納米塑料-重金屬-塑化劑聯合暴露對兒童腸道微生物菌群及代謝的影響

豆晴楠 趙麗麗 姬漢軒 王怡斌 陳婉蓉 孫曉涵 姚國琴 馬騰云

摘? 要：［目的］探究納米塑料（NPs）、鎘（Cd）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）污染對兒童腸道菌群多樣性、氨基酸代謝及短鏈脂肪酸（SCFAs）含量的影響.［方法］利用16S rRNA高通量測序技術和高效液相色譜-質譜法LC-MS/MS分析NPs、Cd、DBP單一污染及納米塑料聚丙烯（PP）、Cd、DBP復合污染對兒童腸道細菌群落及腸道微生物代謝產物中短鏈脂肪酸及氨基酸含量的變化.［結果］高通量檢測結果顯示，與對照相比，在門屬水平上，單一污染的優勢菌門屬無明顯變化，PP+Cd、PP+DBP+Cd復合污染優勢菌門屬水平豐富度與多樣性顯著下降；LC-MS/MS檢測結果顯示，在腸道微生物代謝產物中，經NPs與DBP暴露后，氨基酸含量呈現不同程度的下降，而 Cd、PP+Cd、PP+Cd+DBP處理后，大多數氨基酸的含量顯著增加；同時檢測到丁酸、戊酸的含量也發生變化.［結論］與單一污染物處理相比NPs相關復合污染物暴露處理后其腸道微生物紊亂程度更強，且不同污染物處理均會影響腸道微生物的氨基酸代謝和SCFAs產量.腸道菌群與人體健康密切相關，探究腸道菌群及代謝功能在NPs、Cd、DBP影響下的變化，從腸道菌群層面評價NPs、Cd、DBP單一暴露和復合暴露污染下的危害和風險具有重要意義.

關鍵詞：納米塑料；鎘；鄰苯二甲酸二丁酯；腸道菌群；短鏈脂肪酸；氨基酸

中圖分類號：Q939.9????? 文獻標志碼：A文章編號：1000-2367（2024）01-0033-10

微/納米塑料（micronanoscale plastics，MNPs）是指尺寸小于5 mm的塑料顆粒，主要受到水流、風吹、陽光照射等外部環境的影響被破碎或降解所形成［1］，廣泛分布在淡水、海洋、土壤甚至空氣中.人體內MNPs的攝入途徑主要是食物、水和空氣，如食用魚類、雙殼類、鹽、飲用水、飲料、蜂蜜、蔬菜等.另外，塑料是常用的食品包裝材料，其在食品生產、運輸和包裝過程中與食品接觸會釋放出塑料顆粒，對人類健康產生嚴重威脅.最近，在人類血液、肺、肝臟、母乳、胎盤、胎糞和嬰兒糞便中均發現了微塑料［2］.GREEN等［3］構建了人腸道細胞模型，并使用納米聚苯乙烯顆粒暴露處理，結果發現納米塑料會影響細胞活力和誘導細胞凋亡.BROWN等［4］發現納米聚苯乙烯顆粒還會對人肺細胞產生炎癥作用.其他研究表明，微塑料口服暴露會導致受體肝臟炎癥、神經毒性反應，改變氨基酸和膽汁酸代謝，并改變微生物群組成［5］.

此外，由于MNPs比表面積相對較大，經過磨損、風化和氧化后MNPs帶負電荷，重金屬和持久性有機污

收稿日期：2023-06-20;修回日期：2023-09-18.

基金項目：國家重點研發計劃專項（2018YFD0200200）；新鄉市科技攻關項目（GG2020006）；新鄉市重大科技專項（22ZD001）.

作者簡介（通信作者）：趙麗麗（1984-），女，河南新鄉人，河南師范大學講師，博士，研究方向為食品微生物學，E-mail：zhaolili@htu.edu.cn.

引用本文：豆晴楠，趙麗麗，姬漢軒，等.納米塑料-重金屬-塑化劑聯合暴露對兒童腸道微生物菌群及代謝的影響［J］.河南師范大學學報（自然科學版），2024，52（3）：33-42.（Dou Qingnan，Zhao Lili，Ji Hanxuan，et al.Effect of combined exposure of nanoplastics-heavy metal-plasticizer on gut microbiota and metabolism in children［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（3）：33-42.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.06.20.0003.）

染物容易在MNPs表面黏附和積累，然后在環境中遷移并進入人體內［5-6］.鎘（cadmium，Cd）是環境中最常見的有毒金屬污染物之一，廣泛存在于土壤、水生生態系統中，具有環境毒性大、易積累、降解性差等特點.有研究報道，長期低劑量Cd2+暴露會導致小鼠脂質沉積和肝功能障礙［7］.此外，LIU等［8］發現小鼠暴露于Cd2+污染物下會降低小鼠腸道總細菌的豐度及結腸中短鏈脂肪酸的水平.而MNPs對Cd的吸附可能會進一步改變其環境行為、歸宿、生物利用度和毒性，從環境轉移到食物鏈甚至人體，這可能對生態系統及人類健康造成更嚴重的破壞.將草魚暴露在聚苯乙烯納米塑料和Cd2+的復合環境中96 h后，相較于單一Cd2+處理組來說，納米微塑料的添加急劇增加了Cd2+的毒性，且隨著濃度的增加，協同作用隨之增強［9］.環境中的微塑料在制造過程中不與聚合物碳鏈聚合，降解時可能會發生一系列變化，導致一些具有生物毒性的塑料添加劑釋放到環境中，形成二次污染物，如鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）.在生殖能力毒性風險測評中，DBP被分類為生殖毒性第3類有毒化合物［10］.作為增塑劑，DBP被廣泛應用于兒童玩具、醫療器械、營養補充劑和各種包裝.最近的一項研究在母體和臍帶血清樣本中發現了12種鄰苯二甲酸酯代謝物［11］.研究發現，當小鼠暴露于DBP時，盲腸內容物中腸道微生物群的組成和結構在門和屬水平上均發生了變化.DBP暴露可導致腸道菌群失調并擾亂肝臟脂質代謝，導致脂質積累，從而造成肝臟炎癥［12］.

越來越多的證據證明，環境污染物可以改變生物體內腸道微生物的生物組成和多樣性，腸道菌群參與宿主生理功能的調節，在維持宿主健康、免疫系統的正常發育和活動中有重要作用.由于腸道微生物群失調會引起各種與年齡相關的疾病，生態失調已被視為全球死亡的重要原因之一［13］.我們前期的研究發現，納米塑料（nanoplastics，NPs）、Cd，DBP均可影響植物乳桿菌的生長，且質量濃度分別為100.0、2.5、600.0 μg/mL時對菌株生長的影響最大；聚丙烯（polypropylene，PP）與聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）相比，本文所采用的納米塑料類型中PP對植物乳桿菌的影響更大［14］，因此，本實驗選用PP為Cd和DBP的復合污染物.然而，目前的研究大多集中在MNPs及其他污染物單一污染的危害，而MNPs的復合污染可能會造成更嚴重的健康影響，并且動物與人體腸道菌群存在差異，國內外大多數研究為復合污染對動物和水生生物的毒性影響，很少有人考慮其對人類健康的影響，因此，有必要研究MNPs、MNPs添加劑和重金屬復合污染對人體健康造成的共同危害.本文建立了腸道微生物體外培養體系，研究100.0 μg/mL的NPs、2.5 μg/mL的重金屬Cd和600.0 μg/mL的塑化劑DBP共同暴露時兒童腸道菌群及代謝的變化.微塑料類型主要采用PP、PE、PVC等3種常見的NPs類型.考察在Cd、DBP單一暴露污染及PP、Cd、DBP復合污染下，兒童腸道細菌群落多樣性及氨基酸代謝、短鏈脂肪酸含量的變化.本研究旨在為NPs、Cd和DBP對兒童腸道的共同作用提供理論依據，并警示人們NPs污染的風險.

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試劑與藥品

無菌脫纖維綿羊血（南京亞松生物科技有限公司）；澄清瘤胃液（艾禮生物科技上海有限公司）；樹脂厭氧培養瓶（河南美凱生物科技有限公司）；100 nm NPs顆粒（聚丙烯PP、聚乙烯PE、聚氯乙烯PVC）（新鄉智寶生物科技有限公司）；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）標準溶液、Cd鎘標準溶液（北京索萊寶科技有限公司）；正丁酸、正戊酸標準溶液、乙腈、甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）.

1.1.2? 儀器

安捷倫1260液相色譜儀（美國，安捷倫）與三重四極桿飛行時間質譜儀（德國，布魯克）；低溫高速離心機Heraeus Fresco 21（賽默飛世爾科技中國有限公司）；全自動氮吹儀（寧波新藝超聲設備有限公司）；渦旋儀MI01002（美國FOUR E′S-廣西王河科技有限公司）.

1.2? 實驗方法

1.2.1? 樣品采集及處理

樣品來源于15名（8男7女）10歲以下健康供體的新鮮糞便，均無任何消化性疾病，在樣品采集前一周之內未服用過任何藥物.排便后立即用無菌袋收集，置于冰袋上30 min內送至實驗室并充氮氣后在4 ℃下短暫保存.參考向情儒等［15］的方法處理樣品，并略加修改.從15份樣品中分別取0.5 g混合均勻，按照1∶10的體積比重懸于PBS緩沖液中，用渦旋儀充分混合5 min后使用3層無菌醫用紗布過濾，得到10%的糞便接種物，置于4 ℃冰箱備用.

1.2.2? 體外培養

體外培養使用樹脂厭氧培養瓶，實驗共分為8種不同處理，分別為PP、PE、PVC納米塑料，Cd、DBP單一污染，PP+Cd、PP+DBP、PP+Cd+DBP復合污染，在培養瓶中加入5 mL無菌脫纖維綿羊血，5 mL澄清瘤胃液，0.5 mL糞便接種物以及不同處理的污染物，其中NPs、Cd、DBP的終質量濃度分別為100.0、2.5、600.0 μg/mL.相同條件下，不加任何污染物的處理為空白對照，每組3個重復.將處理后的培養瓶置于37 ℃下培養48 h后收集樣品，以供下一步分析.

1.2.3? 16S rRNA高通量測序

樣品總DNA提取和高通量測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行.取1 mL培養好的樣品離心10 min（4 ℃，6 000 r/min）取上清于離心管中并使用液氮速凍，將處理合格的樣品保存于干冰中至公司進行總DNA提取，使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）細菌通用引物對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增.使用質量分數2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行回收產物純化，2%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus Fluorometer（Promega，USA）對回收產物進行檢測定量.使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit對純化后的PCR產物進行建庫，利用Illumina公司平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）.

1.2.4? 短鏈脂肪酸的測定

取1 mL培養好的樣品離心10 min（4 ℃，13 000 r/min）取上清于離心管中并用0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶待測.設定丙酸、丁酸、戊酸質量濃度為0、5、10、25、50、100、200 μg/L，使用高效液相色譜-質譜聯用技術制作出標準曲線，通過DataAnalysis軟件分析數據并記錄峰面積，采用線性回歸分析法計算不同處理對腸道細菌產物短鏈脂肪酸含量的影響.色譜條件：色譜柱為XDB-C18液相色譜柱，使用梯度洗脫的方法.流動相：A（含體積分數0.1％甲酸的水）；B（含體積分數0.1％甲酸的乙腈），其中進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃.流動相洗脫梯度見表S1.質譜條件：采用電噴霧離子源，MRM的正離子模式，氮氣作為霧化、錐孔氣［16］；主要參數設置包括：毛細管電壓4.5 kV；端板偏移電壓0.5 kV；離子源溫度220 ℃；噴霧器電壓5.0 kV；干燥氣體條件9.0 L/min；質荷比范圍50～1 300 m/z.

1.2.5? 氨基酸代謝產物的測定

按照1.2.4中的方法進行樣品處理及檢測，根據不同種類氨基酸的分子式與相對分子質量與樣品特征峰比對，以確定氨基酸種類并利用特征峰面積計算氨基酸含量（附錄圖S1）.

1.2.6? 方法驗證與數據分析

從線性、檢出限（LOD）兩方面評估液相色譜質譜法測定氨基酸代謝產物、短鏈脂肪酸含量的準確性.分別繪制不同氨基酸和短鏈脂肪酸濃度下的峰面積（Y）與濃度（X）之間的關系，氨基酸和短鏈脂肪酸在各自的質量濃度范圍內均有良好的線性關系，最低檢測限（LOD）以3倍信噪比計算.不同氨基酸的線性相關系數為0.997 0～0.999 1，檢出限為3.12～11.40 ng/L；短鏈脂肪酸的線性相關系數為0.999 0～0.999 3，檢出限為0.8～1.0 ng/L，表明該方法具有較高的靈敏度.使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME 2）分析得到的序列數據，DADA 2對序列進行質量過濾、修剪、去噪和合并，并用GreenGenes（版本13.8）參考數據庫進行分類分析，R語言進行數據清洗和檢驗；利用Excel進行實驗數據整理，數據結果以平均值±標準差表示（n=3），利用SPSS 21.0軟件，單因素分析方法（ANOVA）進行顯著性分析，P＜0.05表示有統計學意義；氨基酸代謝產物、短鏈脂肪酸含量數據處理及作圖采用Origin 2018；冗余分析利用Canoco進行，使用Canoco for Windows指定分析的數據和排序模型，CanoDraw繪制排序圖；利用R語言生成物種相關性矩陣，相關性|r|＞0.6、p＜0.05挑選物種進行相關性網絡圖分析［17］，網絡圖繪制使用Gephi軟件.

2? 結? 果

2.1? 不同污染對兒童腸道菌群門屬水平的影響

不同污染物暴露下兒童腸道菌群門水平變化情況見附錄圖S1，每個處理組3個重復.兒童腸道微生物菌群在門分類水平上共鑒定出9個門，其中優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），占總比例的99%～100%.與對照相比經不同類型的NPs、DBP、Cd單一污染及PP+DBP復合污染后，Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria豐度無明顯變化，門水平細菌群落組成無顯著性差異；經PP+Cd、PP+DBP+Cd聯合暴露后厚壁菌門的相對豐度分別升高至99.83%和94.96%，門水平多樣性明顯降低.不同污染物暴露下兒童腸道菌群屬水平變化情況如圖1所示.

圖1（a）和圖1（b）均選擇樣本中相對豐度大于0.05%的前47和46個屬，與對照相比，單一污染及PP+DBP復合污染的優勢菌屬無明顯變化，主要為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、巨型球菌屬（Megasphaera）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus），其中Bifidobacterium，Streptococcus豐度下降.菌屬多樣性增加，新增多爾氏菌屬（Dorea）、布勞特氏菌屬（Blautia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等.與單一污染相比，在PP+Cd和PP+DBP+Cd復合污染組中優勢菌屬有顯著差異，其中乳桿菌屬的相對豐度分別升高至97.50%和83.45%，PP+Cd樣品屬水平多樣性顯著下降.以上結果表明，在不同污染物暴露下均會使腸道菌群發生一定程度的紊亂，其中PP+Cd和PP+DBP+Cd復合污染暴露下的菌群紊亂程度最強，且乳桿菌屬對這2組樣品污染物耐受性最強.

2.2? 不同污染與兒童腸道菌群相關性分析

為了了解環境變量NPs，Cd和DBP不同污染方式與兒童腸道菌群物種分類水平間的變化（每個處理3個重復），運用Canoco進行相關性分析（圖2），數據分析的4個軸的最大梯度為2.369，因此進一步分析采用基于線性模型的RDA直接排序法.

選取了相對豐度大于0.005%的前44個菌屬，Cd與乳球菌屬（Lactococcus）、Lactobacillus、薩特氏菌屬（Sutterella）、小桿菌屬（Dialister）、Enterobacteriaceae、摩根氏菌屬（Morganella）、柯林斯菌屬（Collinsella）呈正相關，與擬桿菌屬（Bacteroides）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）等呈負相關；PVC與Cd呈現相反的趨勢；PP、PP+Cd與梭菌屬（Clostridium）、Ruminococcus、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、Parabacteroides等呈正相關；DBP、PP+DBP、PP+DBP+Cd與梭菌目（Clostridiales）、腸球菌屬（Enterococcus）、Streptococcus、不動菌屬（Acinetobacter）、芽殖菌屬（Gemmiger）等呈正相關，與布勞特氏菌屬（Blautia）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、巨型球菌屬（Megasphaera）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）等呈負相關；PE與DBP、PP+DBP、PP+DBP+Cd呈相反的趨勢.

2.3? 不同污染對兒童腸道細菌群落影響的網絡分析

探索納米塑料、重金屬、塑化劑與兒童腸道細菌類群之間的關聯，圖3（a）和圖3（b）分別顯示了單一污染（PP、PE、PVC、Cd、DBP處理組）和復合污染（PP+Cd、PP+DBP、PP+Cd+DBP處理組）下微生物之間的相互關系，每個處理組3個重復.由圖3可以看出，單一污染和復合污染中細菌網絡第一優勢菌門均是厚壁菌門，分別為85.29%和84.38%；圖3（a，b）均以正相關關系為主，正相關比例分別為77.65%和90.91%.通過計算分子生態網絡拓撲學特征參數描述菌群之間復雜的相互關系，圖3（a）中節點數為34，連接數為85，其中糞球菌屬連通數最高（7），與其他節點多為負相關關系；圖3（b）中節點數為32，連接數為88，Lactobacillus，Parabacteroides，Phascolarctobacterium，Megasphaera，Veillonella，Collinsella，Bacteroides，Sutterella，Clostridium的連接數最高（均為8），除Lactobacillus外與周圍節點均為正相關關系；并且這9個節點之間相互作用，Lactobacillus與其他8個節點以競爭關系互作；與圖3（a）相比，圖3（b）的邊數、平均度、平均聚類系數、連接部件和圖密度均較高，模塊化指數和網絡直徑較低，但兩者模塊化指數大于0.4，說明網絡均具有模塊化結構.

兩組細菌網絡第一優勢菌門均是Firmicutes，分別為85.29%和84.38%，由此說明，單一污染物細菌分子生態網絡中物種更豐富、互作關系更復雜；復合污染中Collinsella，Clostridium，Megasphaera，Collinsella等致病菌在復合污染中以共生關系與周圍細菌互作；Lactobacillus與周圍節點均為負相關關系（100%），說明Lactobacillus多以競爭關系與周圍細菌互作.本研究構建的兩個分子生態網絡中均為正相關關系占優勢（77.65%、90.91%），表明合作關系大于競爭關系.

2.4? 不同污染處理對兒童腸道代謝的影響

2.4.1? 對腸道微生物氨基酸代謝的影響

使用LC-MS/MS測定腸道微生物培養系統中19種氨基酸的含量，并將測定結果導入Origin，數據經Z評分進行歸一化處理后繪制熱圖，用來表達不同污染物單一處理及復合污染等8種不同處理方式對腸道微生物氨基酸代謝的影響，每個處理組3個重復.如圖4（a）所示，與對照組相比，經NPs與DBP單一暴露后，除甘氨酸、纈氨酸和蘇氨酸外，其他氨基酸含量均有不同程度的下降，其中亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸下降最明顯；Cd單一暴露、PP+Cd、PP+Cd+DBP復合暴露后，大多數氨基酸的含量顯著增加.由此說明，不同污染物處理均會影響氨基酸代謝.

2.4.2? 對兒童腸道菌群代謝產物短鏈脂肪酸的影響

如圖4（b）所示，研究了不同污染對兒童腸道菌群代謝產物SCFAs的影響，鑒定了腸道微生物培養體系中丁酸和戊酸的含量（每個處理組3個重復）.與對照組相比，腸道微生物產生丁酸的量在PP、PVC、DBP暴露下有所升高，而在PE處理下含量基本不變.在Cd、PP+DBP、PP+Cd、PP+DBP+Cd等4個處理組中，丁酸含量均為0.在PP、PE、PVC、DBP和PP+Cd組中，戊酸的含量大幅度增加，與對照相比有極顯著性差異；而Cd、PP+DBP、PP+DBP+Cd組的戊酸含量降低.以上述結果可知，添加納米塑料、重金屬、塑化劑后對腸道微生物代謝產物SCFAs的含量均有一定程度的影響.

3? 討? 論

腸道菌群是生物體內一個非常重要的微生態系統，主要依靠宿主生物的腸道生存并發揮相應的功能.人體微生物群落組成和多樣性與人體健康密切相關.本項研究中利用高通量測序和液相質譜聯用分析了納米塑料、重金屬和塑化劑在單一污染和復合污染時對兒童腸道細菌群落組成、分子生態網絡的拓撲學特征、氨基酸和短鏈脂肪酸產物的影響，是研究兒童微生物群落結構及其代謝功能響應的關鍵.研究結果表明，經不同污染物暴露后，兒童腸道菌群發生紊亂的程度也具有差異性.與PP+Cd、PP+Cd+DBP復合污染相比，單一污染的門屬水平變化較小，可能是因為復合污染時微塑料會將Cd2+吸附在表面，共同作用于人體，對腸道菌群造成更嚴重的危害，其中NPs-PP與Cd聯合暴露后，腸道菌群門水平數量顯著減少，Firmicutes相對豐度增加，這與JIN等［18］在NPs對斑馬魚腸道菌群影響的研究結果一致.Firmicutes和Bacteroidetes是腸道微生物群中的2種主要細菌，病理學上，Firmicutes可誘導肥胖和肝脂肪變性，并促進TNF-α mRNA水平的升高，Firmicutes可能參與了非酒精性脂肪性肝病的發病機制，并且膽石病患者、多發性硬化癥患者［19］Firmicutes的數量均顯著增加.Firmicutes與Bacteroidetes的比值（F/B）與炎癥狀況密切相關，如炎癥性腸病（IBD）和肥胖個體都存在較高的比值.本實驗中，與對照相比PP、PVC、DBP、PP+Cd、PP+Cd+DBP實驗組的F/B增加，從20.8分別增加至25.5、21.0、82.6、1 836.3、91.6；LOUIS等［20］為16名肥胖患者實施了一項減肥計劃，結果顯示肥胖患者的F/B比率高于健康組.然而與PP+Cd相比，PP+Cd+DBP復合污染時Firmicutes豐度相對略有降低，Bacteroidetes豐度及門水平數有所回升，可能是因為DBP與Cd共同存在下呈現出拮抗作用.

在屬水平上，經污染物暴露后Bifidobacterium、鏈球菌屬（Streptococcus）相對豐度降低.Bifidobacterium豐度降低會使小鼠體重增加、脂肪堆積并降低葡萄糖耐量，引起代謝紊亂［21］，這些益生菌豐度的下降會破壞腸道微生態平衡，降低腸道免疫能力及健康程度.另外，不同污染物暴露后新增多爾氏菌屬（Dorea）、Blautia，Ruminococcus、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅氏菌屬（Roseburia），其豐度均與慢性疾病包括炎癥性腸病、結腸癌、肥胖等密切相關［22］.有實驗研究了不同胃腸道疾病患者腸道菌群的變化，其中腸易激綜合征會導致Faecalibacterium豐度升高，潰瘍性結腸炎會使Blautia，Roseburia豐度升高，克羅恩病會使Ruminococcus豐度升高［23］.PP+Cd、PP+DBP+Cd復合污染時，菌群多樣性降低，優勢菌群由Enterobacteriaceae變為Lactobacillus，Lactobacillus相對豐度增高至97.50%和83.45%.ZHAI等［24］研究表明乳酸菌對重金屬鎘具有強的耐受能力，且在二價金屬Cd離子存在下，會促使細胞表面分泌物增多，細胞發生聚集形成生物膜.段莉陽等［25］的研究表明，在重金屬和微塑料等脅迫條件下，具有相應耐受能力的微生物會與微塑料黏附，并得以富集生長.所以本實驗中，Lactobacillus豐度升高可能是由于PP+Cd、PP+Cd+DBP共同污染時，Lactobacillus為抵御不良環境，與PP發生黏附，使細胞聚集形成生物膜，造成豐度升高，說明乳酸菌有較強的耐受性.總之，不同的污染物暴露下都會導致細菌群落在門屬水平上的多樣性和豐富度呈現明顯差異，并且與單一污染相比復合污染的差異性更強，因此，腸道菌群對于維持宿主的健康非常重要.

網絡分析與腸道菌群的多樣性分析相比，網絡分析更便于體現微生物之間的相互作用以及結構變化.在分子生態網絡圖中，正相關通常代表生態位一致性或共生關系，負相關代表競爭關系.在整個網絡中，復合污染時Lactobacillus以競爭關系與周圍細菌互作，Lactobacillus豐度的增加使腸道菌群多樣性降低.本研究構建的兩個分子生態網絡中均為正相關關系占優勢，表明整體上合作關系大于競爭關系，但復合污染更能促進微生物之間的共生關系.同時，與單一污染相比，復合污染具有較短的平均路徑長度（1）和較高的平均聚類系數（0.928）.平均路徑長度表示物質、信息、能量在微生物之間的傳遞效率，平均聚類系數表示節點與其他節點的連接程度［26］.由此說明，復合污染下微生物之間的關系更密切，網絡圖中節點之間的響應速度和傳遞效率更高，群落結構更易發生變化.復合污染的連接數和平均度均較高，說明復合污染下細菌分子生態網絡中物種互作關系更復雜；單一污染的節點數較高，說明單一污染下物種更豐富.

腸道微生物群在氨基酸消化和吸收過程中起著至關重要的作用，氨基酸代謝的多樣性可能會對宿主產生有益或不利的影響.Clostridium、Bacteroides、Bifidobacterium豐度與氨基酸代謝能力密切相關，而復合污染時它們的豐度降低，使氨基酸的分解與利用率下降，在人體腸道大量積累.研究表明，克羅恩病患者糞便中高水平的氨基酸，如丙氨酸、β-丙氨酸和苯丙氨酸，部分原因可能是這些患者的炎癥引起的吸收不良，或反映了產生細菌的增加［27］.微生物群衍生分子（如SCFAs）作為微生物群和宿主之間的重要分子信號或調節宿主代謝的代謝底物［28］.復合污染時，氨基酸代謝產物丙酸、丁酸含量為0，丁酸作為腸道上皮細胞線粒體呼吸的主要能量來源，在組蛋白去乙酰化過程中起到重要作用，廣泛影響腸道上皮細胞和免疫細胞的繁殖和代謝［29］.戊酸含量大幅上升，可能是因為Lactobacillus，Ruminococcus豐度的升高.丁酸對糖尿病有較大的有益作用，并在構建腸道粘膜結構和腸道免疫屏障中起重要作用［30］.NPs暴露會降低腸道中雙歧桿菌的豐度，并顯著降低腸道菌群中雙歧桿菌/大腸桿菌（B/E）值，其中PP+Cd的B/E值為0，腸道定植能力明顯減弱，影響腸道微生物的代謝功能，降低短鏈脂肪酸的含量.另外，由于本實驗是將人體糞便細菌進行體外培養和暴露，缺少了腸道內環境的相互作用.所以，目前的結果對污染物人體健康效應的意義有限，沒有辦法直接外推至人體.關于NPs、Cd、DBP單一污染和復合污染對兒童腸道微生物群落結構的改變還需要更多的毒理學實驗進一步研究.

4? 結? 論

本實驗研究了NPs（PP、PE、PVC）、Cd、DBP單一污染和復合污染對兒童腸道細菌群落、短鏈脂肪酸含量和氨基酸代謝能力的影響.實驗結果顯示，一方面，在腸道菌群多樣性分析上，不同處理均會使腸道菌群發生不同程度的紊亂，細菌群落的多樣性和豐富度都呈現明顯差異，且復合污染時差異更明顯.單一污染時優勢菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes，優勢菌屬主要為Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Megasphaera、Bifidobacterium.而PP+Cd、PP+DBP+Cd復合污染時Firmicutes占比較大，乳桿菌顯示出對污染物更強的耐受性.同時，在腸道菌群相互關系上，復合污染時也比單一污染時微生物互作關系更復雜.另一方面，在腸道微生物代謝分析上，納米塑料與重金屬、塑化劑復合污染時會影響氨基酸的代謝及短鏈脂肪酸的合成，氨基酸比例失衡使腸道黏膜受損，短鏈脂肪酸合成能力下降會影響營養物質的吸收及免疫防御能力，危害人體健康.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.06.20.0003）.

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Effect of combined exposure of nanoplastics-heavy metal-plasticizer on gut microbiota and metabolism in children

Dou Qingnan1， Zhao Lili1， Ji Hanxuan2， Wang Yibin1， Chen Wanrong1， Sun Xiaohan1， Yao Guoqin1， Ma Tengyun1

（1. College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China; 2. Whole-process Teaching Base， Xinxiang Medical College， Xinxiang 453003， China）

Abstract： ［Objective］ To explore the effects of nano-plastics（NPs）， cadmium（Cd） and dibutyl phthalate（DBP） on intestinal flora diversity， amino acid metabolism and short-chain fatty acid content in children. ［Methods］ The effects of single and combined pollution of nano-plastics（polypropylene，PP）， Cd and DBP on the contents of short-chain fatty acids and amino acids in intestinal bacterial communities and intestinal microbial metabolites in children were analyzed by high throughput sequencing technology of 16S rRNA and high performance liquid chromatogen-mass spectrometry（LC-MS/MS）. ［Results］ The high-throughput test results showed that， compared with the control， at the phylum genus level， the dominant bacteria with single pollution had no significant change， and the diversity of the dominant bacteria with PP+Cd， PP+DBP+Cd combined pollution significantly decreased. The results of LC-MS/MS test showed that the amino acid content of intestinal microbial metabolites decreased to varying degrees after exposure to NPs and DBP， while the content of most amino acids increased significantly after Cd， PP+Cd， PP+Cd+DBP treatment. The content of butyric acid and valerate also changed. ［Conclusion］ Compared with the single pollutant treatment， the intestinal microbial disorder is stronger after exposure to nano-plastics-related complex pollutants， and different pollutant treatments could affect the amino acid metabolism and SCFAs production of intestinal microorganisms. Intestinal flora is closely related to human health. It is of great significance to explore the changes of intestinal flora and metabolic function under the influence of NPs， Cd and DBP， and to evaluate the hazards and risks of single exposure and combined exposure to NPs， Cd and DBP from the level of intestinal flora.

Keywords： nano-plastics; cadmium; dibutyl phthalate; gut microbiota; short-chain fatty acids; amino acid

［責任編校? 劉洋? 楊浦］

附? 錄