秋水仙堿通過激動PI3K/AKT/eNOS信號通路對急性心肌梗死大鼠心功能的影響

李穎 吳曼 陳智 王冠 郭俊玲

摘要?目的：探究秋水仙堿通過調節磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/內皮型一氧化氮合酶（eNOS）信號通路對急性心肌梗死（AMI）大鼠心功能的影響。方法：78只大鼠中隨機選取12只作為假手術組，剩余大鼠構建AMI模型，造模成功大鼠分為模型組、秋水仙堿組［4 mg/（kg·d）］、秋水仙堿［4 mg/（kg·d）］＋LY294002（20 mg/mL）組、秋水仙堿［4 mg/（kg·d）］＋MK-2206（60 μg/mL）組、秋水仙堿［4 mg/（kg·d）］＋L-NAME（1.6 mg/mL）組，每組12只。超聲心動圖檢測大鼠左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、射血分數（EF）及短軸縮短率（FS）。處死大鼠，蘇木素-伊紅（HE）染色檢測大鼠心肌組織石蠟切片病理學變化；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法檢測心肌細胞凋亡率；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）測定大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）以及心肌組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）水平；免疫印跡法（Western Blot）測定大鼠心肌組織PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表達。結果：與假手術組相比，模型組大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌勻漿MDA、心肌細胞凋亡率升高，EF、FS水平，心肌勻漿SOD、CAT，心肌組織磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K、磷酸化AKT（p-AKT）/AKT、磷酸化eNOS（p-eNOS）/eNOS降低（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌勻漿MDA、心肌細胞凋亡率降低，EF、FS水平，心肌勻漿SOD、CAT，心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌勻漿MDA、心肌細胞凋亡率升高，EF、FS水平，心肌勻漿SOD、CAT，心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低（P＜0.05）。結論：秋水仙堿可能通過激活PI3K/AKT/eNOS信號通路對AMI大鼠發揮心功能保護作用。

關鍵詞?急性心肌梗死；秋水仙堿；心功能；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶信號通路；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.009

Colchicine Promotes Cardiac Function in Rats with Acute Myocardial Infarction by Activating PI3K/AKT/eNOS Signaling Pathway

LI Ying， WU Man， CHEN Zhi， WANG Guan， GUO Junling

Tangshan People′s Hospital， Tangshan 063000， Hebei， China

Corresponding Author???GUO Junling， E-mail： sweetheart0817@126.com

Abstract?Objective：To investigate the effect of colchicine on cardiac function in rats with acute myocardial infarction（AMI） by regulating phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/endothelial nitric oxide synthase（eNOS） signaling pathway.Methods：There were 78 rats，12 were randomly selected as the sham-operated group，and the remaining 66 rats were used to construct an AMI model.Rats with successful modeling were divided into model group，colchicine group［4 mg/（kg·d）］，and colchicine［4 mg/（kg·d）］＋LY294002（20 mg/mL） group，colchicine［4 mg/（kg·d）］）＋MK-2206（60 μg/mL） group，colchicine［4 mg/（kg·d）］＋L-NAME（1.6 mg/mL） group，with 12 rats in each group.Echocardiography was applied to measure left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），ejection fraction （EF），and short-axis shortening（FS） in rats.Rats were sacrificed，and hematoxylin-eosin（HE） staining was used to measure the pathological changes in rat myocardial paraffin sections.Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling（TUNEL） method was implemented to measure cardiomyocyte apoptosis rate.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） method was implemented to measure the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-6，creatine kinase-MB（CK-MB） in rat serum and superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），and catalase（CAT） in myocardial tissue homogenate.Western Blot was performed to determine the protein expression of PI3K/AKT/eNOS pathway in rat myocardial tissue.Results：Compared with sham-operated group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in model group increased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS decreased（P＜0.05）.compared with model group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in colchicine group decreased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS increased（P＜0.05）.Compared with colchicine group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in colchicine＋LY294002 group，colchicine＋MK-2206 group，and colchicine＋L-NAME group increased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS decreased（P＜0.05）.Conclusion：Colchicine may exert some protective effect on cardiac function in AMI rats by activating the PI3K/AKT/eNOS pathway.

Keywords?acute myocardial infarction; colchicine; cardiac function; phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase signaling pathway; experimental study

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）主要病理特征表現為冠狀動脈持續性缺血缺氧導致的

基金項目?河北省醫學科學研究課題計劃項目（No.20210316）

作者單位?唐山市人民醫院（河北唐山 063000）

通訊作者?郭俊玲，E-mail：sweetheart0817@126.com

引用信息?李穎，吳曼，陳智，等.秋水仙堿通過激動PI3K/AKT/eNOS信號通路對急性心肌梗死大鼠心功能的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1219-1224.

心肌壞死，嚴重者可并發心力衰竭、休克等。AMI多發生在動脈粥樣硬化基礎上，發作后產生的心功能障礙嚴重影響病人生活質量，因此，緩解心肌細胞壞死、改善心功能是AMI治療的主要研究方向［1］。但目前臨床上可用于緩解AMI發作后心力衰竭的藥物效果并不令人滿意，急需進一步的研究開發出更多、更有效的挽救心功能的藥物。

秋水仙堿（colchicine）是從秋水仙中提取出來的生物堿，是秋水仙的藥用有效成分，可抑制有絲分裂，使細胞分裂中期停滯，在遺傳學的研究中廣泛使用，可用于治療癌癥、痛風等疾?。?-3］。近年來研究發現，秋水仙堿在心血管疾病中也能起到很好的治療作用。一項大型雙盲隨機對照研究發現，心肌梗死發生后每日低劑量的秋水仙堿可顯著降低梗死后并發癥的發生率［4］。過度炎癥反應及繼發的纖維化是AMI后心肌纖維化和心功能衰竭的主要原因。秋水仙堿具有廣譜的抗炎、抗纖維化的作用，可通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）介導的細胞焦亡過程挽救AMI誘導的心肌細胞死亡，增強心肌順應性而恢復AMI后的心臟搏動功能［5］。同時，秋水仙堿還能選擇性抑制炎性細胞的趨化和促炎分化，抑制炎性因子的分泌和炎癥信號通路的激活，實現預防AMI后心肌的二次損傷和心功能下降［6］。既往已有很多研究聚焦于秋水仙堿對心包炎的防治作用，但秋水仙堿挽救AMI后大鼠心功能的分子機制目前還有待進一步研究［7］。

內皮型一氧化氮合酶（eNOS）是心肌細胞合成一氧化氮（NO）的限速酶，在抗氧化損傷中發揮重要作用，而氧化應激損傷是AMI后心肌炎癥和心功能障礙的重要機制［8-9］。既往研究發現，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路可能通過磷酸化eNOS（p-eNOS）降低過氧化損傷，并參與心肌保護過程［10］。本研究構建了AMI大鼠模型，基于PI3K/AKT/eNOS通路探究了秋水仙堿對AMI大鼠心功能的影響，為AMI的治療提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?實驗動物以及主要試劑、儀器

本研究所有實驗內容均在唐山市人民醫院科研平臺完成。無特定病原體（SPF）級SD大鼠90只（雄性），體質量300～350 g，9周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0006。秋水仙堿（B71404）購自上海源葉；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（C0105S）、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（C1091）、蛋白提取試劑盒（P0033）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（S0131S）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（S0101S）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（S0051）購自上海碧云天；肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測試劑盒（ml059533）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（ml002859）、白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒（ml102828）購自上海酶聯；PI3K抑制劑LY294002（S1105）、AKT抑制劑MK-2206（S1078）、eNOS抑制劑L-NAME（S2877）購自Selleck；磷酸化PI3K（p-PI3K，ab278545）、PI3K（ab154598）、磷酸化AKT（p-AKT，ab38449）、AKT（ab18785）、p-eNOS（ab215717）、eNOS（ab76198）、GAPDH（ab8245）抗體、山羊抗鼠二抗（ab6728）購自美國Abcam。心電圖儀（ECG-2110型）購自涵飛醫療，小動物多普勒超聲心動儀（Vevo770）購自Visual Sonics Inc。

1.2?實驗方法

1.2.1?動物模型建立以及分組情況

78只SD大鼠，隨機選取12只作為假手術組，剩余大鼠參照文獻［11］構建AMI模型，即大鼠仰臥固定于手術臺，戊巴比妥鈉（3%）腹腔麻醉大鼠，連接動物呼吸機給予正壓通氣，開胸暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支，心電圖顯示ST段持續性抬高代表建模成功，縫合胸腔，自主呼吸恢復后拔管，給予抗生素防治感染。造模成功72只，造模成功率為92.31%。假手術組僅穿針，不結扎。造模成功大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組［4 mg/（kg·d）］［12］、秋水仙堿＋LY294002組（20 mg/mL）［13］、秋水仙堿＋MK-2206組（60 μg/mL）［14］、秋水仙堿＋L-NAME組（1.6 mg/mL）［15］。假手術組給予等量生理鹽水。均為每日1次，持續給藥2周。

1.2.2?心功能檢測

末次給藥后，麻醉大鼠，采用小動物多普勒超聲心動儀測定大鼠左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、射血分數（ejection fraction，EF）及短軸縮短率（fractional shortening，FS）。取連續3個心動周期，測定平均值。

1.2.3?心肌酶、炎性指標檢測

心功能檢測結束后，取大鼠腹主動脈血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，嚴格按照試劑盒說明書的步驟檢測血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平。

1.2.4?氧化應激指標檢測

血清指標檢測結束后，剝離大鼠心臟，將其切分為3部分，一部分置于凍存管中，－80 ℃保存；一部分用4%多聚甲醛固定；另一部分按照1∶9的比例加入預冷的生理鹽水研磨后，離心，取上清液，制備成10%的組織勻漿，檢測勻漿中MDA、SOD、CAT水平。

1.2.5?HE染色觀察大鼠心肌病理變化

取甲醛固定的心臟組織，常規制備石蠟切片，HE染色試劑盒對石蠟切片進行HE染色，封片，鏡下觀察大鼠心肌病理變化。

1.2.6?TUNEL法觀察大鼠心肌凋亡

取石蠟切片，脫蠟，按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，封片，顯微鏡下觀察凋亡細胞情況（棕褐色染色），計算凋亡率，凋亡率（%）＝凋亡細胞/總細胞×100%。

1.2.7?免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠心肌組織PI3K/AKT/eNOS信號通路蛋白表達

取冷凍保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量，30 μg/孔蛋白質上樣，經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉膜，封閉（5%脫脂奶粉），加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS、GAPDH一抗，過夜，加入二抗（1∶5 000），孵育1 h后，采用增強型化學發光試劑（ECL）顯色，計算條帶的相對表達。

1.3?統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較進一步采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結?果

2.1?秋水仙堿對大鼠心功能的影響

與假手術組相比，模型組大鼠LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠LVESD、LVEDD降低，EF、FS升高（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2?秋水仙堿對大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.3?秋水仙堿對大鼠心肌組織SOD、CAT、MDA水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織SOD、CAT水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠心肌組織SOD、CAT水平明顯升高，MDA水平明顯降低（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組大鼠心肌組織SOD、CAT水平明顯降低，MDA水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表3。2.4?HE染色觀察秋水仙堿對大鼠心肌組織病理變化的影響

假手術組大鼠心肌組織排列整齊、染色均勻，無心肌細胞壞死；模型組大鼠染色不均，細胞形態不規則，可見大量炎性浸潤；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠心肌組織排列整齊，炎性浸潤減少；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組大鼠心肌病變程度有所加重。詳見圖1。

2.5?TUNEL染色觀察秋水仙堿對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組大鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6?秋水仙堿對大鼠心肌組織PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低（P＜0.05）；與模型組相比，秋水仙堿組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，秋水仙堿＋LY294002組、秋水仙堿＋MK-2206組、秋水仙堿＋L-NAME組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均降低（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3?討?論

AMI是心血管疾病病死率居高不下的重要原因之一。AMI后心肌細胞的壞死會影響心功能，心功能不全是AMI病人生存質量下降的原因之一，也是急需解決的問題。本研究通過對SD大鼠造模，成功構建了AMI大鼠模型，AMI大鼠LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低，即AMI大鼠心功能明顯下降。炎癥、氧化應激在AMI大鼠的心功能不全中發揮關鍵作用。心肌缺氧缺血后會激活氧化應激，產生活性氧（ROS），釋放TNF-α、IL-6等炎性因子，促進AMI的發展［12-16］。AMI模型大鼠心肌細胞排列不規則，可見大量炎性細胞浸潤，CK-MB、MDA、TNF-α、IL-6水平明顯升高，SOD、CAT水平明顯降低。提示AMI大鼠氧化應激、炎癥水平升高，心肌損傷劇烈。

本研究給予AMI大鼠秋水仙堿后，大鼠LVESD、LVEDD明顯降低，EF、FS明顯升高，提示秋水仙堿可改善AMI大鼠心功能。eNOS是Ca2＋依賴性一氧化氮合酶（NOS），可表達于心肌細胞，內皮細胞受機械、生化刺激后，細胞內Ca2＋釋放，與鈣調蛋白結合激活eNOS，可將氮原子氧化為一氧化氮（NO），NO可與平滑肌細胞的血紅素結合，通過激活鳥苷酸環化酶等維持血管舒張狀態，在心肌保護中發揮作用［17］；在各因素影響下，eNOS四級結構改變，不產生NO，產生超氧化物，即eNOS脫偶聯，可增加內皮細胞氧化壓力，損傷血管內皮，而ROS水平升高又進一步加深eNOS脫偶聯，形成惡性循環。Chen等［18］研究顯示，高表達eNOS的間充質干細胞可促進心肌梗死大鼠的心臟恢復。Calvert等［19］研究顯示，二甲雙胍通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-eNOS介導的信號通路保護心肌梗死細胞。PI3K/AKT可參與內皮細胞生長的調控［20］。PI3K/AKT激活可保護2型糖尿病小鼠的心功能［21］。此外，PI3K/AKT可激活eNOS磷酸化，參與eNOS的脫偶聯。秋水仙堿具有高效抗炎作用，可減少NLRP3激活的炎癥，改善肥胖相關代謝失調［22］，對心肌梗死大鼠炎癥具有抑制作用［23］。本研究中，給予AMI大鼠秋水仙堿后，血清CK-MB明顯降低，心肌細胞排列整齊，炎性細胞浸潤明顯減少，同時血清TNF-α、IL-6、MDA水平明顯降低，心肌組織SOD、CAT水平明顯升高，提示秋水仙堿可抑制AMI大鼠炎癥與氧化應激；AMI大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平降低，經秋水仙堿處理后大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平升高，提示秋水仙堿對AMI大鼠的心功能有保護作用，可能與激活PI3K/AKT/eNOS通路有關。在高劑量秋水仙堿處理基礎上分別增加PI3K、AKT、eNOS抑制劑，秋水仙堿的心功能保護作用被明顯削弱，進一步提示秋水仙堿可能通過激活PI3K/AKT/eNOS通路在AMI大鼠中發揮心功能保護作用。

綜上所述，秋水仙堿可能通過激活PI3K/AKT/eNOS通路抑制大鼠氧化應激，對AMI大鼠發揮心功能保護作用。但本研究仍存在一定局限性，PI3K/AKT/eNOS屬于多功能、多靶點通路，秋水仙堿發揮心功能保護作用的機制仍需探討。

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（收稿日期：2022-08-25）

（本文編輯王麗）