糊數學評價結合響應面法優化黃芪黨參保健米酒發酵工藝及抗氧化性

朱 玲，游新俠，胡航偉

（鄭州科技學院 食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064）

米酒又稱酒釀、甜酒，舊時叫“醴”，我國米酒釀造歷史至少長達5 000年[1]。米酒含有多種氨基酸、生物活性肽、有機酸、功能性低聚糖、微量元素等，具有較高的營養價值以及活血通脈、防病御寒、滋補益氣、健脾開胃等保健功效[2]。傳統米酒使用原料及口感單一，難以滿足消費者對米酒多種口味和營養保健作用的需求[3]。為了豐富米酒營養和保健價值，近些年研究者開發了多款新型米酒，如花卉米酒[4]、蘋果黑枸杞復合米酒[5]、獼猴桃米酒[6]、金蟾花米酒[7]、銀杏米酒[8]等。功能性米酒不僅具有更豐富的口感，也更益于人類健康，其已逐漸成為如今米酒的發展趨勢，具有廣泛發展潛力與市場前景。

米酒主要原料為糯米，糯米含有鈣、磷、鐵、脂肪、維生素B1、維生素B2及煙酸等豐富的營養物質[9]。黃芪（Astragalus memeranaceusFisch.）屬藥食同源物質，含有豐富的黃芪多糖、皂苷、黃酮等有效成分，此外，還含有多種氨基酸、維生素、葉酸、核黃素等[10-11]，具有補氣升陽、抗血栓、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等功效[12-15]。楊小敏等[16-17]研究發現，黃芪皂苷可增強巨噬細胞的免疫作用，對預防糖尿病、腎病具有一定的保護作用；齊彥爽等[18]研究發現，黃芪中總黃酮具有抑制腫瘤的作用。黨參（Codonopsis pilosula）也為藥食同源類物質，其主要含有黨參苷、黨參多糖、黃酮類、植物甾醇、黃芪皂苷、生物堿及其他微量元素等[19]，具有增強免疫力、抗癌、增強機體造血功能、降低血糖、調節腸道菌群、抗氧化等作用[20-23]。因此，在傳統米酒釀造基礎上添加黃芪和黨參提取液，既能改善米酒的口感，又能提升米酒的營養價值和保健功能以及產品競爭力。

本研究以糯米為主要原料，添加黃芪和黨參提取液，以甜酒曲為發酵劑，開發一款保健型米酒，通過單因素試驗、模糊數學評價結合響應面法優化黃芪黨參保健米酒發酵工藝，并對其抗氧化活性進行研究，以期為糯米和藥食同源食材的深加工及豐富米酒市場開辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

糯米、甜酒曲、黃芪、黨參：市售；酚酞、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、過硫酸鉀（均為分析純）、沒食子酸標準品、蘆丁標準品（純度均＞98%）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97%）、2,2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）（純度≥98%）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；MRS培養基、MC培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NJR-N5打漿機：南極人廚房家電廠；WFF-26A食品發酵箱：廣州市泓鋒食品機械有限公司；pH-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；LAL1T酒精計：青島拓科儀器有限公司；TDL-50B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-4800H型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃芪黨參保健米酒發酵工藝流程及操作要點[24]

洗米→浸米→蒸米→攤晾→拌曲搭窩→發酵→脫醇→灌裝→殺菌→冷卻→成品

操作要點：

原料預處理：挑選優質糯米（要求顆粒飽滿、無異物）淘洗2～3次，再將糯米浸泡于清水至用手容易捏碎為止；選取優質黃芪、黨參，去除其中雜質，分別按照文獻[25-26]制備黃芪、黨參提取液，冷藏備用。

蒸制：將浸泡好的糯米置于蒸鍋中，蒸制30 min，至米粒飽滿膨脹、顆粒松散、質地柔軟即可。

攤晾：倒出熟糯米置于已消毒的盆中，冷卻至30 ℃左右。

拌曲搭窩：取一定質量的糯米，并以糯米質量為基準加入2%黃芪提取液、5%黨參提取液及0.4%甜酒曲[27]，之后加入純凈水80%[28]，最后將料液攪拌均勻置于發酵容器中。

發酵：將發酵容器置于恒溫發酵箱中，30 ℃恒溫發酵48 h[29]。

脫醇：將發酵好的米酒置于旋轉蒸發儀中，控制蒸發溫度為80 ℃，蒸發至接收瓶內不再有液體流出為止。

灌裝、殺菌、冷卻：參考艾曉莉等[29]滅菌方法，將米酒灌裝于玻璃罐中，密封，于75 ℃溫度下殺菌30 min，冷卻，得到黃芪黨參保健米酒成品。

1.3.2 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化單因素試驗

以不溶性固形物、總酸、還原糖、酒精度、感官評分為評價指標，采用單因素輪換法分別考察發酵時間（40 h、44 h、48 h、52 h、56 h）、酒曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、黃芪提取液添加量（0、2%、4%、6%、8%）、黨參提取液添加量（0、5%、10%、15%、20%）對黃芪黨參保健米酒品質的影響。

1.3.3 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化響應面試驗

以單因素試驗結果為依據，選取對結果影響較大的發酵時間（A）、酒曲添加量（B）、黨參提取液加量（C）為自變量，選用模糊數學評分為響應值（Y），采用Design-Expert 8.0.6.1設計3因素3水平的響應面試驗，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

1.3.4 黃芪黨參保健米酒的感官評價

選取10人組成感官評定小組，對所得黃芪黨參保健米酒的色澤、氣味、滋味、組織狀態四方面進行評價，總分100分，具體感官評價標準見表2[30]。

表2 黃芪黨參保健米酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

1.3.5 模糊數學評價法

（1）因素集及評語集的建立

參考賈慶超等[31]模糊數學評價模型建立方法，以滋味（M1）、氣味（M2）、色澤（M3）和組織狀態（M4）4個感官評價指標組成黃芪黨參保健米酒的評價因素集，即M=（M1，M2，M3，M4）。以優（N1）、良（N2）、中（N3）、差（N4）組成對黃芪黨參保健米酒每個因素的評語集，即N=（N1，N2，N3，N4）。

（2）權重集的確定

對影響黃芪黨參保健米酒的因素項目重要性進行打分，重要因素得1分，不重要的因素得0分，統計結果除以100即為權重，權重分布見表3。

表3 各評價因素的權重分布Tab 3 Weight distribution of evaluation factors

根據表3確定權重集為P=（P1，P2，P3，P4）=（0.35，0.30，0.25，0.10），其中P1、P2、P3、P4分別為黃芪黨參保健米酒滋味、氣味、色澤、組織狀態的權重。

（3）模糊矩陣的建立及評價結果的確定

按照黃芪黨參保健米酒的滋味、氣味、色澤、組織狀態這4個因素進行感官評價，統計各因素在各等級中的票數，然后根據所得票數得出感官評價模糊關系矩陣。

其中，k=1，2，3，4，5，…n為樣品編號，每一行代表每一個指標的評價數據結果。根據黃芪黨參保健米酒的模糊數學評價模型Qk=P×Mk得到第k號樣品的感官評價集，將評價集Qk與等級分數優（95）、良（85）、中（75）、差（65）相乘后求和得模糊數學評分Y。

1.3.6 抗氧化活性成分含量及抗氧化活性的測定

總黃酮及多酚含量測定：參考胡佳慧等[32]的方法；DPPH自由基清除能力的測定：參考汪濤等[33]的方法；ABTS自由基清除能力的測定：參考閆世芳等[34]的方法。

1.3.7 理化指標的檢測

總酸含量的測定：參考GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[35]第一法；還原糖含量的測定：參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》[36]第一法；酒精度的測定：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度測定》[37]第二法酒精計法；pH的測定：使用pH計；可溶性固形物含量的測定：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[38]。

1.3.8 微生物指標的測定

菌落總數的測定：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[39]；大腸菌群的測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[40]。

1.3.9 數據分析及處理

每個試驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。利用SPSS 21.0軟件和Origin 8.0對數據進行處理，利用Design-Expert 8.0.6.1對試驗進行設計并進行數據建模處理。

2 結果與分析

2.1 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 發酵時間對黃芪黨參保健米酒品質的影響

由圖1可知，隨著發酵時間在40～56 h內增加，酒精度、總酸及還原糖含量呈上升趨勢，不溶性固形物含量呈緩慢下降趨勢，感官評分呈先升高后下降的趨勢。當發酵時間為48 h時，感官評分最高，為82分，此時酒精度為4.03%vol，不溶性固形物含量為40.2%，總酸含量為4.12 g/L，還原糖含量為25.0 g/100 g。分析原因可能是，米酒發酵時間過短，淀粉未能充分轉化為糖類物質，葡萄糖也大多未轉化為酒精，酒精度過低，未能體現米酒原有的發酵香味；發酵時間過長，較多的葡萄糖轉化為乙醇，酒精度較高，導致米酒酒精味過重，影響酒液口感[40]。因此，確定最適發酵時間為48 h。

圖1 發酵時間對黃芪黨參保健米酒品質的影響Fig.1 Effect of fermentation time on quality of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

2.1.2 酒曲添加量對黃芪黨參保健米酒品質品質的影響

由圖2可知，隨著酒曲添加量在0.2%～0.6%范圍內增加，酒精度、總酸及還原糖含量整體呈上升趨勢，不溶性固形物含量呈緩慢下降趨勢，感官評分呈先升高后下降的趨勢。當酒曲添加量為0.3%時，感官評分最高，為83分，此時酒精度為4.05%vol，不溶性固形物含量為40.5%，總酸含量為4.06 g/L，還原糖含量為24.5 g/100 g。分析原因可能是，酒曲添加量過低，米酒發酵香味較淡，不能使糯米充分發酵，糖度低，酸甜味不明顯；酒曲添加量過高，糯米發酵反應過快，酒精度偏高，酒味濃重，感官評分降低[27，30]。因此，確定酒曲最適添加量為0.3%。

圖2 酒曲添加量對黃芪黨參保健米酒品質的影響Fig. 2 Effect of koji addition on quality of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

2.1.3 黃芪提取液添加量對黃芪黨參保健米酒品質的影響

由圖3可知，隨著黃芪提取液添加量在0～8%范圍內的增加，還原糖含量逐漸增加，酒精度、總酸及不溶性固形物含量無明顯變化，感官評分呈先升高后降低的趨勢。當黃芪提取液添加量為4%時，感官評分最高，為84分，此時酒精度為4.15%vol，不溶性固形物含量為38.0%，總酸含量為4.06 g/L，還原糖含量為25.3 g/100 g。分析原因可能是，黃芪提取液添加量過低，黃芪特有的風味不明顯；但黃芪提取液添加量過大時，黃芪多糖的存在可能影響了米酒本身的品質與口感，導致米酒口感發澀，感官評分降低[27]。因此，確定黃芪提取液最適添加量為4%。

圖3 黃芪提取液添加量對黃芪黨參保健米酒品質的影響Fig. 3 Effect of Astragalus memeranaceus extract addition on quality of A. memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

2.1.4 黨參提取液添加量對黃芪黨參保健米酒品質的影響

由圖4可知，隨著黨參提取液添加量在0～20%范圍內增加，還原糖含量逐漸增加，酒精度、總酸及不溶性固形物含量無明顯變化，感官評分呈先升高后降低的趨勢；當黨參提取液添加量為15%時，感官評分最高，為87分，此時，酒精度為4.12%vol，不溶性固形物含量為38.8%，總酸含量為4.13 g/L，還原糖含量為25.9 g/100 g。分析原因可能是，黨參提取液添加量過低時，黨參香味和滋味不足，感官評分較低；但黨參提取液添加量過高時，因為低聚糖、多糖是黨參中主要成分之一，米酒甜味增加，同時黨參的草藥味較明顯，米酒口感不協調[41]。因此，確定黨參提取液最適添加量為15%。

圖4 黨參提取液添加量對黃芪黨參保健米酒品質的影響Fig. 4 Effect of Codonopsis pilosula extract addition on quality of Astragalus memeranaceus and C. pilosula health rice wine

2.2 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 模糊數學評價

根據單因素試驗結果，選取發酵時間（A）、酒曲添加量（B）、黨參提取液添加量（C）對感官評分影響較大的因素為自變量，以模糊數學評分（Y）為響應值，采用軟件Design-Expert 8.0.6.1設計3因素3水平的響應面試驗，共17組試驗，試驗組各指標的投票結果見表4。

表4 黃芪黨參保健米酒感官評價票數分布Table 4 Distribution of sensory evaluation votes of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

依據表4中的數據建立模糊評價矩陣，取每個因素得票數除以參與感官評價的總人數10，即可得到各個模糊矩陣M1～M17。如：1號試驗產品滋味評價為“優”的人數為2，評價為“良”的人數為2，評價為“中”的人數為1，評價為“差”的人數為5，因此M滋味=（0.2，0.2，0.1，0.5），同理可得M氣味=（0.1，0.1，0.1，0.7），M色澤=（0.1，0.1，0.1，0.7），M組織狀態=（0.1，0.1，0.1，0.7），通過此方法可得矩陣M1；

同理可得M2～M17。

權重集P=（0.35，0.30，0.25，0.10），依據矩陣相乘原理，得1號試驗的模糊關系評價集Q1=P×M1=（0.135，0.135，0.10，0.63），將與賦予評價集Q1與等級分數優（95）、良（85）、中（75）、差（65）相乘后求和，即為1號試驗的感官評分Y1=0.135×95+0.135×85+0.1×75+0.63×65=72.75，同理可得出2～17號試驗號感官得分Y2～Y17。

2.2.2 響應面試驗結果

響應面試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。

表5 黃芪黨參保健米酒發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface tests of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6.1對表5結果進行多元回歸擬合分析，得到二次多項回歸方程：Y=90.92+1.42A+0.87B+0.47C+0.36AB+1.35AC-0.94BC-10.10A2-6.06B2-3.0C2

由表6可知，模型的F值為63.43，P值＜0.000 1，極顯著；失擬項P值=0.444 7＞0.05，不顯著，說明試驗模型與試驗結果擬合度高。決定系數R2=0.987 9，校正決定系數R2adj=0.972 3，說明此回歸模型與試驗數據擬合程度高度重合，可以很好地反映試驗真實值，因此，可用于黃芪黨參保健米酒的工藝優化預測及分析。由P值可知，交互項AC對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分影響顯著（P＜0.05），一次項A、二次項A2、B2、C2對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，三個影響因素對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分的影響程度大小為：發酵時間（A）＞酒曲添加量（B）＞黨參提取液添加量（C）。

2.2.3 響應面試驗交互作用分析

發酵時間與黨參提取液添加量間交互作用對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分影響的響應曲面及等高線見圖5。

圖5 發酵時間與黨參提取液添加量間交互作用對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分影響的響應面及等高線圖Fig. 5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between fermentation time and Codonopsis pilosula extract on fuzzy mathematical score of Astragalus memeranaceus and C. pilosula health rice wine

由圖5可知，發酵時間（A）與黨參提取液添加量（C）間交互作用對黃芪黨參保健米酒模糊數學評分影響的響應曲面呈凸形，等高線為橢圓形，說明交互作用明顯[42]，與方差分析結果一致。

2.2.4 響應面試驗分析結果

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對二次多項回歸方程求解，得出黃芪黨參保健米酒的最佳發酵工藝為發酵時間48.2 h，酒曲添加量0.31%，黨參提取液添加量15.4%。在此條件下，模糊數學評分理論值為91.3分。考慮到實際可操作性，將最優發酵工藝條件調整為發酵時間48 h、酒曲添加量0.3%、黨參提取液添加量15%。在此條件下進行3次平行驗證試驗，其模糊數學評分平均實際值為90.8分，與預測值相差不大，表明采用響應面法優化得到的黃芪黨參保健米酒工藝條件可行。

2.3 黃芪黨參保健米酒產品品質分析

2.3.1 理化及微生物指標

對最佳工藝條件下制作的黃芪黨參保健米酒進行理化指標和微生物指標檢測，結果見表7。

表7 黃芪黨參保健米酒的理化指標及微生物指標Table 7 Physicochemical indexes and microbial indexes of Astragalus memeranaceus and Codonopsis pilosula health rice wine

由表7可知，黃芪黨參保健米酒的總酸、還原糖含量、酒精度、不溶性固形物含量、pH、可溶性固形物含量分別為0.212 g/100 g、26.21 g/100 g、0.39%vol、39.70 g/100 g、4.52、15.70 g/100 g，大腸菌群未檢出，菌落總數為21 CFU/g，其理化指標及微生物指標均符合農業行業標準NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》[43]標準規定。

2.3.2 抗氧化成分及抗氧化活性檢測結果

通過測定黃芪黨參保健米酒的總黃酮、多酚含量及其對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力評價其抗氧化活性，結果表明，黃芪黨參保健米酒中的總黃酮、多酚的含量分別為217.2 mg/L、68.2 mg/L，與同類產品山藥米酒比較[32]，黃芪黨參保健米酒中總黃酮、多酚含量均處于較高水平。黃芪黨參保健米酒對DPPH自由基、ABTS自由基的清除率分別為89.8%、83.7%，對DPPH自由基、ABTS自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為158.9 mg/L、170.5 mg/L，與同類產品蕨根米酒[44]相比，黃芪黨參保健米酒對DPPH、ABTS自由基的清除率較高。

3 結論

本研究以糯米、黃芪、黨參、酒曲為主要原料，開發一款具有保健作用的米酒，通過單因素和模糊數學結合響應面法優化確定黃芪黨參保健米酒的最佳發酵工藝為：以糯米質量為基準，水添加量80%，發酵溫度30 ℃、發酵時間48 h、酒曲添加量0.3%、黃芪提取液添加量為4%、黨參提取液添加量為15%。在此優化工藝條件下，黃芪黨參保健米酒的感官評分最高（90.8分），呈淡黃色，酸甜可口，入口含有米酒發酵香味，同時具有黃芪、黨參淡淡的香氣。經脫醇處理，該米酒的酒精度為0.39%vol，總酸含量為0.212 g/100 g，還原糖含量為26.21 g/100 g，pH為4.52，可溶性固形物含量為15.7 g/100 g，不溶性固形物含量為39.7 g/100 g，總黃酮含量為217.2 mg/L，多酚含量為68.2 mg/L，大腸菌群未檢出，菌落總數為21 CFU/g，其理化及微生物指標符合相關標準要求。該米酒具有較好的抗氧化性，對DPPH、ABTS自由基的半抑制濃度（IC50）值分別為158.9 mg/L、170.5 mg/L。本研究為藥食同源食材的開發利用提供了新的方向，為豐富米酒產品品種，提高其保健作用具有重要的指導意義。