醬香蜂蜜酒發酵工藝優化及其品質分析

陳 娟，喻仕瑞*，鄭華艷，姬 莉，宋丹丹，王欣甜，李 梅，張翠紅

（1.茅臺學院 食品科學與工程系，貴州 遵義 564501；2.貴州省保健酒釀造技術工程研究中心，貴州 遵義 564502；3.茅臺學院 特色食品資源利用人才基地，貴州 遵義 564502）

醬香型白酒糟是醬香型白酒生產過程中出現的副產物[1]，白酒酒糟中含有豐富的蛋白質、脂肪、磷、鉀、維生素及其他微量營養成分[2]，直接丟棄酒糟造成極大浪費。2022年我國醬香型白酒糟產量約達300萬t[3]，目前對酒糟主要用于生產飼料、沼氣和堆肥[4]，另外高價值成分提取也是研究熱點，如具有抗氧化活性的多糖[5]、功能肽[6]、多酚[7]等物質。七輪次酒糟也可生產翻砂酒，即第八輪次酒，但產量少、風味不佳，苦味、焦糊味重，一般較少用于生產成品酒，多用作調味酒[8]。利用七輪次酒糟繼續發酵產酒的研究較少，加入蜂蜜發酵的研究也未見報道。

蜂蜜是一種藥食同源的食品，主要含有葡萄糖和果糖[9]，還含有豐富的酶類、有機酸、維生素、蛋白質等營養成分，風味物質也特別豐富[10]。此外，蜂蜜中含有豐富的多酚[11-13]，是其保健功效的重要保障[14]，具有抗氧化[15]、抗炎[16]、抗菌[17]、預防結腸炎[18]、保護酒精性肝損傷[19]、改善心血管健康[20]等功效。蜂蜜釀酒已有悠久的歷史[21]，既保留了蜂蜜營養成分和保健功能，經發酵后其抗氧化活性還得到一定提高[22]。將蜂蜜加入酒糟一起發酵，既可補充酒糟中消耗的糖類，為酵母菌的生長提供必要條件，同時增加活性成分，賦予產品一定的保健功能。

本研究以醬香型白酒七輪次酒糟和蜂蜜為原料釀制醬香蜂蜜酒，以多酚含量及感官評分為評價指標，通過單因素和響應面試驗對釀造工藝條件進行優化，對其體外抗氧化活性進行評價，并以未添加蜂蜜酒樣為對照，對其理化指標、揮發性風味物質、無機元素含量及抗氧化活性進行對比分析，旨在生產一款具有醬香風味的蜂蜜保健酒，既實現醬香型白酒酒糟的綜合利用，又能滿足消費者對新型風味健康酒的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒第七輪次酒糟：仁懷市某酒廠；蜂蜜（五味子為主的百花蜜）：貴州綏陽寬闊水；DV10酵母、RC212酵母、K1酵母、EC1118酵母：加拿大拉曼公司；葡萄酒·果酒活性干酵母：安琪酵母股份公司；沒食子酸標準品（純度＞98%）：中國食品藥品檢定研究院；福林酚（分析純）、1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothia-zoline-6-sulfonic acid），ABTS）：上海滬試試驗室器材股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DR403精密酒精計：深圳市雅戈科技有限公司；FA2204電子天平：上海菁海儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋：江蘇中大儀器科技有限公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鄭州長城科技有限公司；1530 MμLtiskan SkyHigh全光譜酶標儀：美國Thermo Scientific公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：北京科偉永興儀器有限公司；Agilent 7900安捷倫電感耦合-等離子體質譜（inductive coupled plasma-mass spectrometer，ICP-MS）儀、Agilent GC 7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫公司；Mars6微波消解儀：美國CEM儀器有限公司；Trace 1310 GC-ISQ7000氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 醬香蜂蜜酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

稱取一定量醬香型白酒第七輪次酒糟，加入12%蜂蜜后充分攪拌混勻，加入0.046%已活化的活性干酵母（稱取適量酵母于試管中，加入少量水在37 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min），充分混勻后，裝入瓶中使用保鮮膜密封。將裝好的樣品放至28 ℃恒溫箱中發酵17 d，再將酒樣于60 ℃蒸餾40 min，即得到醬香蜂蜜酒。

1.3.2 醬香蜂蜜酒發酵工藝優化

單因素試驗：固定發酵條件為蜂蜜添加量12%，酵母添加量0.046%，發酵時間17 d，發酵溫度28 ℃，以多酚含量為主要評價指標，感官評分為輔助評價指標，分別考察蜂蜜添加量（6%、9%、12%、15%、18%）；酵母添加量（0.032%、0.039%、0.046%、0.053%、0.060%）；發酵時間（13 d、15 d、17 d、19 d、21 d）；發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）對醬香蜂蜜酒發酵效果的影響。

響應面優化試驗：在單因素試驗結果的基礎上，選擇酵母添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為自變量，醬香蜂蜜酒中多酚含量（Y）為響應值，進行3因素3水平響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 醬香蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of sauce-flavor mead

1.3.3 醬香蜂蜜酒感官評價

感官評價小組由20名具有感官評價經驗的食品專業人員組成，男女各占一半，參考中華人民共和國輕工行業標準QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，結合醬香蜂蜜酒的特點，分別從色澤、香氣、口感、風格4個方面進行感官評價，滿分為100分，醬香蜂蜜酒感官評價標準見表2。

表2 醬香蜂蜜酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of sauce-flavor mead

1.3.4 醬香蜂蜜酒理化指標分析

（1）基本理化指標的測定

酒精度的測定：采用精密酒精計；總酸的測定：采用GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中酸堿指示劑滴定法；總酯、固形物的測定：按照GB 10345—2022《白酒分析方法》，總酯的測定：采用指示劑法，固形物的測定：采用稱量法。

（2）多酚含量的測定

采用福林酚法測定多酚含量[23]，略有改動。配制20%碳酸鈉溶液備用。吸取酒樣40 μL加入酶標板內，再加入40 μL福林酚和120 μL 20%碳酸鈉溶液，避光反應15 min后，在波長765 nm處測定其吸光度值。配制20%碳酸鈉溶液備用，吸取酒樣40 μL加入酶標板內，再加入40 μL福林酚和120 μL 20%碳酸鈉溶液，避光反應15 min后，在波長765nm處測定吸光度值。分別配制質量濃度為1mg/L、2mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L的沒食子酸標準溶液，按上述方法測定吸光度值制作標準曲線，其標準曲線回歸方程為y=0.038 7x-0.004 7，相關系數R2=0.999 1。

（3）甲醇含量的測定

使用氣相色譜（GC）儀檢測醬香蜂蜜酒中甲醇的含量。

GC條件：使用P/N：19091J-413毛細管柱（30 m×320μm×0.25 mm），自動進樣，進樣量為1 μL，壓力為4.955 1 psi。色譜柱的升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，之后以5 ℃/min升到190 ℃，保持2 min，最后運行30 min。設定進樣口的溫度為220 ℃，色譜柱流量為1.0 mL/min，載氣為氫氣（H2）與氮氣（N2），氫氣（H2）流量為30.0 mL/min，尾吹氣（N2）（組合）流量為25.0 mL/min。

（4）無機元素的測定

使用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）儀檢測醬香蜂蜜酒中無機元素的含量。ICP-MS工作參數為He模式，射頻功率1550W；載氣為氬（Ar），流量為1.01L/min；等離子氣流量為15.0L/min；霧化室采用石英霧化室，霧化室溫度2 ℃；碰撞氣（He）流量為2.6 mL/min，采用鎳采樣錐和鎳截取錐。

1.3.5 醬香蜂蜜酒抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除能力

參考楊琦等[24]的方法，在試管中加入1.0mL酒樣和1.0mL的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后靜置，30 min后吸取試樣加入比色皿中，使用分光光度計在波長517 nm處測吸光度值。使用蒸餾水將酒樣稀釋為0.8 mL/mL、0.6 mL/mL、0.4 mL/mL、0.2 mL/mL，測定不同濃度酒樣的DPPH自由基清除能力，計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。DPPH自由基清除率（A1）計算公式如下：

式中：Ax為1 mL待測酒樣加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光度值；Ay為1 mL酒樣加1 mL溶劑的吸光度值；A0為1 mL DPPH乙醇溶液加1 mL溶劑的吸光度值。

（2）ABTS自由基清除能力

參考成柯等[25]的方法，在試管中加入0.2 mL的7.4 mmol/L ABTS溶液和0.2 mL的2.6 mmol/L K2S2O8溶液，混勻后置于暗處反應12 h，再用體積分數95%乙醇進行稀釋，使該混合液（工作液）在波長734 nm處吸光度值為0.70。吸取0.2 mL酒樣與0.8 mL工作液混勻后靜置6～8 min，吸取試樣加入比色皿中，使用分光光度計測定波長734 nm處待測樣品的吸光度值，以體積分數95%乙醇作為對照，計算IC50值。ABTS自由基清除率（A2）計算公式如下：

式中：A0為待測樣品的吸光度值；Ax為體積分數95%乙醇（對照）的吸光度值。

（3）羥自由基清除能力[26]

吸取2 mL的6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、待測酒樣，依次加入試管中，搖勻后靜置10 min，再加入6mmol/L水楊酸溶液2mL，靜置30min，吸取試樣加入比色皿中，使用分光光度計在波長510nm處測定吸光度值，以蒸餾水作為對照，計算IC50值。羥自由基清除率（A3）計算公式如下：

式中：Ax為待測樣品的吸光度值；A0為蒸餾水（對照）的吸光度值。

1.3.6 揮發性風味成分的測定

使用氣相色譜-質譜聯用儀對揮發性風味物質進行檢測。

氣相色譜條件：TG-WAXMS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為初始溫度35 ℃保持5 min，5 ℃/min升至220 ℃保持1 min；進樣口溫度230 ℃；進樣量0.5 μL；進樣方式為分流進樣，分流比20∶1；載氣為高純氦氣（He），流量1.0 mL/min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度280 ℃；接口溫度230 ℃；掃描模式為全掃描模式，掃描范圍為29～350 m/z；切割時間1.0 min。

定性定量方法：采用保留時間定性，用峰面積定量。

1.3.7 數據處理

試驗設3次重復，采用SPSS19.0進行數據處理與分析，統計檢驗水平P＜0.05則差異具有統計學意義。采用Design-Expert8.0.6軟件進行響應面試驗設計和數據分析。采用Origin 7.0進行擬合，計算清除率的IC50值。

2 結果與分析

2.1 醬香蜂蜜酒發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 蜂蜜添加量的確定

蜂蜜添加量對醬香蜂蜜酒品質的影響見圖1。由圖1可知，隨著蜂蜜添加量在6%～18%范圍內增加，醬香蜂蜜酒中多酚含量不斷增加，其原因是，蜂蜜是醬香蜂蜜酒中多酚的主要來源[27]。當蜂蜜添加量為6%～15%時，感官評分逐漸升高；當蜂蜜添加量為15%時，感官評分達到最大值，為90.1分，此時，多酚含量為2.68 mg/L；當蜂蜜添加量＞15%時，感官評分逐漸下降。隨著蜂蜜添加量增加，糖度過高會對酵母的發酵會產生不利影響，感官評分下降。因此，確定最適蜂蜜添加量為15%。

2.1.2 酵母添加量的確定

酵母添加量對醬香蜂蜜酒品質的影響見圖2。由圖2可知，隨著酵母添加量在0.032%～0.053%范圍內增加，醬香蜂蜜酒多酚含量及感官評分隨之升高；當酵母添加量為0.053%時，多酚含量和感官評分均達到最大，分別為2.71 mg/L、88.0分；當酵母添加量＞0.053%后，多酚含量和感官評分均呈下降趨勢。因此，確定最適酵母添加量為0.053%。

圖2 酵母添加量對醬香蜂蜜酒品質的影響Fig. 2 Effect of yeast addition on the quality of sauce-flavor mead

2.1.3 發酵時間的確定

發酵時間對醬香蜂蜜酒品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著發酵時間在13～17 d范圍內增加，醬香蜂蜜酒中多酚含量和感官評分均逐漸上升；當發酵時間為17 d時，多酚含量和感官評分均達到最大值，分別為2.59 mg/L、88.6分；當發酵時間＞17 d時，多酚含量和感官評分逐漸下降。因此，確定最適發酵時間為17d。

圖3 發酵時間對醬香蜂蜜酒品質的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on the quality of sauce-flavor mead

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度對醬香蜂蜜酒品質的影響見圖4。由圖4可知，當發酵溫度為24～26 ℃時，感官評分不斷升高；當發酵溫度為26 ℃時，感官評分達最大值，為86.5分；當發酵溫度高于26 ℃時，感官評分逐漸下降。隨著發酵溫度在24～28 ℃范圍內增加，醬香蜂蜜酒中多酚含量不斷增加；當發酵溫度為28 ℃時，多酚含量達到最高，為2.66 mg/L，此時，感官評分為84.6 分，當發酵溫度高于28 ℃時，多酚含量逐漸下降。因此，確定最適發酵溫度為28 ℃。

圖4 發酵溫度對醬香蜂蜜酒品質的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of sauce-flavor mead

2.2 醬香蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗結果及模型的建立及分析

在單因素的試驗基礎上，以醬香蜂蜜酒中多酚含量（Y）作為響應值，以酵母添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為自變量，進行3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗，響應面試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析見表4。

表3 醬香蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of sauce-flavor mead

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到多元二次響應面回歸模型方程為：

Y=3.44-0.08A+0.08B+0.14C-0.08AB+0.18AC-0.07BC-0.51A2-0.23B2-0.22C2

由表4可知，該模型極顯著（P值＜0.01）；失擬項不顯著（P值=0.375 7＞0.05），說明此回歸模型可充分反映酵母添加量、發酵時間、發酵溫度3個因素對醬香蜂蜜酒中多酚含量的影響；模型的決定系數R2=0.929 1，調整決定系數R2Adj=0.837 9，表明該模型相對可靠，可以預測92.91%的試驗結果，表明該模型擬合度較好。由P值可知，二次項A2對結果有極顯著影響（P＜0.01），一次項C、交互項AC、二次項B2、C2對結果有顯著影響（P＜0.05），其他因素沒有顯著影響（P＞0.05）；由F值可知，各因素對醬香蜂蜜酒中多酚含量的影響順序為：發酵溫度（C）＞酵母添加量（A）＞發酵時間（B）。

響應面圖較直觀地反應各因素之間的交互作用對醬香蜂蜜酒多酚含量的影響，響應面的曲線走勢越陡峭，表明影響越顯著，響應面的曲線越平緩，則影響作用越小[28]，等高線為橢圓形，則交互作用顯著，等高線為圓形，則交互作用不顯著[29]。各因素間交互作用對醬香蜂蜜酒多酚含量影響的響應曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素間交互作用對醬香蜂蜜酒多酚含量影響的響應面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction between various factors on polyphenol contents of sauce-flavor mead

由圖5可知，隨著酵母添加量的增加，醬香蜂蜜酒多酚含量呈升高后降低的趨勢，隨發酵溫度升高，多酚含量亦呈升高后降低的趨勢。AC交互形成的曲面坡度較大，且形成的等高線接近橢圓，說明交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

2.3 驗證試驗

根據響應面試驗優化得到，醬香蜂蜜酒最佳的發酵工藝參數為酵母添加量0.053%，發酵時間17.262 d，發酵溫度28.555 ℃。在此優化條件下，醬香蜂蜜酒的多酚含量理論值為3.470 mg/L。為了方便實際操作，將醬香蜂蜜酒釀造工藝參數修正為酵母添加量0.053%，發酵時間17 d，發酵溫度28.5 ℃。在此條件下進行3次平行驗證試驗，測定醬香蜂蜜酒的多酚含量實際值為3.488 mg/L，與理論值接近，證明此模型優化醬香蜂蜜酒可行。此時，感官評分為89.3分。

2.4 醬香蜂蜜酒抗氧化活性分析

由圖6A、圖6B可知，隨著醬香蜂蜜酒添加量在0.2～0.6 mL/mL增加，DPPH、羥自由基清除率逐漸升高，當醬香蜂蜜酒樣添加量＞0.6 mL/mL，其對DPPH、羥自由基清除率增加速率趨于平緩。通過擬合得到醬香蜂蜜酒DPPH、羥自由基清除率的IC50值分別為0.702 mL/mL、0.748 mL/mL。由圖6C可知，隨著醬香蜂蜜酒體積比的升高，ABTS自由基清除率隨之上升，呈現一定的相關性，經擬合得到醬香蜂蜜酒ABTS自由基清除率的IC50值為0.660 mL/mL。

圖6 醬香蜂蜜酒DPPH自由基（A）、羥自由基（B）及ABTS自由基（C）清除率Fig. 6 DPPH radical (A), hydroxyl radical (B), ABTS radical (C)scavenging rate of sauce-flavor mead

2.5 蜂蜜酒品質對比分析

2.5.1 理化及衛生指標對比分析

醬香蜂蜜酒理化及衛生指標檢測結果見表5。由表5可知，醬香蜂蜜酒的總酸、總酯、固形物（分別為3.10 g/L、1.30 g/L、0.54 g/L）高于未加蜂蜜發酵酒樣；兩個酒樣甲醇均未檢出，醬香蜂蜜酒鉛含量顯著低于未加蜂蜜發酵酒樣，醬香蜂蜜酒衛生指標均符合QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，而未加蜂蜜發酵酒樣鉛含量嚴重超過GB 2762—2022《食品安全國家標準食品中污染物限量》標準（0.5 mg/kg）。

表5 醬香蜂蜜酒與對照組理化及衛生指標檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical and health indexes of sauce-flavor mead and control group

2.5.2 揮發性風味物質對比分析

由表6可知，醬香蜂蜜酒中共檢出26種揮發性風味物質，其中有機酸類7種，醇類11種，酯類3種，醛類1種，酮類2種，吡嗪類2種；未加蜂蜜發酵酒樣共檢出22種揮發性風味物質，其中有機酸類8種，醇類9種，酯類1種，醛類1種，酮類2種，吡嗪類1種。相比之下，未添加蜂蜜發酵酒樣中揮發性風味物質種類少4種。

表6 醬香蜂蜜酒與對照組揮發性風味物質對比Table 6 Comparison of volatile flavor substances of sauce-flavor mead and control group

與未添加蜂蜜發酵酒樣相比，醬香蜂蜜酒中增加了3-乙氧基丙醇、3-甲基硫丙醇、苯乙酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、乙醛和3-甲基吡嗪6種物質，為醬香蜂蜜酒形成獨特的風味奠定了基礎，如3-甲基吡嗪屬于吡嗪類化合物，是白酒香氣成分的重要組成物質[30]；3-甲硫基丙醇俗稱菠蘿醇，具有洋蔥、甜的肉及肉湯的氣味，是調配肉味香精的重要香料之一[31]。醬香蜂蜜酒中不含有未添加蜂蜜發酵酒樣中產生的糠醛、甲酸；此外，丙醇、吡嗪和丙酸也低于未加蜂蜜發酵酒樣，其中糠醛和吡嗪是醬香型白酒的特征風味物質[32]，可以看出，由于蜂蜜的添加，醬香風味有所減弱。除此之外，其他揮發性風味物質含量均高于未添加蜂蜜發酵酒樣。

2.5.3 無機元素對比分析

由表7可知，醬香蜂蜜酒與未加蜂蜜酒樣中所含的無機元素的量具有較大差異。Be、Ni、Se、Ag、Sb、Tl、Th 7種元素在2種酒樣中均未檢出，As、Mo在兩種酒樣中含量一致，醬香蜂蜜中其他14種無機元素均低于未添加蜂蜜發酵酒樣，其中包括了有害重金屬Pb、易引起酒體渾濁甚至沉淀的Mg、Fe、Ba，影響白酒的色澤的Fe、Mn[33]，而對人體有益的必需的微量元素之一Zn的含量略高于未添加蜂蜜發酵酒樣。總的來說，醬香蜂蜜酒中無機元素優于未添加蜂蜜酒樣。

表7 醬香蜂蜜酒與對照組無機元素含量對比Table 7 Comparison of inorganic element content of sauce-flavor mead and control group

2.5.4 抗氧化活性對比分析

由表8可知，與未加蜂蜜酒酒樣相比，醬香蜂蜜酒的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率均顯著升高（分別為67.68%、61.75%、77.49%）（P＜0.05），說明加入蜂蜜對抗氧化能力提升有顯著影響。

表8 醬香蜂蜜酒與對照組抗氧化活性對比Table 8 Comparison of antioxidant activity of sauce-flavor mead and control group

3 結論

以七輪次醬香型白酒丟糟與蜂蜜為原料，經固態發酵后蒸餾得到醬香蜂蜜酒，在單因素試驗基礎上進行響應面試驗對醬香蜂蜜酒發酵工藝進行優化，得到其最優發酵工藝條件為：蜂蜜添加量15%，酵母添加量0.053%，發酵時間17 d，發酵溫度為28.5 ℃。在此優化工藝條件下，醬香蜂蜜酒的多酚含量為3.488 mg/L；感官評分為89.3分，其DPPH、羥自由基、ABTS+自由基清除率的IC50值分別為0.702 mL/mL、0.748 mL/mL、0.660 mL/mL；其酒精度、總酸、總酯、固形物含量分別為13.13%vol、3.10 g/L、1.30 g/L、0.54 g/L；甲醇未檢出；揮發性風味物質種類共檢出26種，其中有機酸類7種，醇類11種，酯類3種，醛類1種，酮類2種，吡嗪類2種；具有一定抗氧化活性，DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率分別為67.68%、61.75%、77.49%，與未添加蜂蜜的酒樣相比，醬香蜂蜜酒的酒精度、總酸、總酯、固形物較高，總酯較低，揮發性風味物質更豐富，抗氧化活性更強，無機元素更優。為酒糟的綜合利用及新型風味健康酒的開發提供了一定參考。