納米金層析試紙條在檢驗檢測中的應用進展

鄭連濤,張曉霞,劉佩鈺,王志進,孫睿,牛曉琳,黃帥,王曉玥

(德州學院 醫藥與護理學院,山東 德州 253023)

1 納米金層析試紙條的發展歷程及其現狀

為保障人民合法權益和生命健康,食品安全、臨床診斷等各領域的檢測必不可少[1-2],務必發展檢測手段以起到預防和監管控制效果。20世紀80年代初,在免疫層析技術的基礎上,納米金層析試紙條檢測方法被建立。Faulk等[3]最先應用此技術檢測了大腸埃希菌Escherichia coli,1980年Unipath公司開始市售檢測人絨毛膜促性腺激素(HCG)的試紙條,該試紙條通過將納米金顆粒作為信號探針,用來檢測女性是否妊娠[4]。納米金試紙條技術的名稱來源于其使用粒徑在1～100 nm之間的金顆粒,與相應的特異性探針相結合后,被檢測物與樣品墊上的納米金顆粒偶聯,利用層析作用到達檢測線,通過顯色反應來檢測目的物質是否存在[5]。根據檢測物的不同,納米金試紙條涵蓋了核酸水平的分子生物學檢測、蛋白質水平的免疫學檢測、化合物水平的理化檢測等多種層次。該技術具有特異性強,靈敏度高,穩定性好,檢測速度快,成本低,可視化,操作簡單,污染少等一系列優點,因此在環境污染檢測,食品安全檢測,臨床診斷檢測,微生物檢測等領域應用廣泛。

2 納米金層析試紙條應用于微生物快速檢測

2.1 納米金層析試紙條與病毒檢測

病毒無細胞結構,依靠寄生在生物體內生存,進而侵染宿主的生命系統,且帶有一定的傳染性。為實現對病毒病的預防和監管,需要對病毒進行準確檢測。病毒檢測現階段主要依賴于PCR擴增技術[6],需要使用凝膠電泳檢測結果,存在著檢測時間長、操作復雜、檢測結果無法直觀可視等問題[7-8]。王之瑩等[9]將納米金試紙條用于PCR結果的檢測,建立了側流核酸測定試紙條(lateral flownucleic acid assay,LFNAA)檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)的可視化檢測方法。受PCR 技術的限制,仍無法實現現場檢測,因此有多項研究在檢測技術上進行突破。如趙錦等[10]將等溫鏈置換擴增技術(Strand Displacement Amplification,SDA)與納米金測流層析試紙條相結合,進而應用于登革熱病毒(DENV)的檢測。該方法使用等溫擴增技術代替PCR擴增,可實現現場快速檢測。

在病毒檢測實驗過程中,由于環境及生物體本身等影響,實驗結果會不可避免地出現誤差。因此在實驗中,需要增加多種檢測條件,使誤差對實驗結果的影響降到最低。宋廣萍[11]以雜交鏈式反應(Hybridization Chain Reaction,HCR)為基礎,以分子信標結構探針(MBs)和雙聯特異性核酸酶為輔助,避免了多種干擾,同時實現了三種流感病毒H1N1的可視化檢測。實時熒光定量PCR方法在新冠病毒檢測等多種病毒檢測中應用廣泛,是檢測的金標準,陳崢嶸[12]利用等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)核酸試紙條區分犬瘟熱病毒(CDV)野毒株和疫苗株,通過雙抗夾心法進行臨床驗證,發現該方法與實時熒光定量PCR相比較,更為簡單快速。新冠肺炎確診過程中,咽拭子的分子檢測是用于確認新冠病毒感染的金標準,但該技術的檢測結果假陰性率較高。Wen等[13]提出將新冠病毒核衣殼蛋白固定到一種固相LFIA條帶(LFIAs)表面,并將抗人lgG與膠體金顆粒偶聯。通過比較兩種結果,該測定結果更準確且更快速。對分子測定的不完善診斷策略進行補充,可應用于新冠肺炎患者的大量分子篩查中。

2.2 納米金層析試紙條與細菌檢測

現階段,致病菌的檢測主要依賴于細菌培養、血清學檢測、涂片檢測等,在進行核酸檢測時,往往需要PCR技術結合后續檢測手段,存在著檢測時間長,操作復雜以及對操作人員和儀器要求高等問題,納米金核酸試紙條改善了以上缺點。如陳詩勝[14]制備了PCR核酸免疫層析試紙條檢測奶牛乳房炎四種致病菌,通過肉眼直接觀察核酸擴增后的條帶結果,解決了PCR擴增后檢測產物的復雜化問題,檢測靈敏度遠遠高于普通瓊脂糖凝膠電泳檢測的靈敏度,且特異性高,可適用范圍更廣。在前期核酸擴增方面,張力支等[15]利用核酸外切酶Ⅲ循環酶切策略實現了單鏈信號放大,同時結合納米金試紙條完成檢測,李盛杰等[16]利用多酶恒溫核酸快速擴增技術(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)結合納米金試紙條對霍亂弧菌進行快速鑒定。以上方法相較于細菌培養、PCR、環介導恒溫擴增等方法,操作流程更為簡便,對環境要求更低。納米金還可與其他物質相結合,以便于核酸試紙條的檢驗。如賈慧建等[17]經實驗建立了一種新型核酸試紙條,此試紙條將鏈霉親和素與納米金結合,用來檢測蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因,對于患者的檢測更為快速、準確。與核酸檢測相比較,免疫試紙條檢測靈敏度較低。為提高靈敏度,Jia等[18]利用納米顆粒的光熱效應實現信號的放大技術,建立了一種用于大腸桿菌檢測的光熱免疫過濾試紙條,將靈敏度提高了十倍。并且該方法可通過替換抗體,擴展到其他病原體的檢測,具有普適性。

3 納米金層析試紙條應用于疾病快速檢測

近年來,隨著全球飲食結構的變化和重金屬污染事件的發生日益增多,世界各地都受到了嚴重影響,同時威脅著人類的生活和健康。因此開展疾病的預防檢測工作顯得至關重要。為進一步提高疾病檢測結果的靈敏度和工作效率,節省檢測時間,葉鈺瀅[19]通過結合重組酶介導等溫核酸擴增技術(Recombinase Aided Amplification,RAA)擴增技術和核酸試紙條,在30 min內檢測出日本血吸蟲基因片段。王海波[20]在納米金試紙條生物傳感器的基礎上,提出可視化檢測Pd2+、肝癌單核苷酸多態性(SNP)位點和慢性乙肝病毒(HBN-DNA)的方法,并且分別利用孔板放大和HCR放大策略等提高了檢測靈敏度。阿爾茲海默癥(Alzheimer disease,AD)是威脅老年群體的重要疾病之一,Liu等[21]發現AD病人體內乙酰膽堿酯酶(AChE)水平顯著降低,因此提供了一種羅丹明B修飾的納米金顆粒雙讀數(比色法和熒光法)的方法,檢測了AD小鼠腦脊液中AChE的含量,結果表明該方法較現有方法選擇性更好,且對于微量物質的檢測更為靈敏。

4 納米金試紙條在食品安全檢測方面的應用

食品安全要求無毒,無公害且符合應當有的營養物質含量,不會對食用者產生致病的危害,但某些食品添加物會損害人體健康。比如,為防止食品腐敗變質,加工時會人為地在動物性食品中添加抗生素。常芮[22]在側向層析試紙條(LFS)應用于檢測食品中抗生素的基礎上,將鳥嘌呤-胞嘧啶DNA鏈修飾到納米金顆粒上,構建了新型納米模擬酶的信號放大LFS,進一步提高了納米金試紙條在檢測抗生素含量的靈敏度。食品中微生物的生長也會影響食品質量,預富集、選擇性富集、毒素檢測等微生物傳統方法存在檢測速度慢,鑒定結果不清晰等缺點[23-25]。張云紅等[26]以食品中金黃色葡萄球菌為靶標,構建了一種巰基、生物素修飾的雙核酸適配體夾心模式的層析試紙條,完成了金黃色葡萄球菌的定性檢測。最后,農藥殘留也是影響食品安全主要因素之一,Liu等[27]預先制備了抗啶蟲脒的單克隆抗體,利用樣品中的啶蟲脒與檢測線上偶聯的啶蟲脒競爭性結合檢測液中單克隆抗體的方法區分陽性與陰性結果,建立了啶蟲脒殘留檢測技術,并成功用于市售黃瓜和蘋果農藥殘留的檢測,理論檢測限約為1 ng/mL。

5 納米金試紙條在檢測真菌毒素方面的應用

真菌毒素在谷物、水中等廣泛存在,易造成糧食以及水污染,從而對人類身體健康造成極大危害。在檢測領域,傳統的化學鑒定方法(如薄層色譜TLC)檢測復雜、準確性低,無法滿足市場對于即時檢測的要求,納米金試紙條作為一種快速檢測技術,在真菌毒素檢測方面逐漸應用于市場。鄒鵬[28]制備了球狀和花狀納米金層析試紙條,并在多種雜質存在的粗制樣品中可以快速地檢測出谷物及中藥材中三種毒素(玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素A),相較于食品檢測中馬彤彤[29]將球狀改良成花狀納米金顆粒,球狀和花狀納米金都可定性檢測玉米赤霉烯酮,避免了假陽性的出現,從而完成市場初步篩查。黃馨雨[30]研究的同類型納米金免疫層析試紙條也可在雜物中定性的檢測出伏馬毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。相比于鄒鵬檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,該方法靈敏度更高。張珊[31]采用納米金粒子與核酸適配體偶聯的方法制備出核酸適配體試紙條,來檢測黃曲霉素B1,相較于商品化檢測試劑盒,該方法成本更低、檢測范圍更廣,為檢測其他產品奠定了基礎,可以實現工業化實時檢測。Wu等[32]開發了紅曲發酵食品中桔青霉素的快速金納米顆粒免疫層析條方法,實驗表明這種方法靈敏度高、檢測快速,在檢測食品中的桔青霉素(CTN)具有很大幫助。

6 總結與展望

相比于傳統的核酸檢測方式,納米金層析試紙條技術是一種高靈敏度、高特異性、準確、有效、快速可視化的檢測技術,但其應用與推廣仍然不廣泛。第一,傳統的納米金試紙條檢測需要抗體和抗原特異性結合反應產生抗體-抗原-納米金顆粒復合物,而研制免疫層析試紙條的重要一步是制備特異性高、親和力強的單克隆抗體,需要經過復雜的雜交瘤實驗和篩選過程,開發周期長且耗費大量的人力與物力,實驗成功率低,再者抗體偶聯金標的過程較為復雜,以上都成為免疫試紙條研發的瓶頸。為了解決以上問題,首先可以嘗試基于適配體的核酸檢測方法,其次納米金核酸檢測試紙條可以根據檢測對象靈活設計核酸探針,可在生物公司訂購,避開了制備抗體的限制,為試紙條檢測的廣泛應用提供了條件。

第二,目前大多數納米金層析試紙條檢測是基于實驗室環境進行的研究,若要將此技術更廣泛、更便攜地應用于物質檢測,仍需將其應用于臨床環境中。第三,現今所研究的試紙條是對于單一檢測對象的檢測,如符娜[33]農田生產中,仍然無法同時檢測侵染植物的多種病毒,陳淑丹等[34]提出對同一檢測對象進行多項檢測時,只能逐一浸染各種測試項目的試紙條的現象。由此在試紙條探索過程中,對于可同時檢測更多種類的檢測對象的多功能甚至萬能試紙條需要我們進一步研究。第四,在定量檢測方面,目前大多數試紙條只能利用顯色方式來檢測是否含有檢測對象,如鄭方媛等[35]建立了核酸試紙條檢測與交叉引物等溫擴增技術相結合的快速檢測狐貍源性成分的方法時,只能鑒定狐貍源性成分是否存在,而對于在狐貍源性成分的定量檢測方面還需進一步研究,故對于定量檢測目的對象上的探索仍然有很長的路要走。