無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉抗氧化及部分免疫酶活性的影響

李卓 彭祖想 任同軍 韓雨哲

摘?要：為探討在無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉（Cyprinus?carpio）抗氧化性能和免疫酶活性的影響，研究設計了5組等氮等脂的飼料，分別添加不同水平的限制性氨基酸（Met∶Lys=0.318），即0%（G1組）、05%（G2組）、1.0%（G3組）、1.5%（G4組）、2.0%（G5組）。選取初始體質量為（55.54±0.09）g的鯉150尾，進行了為期8周的養殖試驗。研究結果顯示，適量補充限制性氨基酸能夠提高鯉的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧物歧化酶（T-SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性；同時降低丙二醛（MDA）含量。G4和G5組的T-AOC活性顯著高于對照組（P＜0.05），G2、G3、G4和G5組的T-SOD和CAT活性顯著高于對照組（P＜0.05），G5組的MDA含量顯著低于G1、G2和G3組（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟的ACP、AKP和LZM活性也呈上升趨勢。G3、G4和G5組的ACP活性顯著高于對照組（P＜0.05），G4和G5組的AKP和LZM活性顯著高于對照組（P＜0.05）。根據試驗結果，可以得出結論：在本試驗條件下，適量補充限制性氨基酸能夠增強鯉的抗氧化性能和部分免疫酶活性，其中2.0%的限制性氨基酸補充量效果最好。

關鍵詞：無魚粉；限制性氨基酸；鯉（Cyprinus?carpio）；抗氧化；非特異性免疫

魚粉是一種高質量的動物蛋白質來源，含有適宜的氨基酸組成，被廣泛用于養殖水產動物。然而，近年來，魚粉的供應不穩定且價格昂貴，限制了養殖業的可持續發展。因此，研究人員嘗試在實際生產中使用其他動植物蛋白質源來替代魚粉，開發無魚粉的飼料配方。然而，一般的動植物蛋白質源缺乏一些必需的氨基酸。為了平衡飼料中氨基酸的組成，研究人員通過添加晶體氨基酸來獲得理想的蛋白質來源[1-3]。雞腸粉（CGM）是一種利用新鮮雞腸加工而成的新型高質量飼料蛋白質源，其粗蛋白質和粗脂肪含量接近甚至高于魚粉，但仍缺乏賴氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）等一些必需氨基酸[4-6]。因此，添加適量的賴氨酸和蛋氨酸來平衡雞腸粉中的氨基酸組成，可以充分利用雞腸粉并使其成為理想的蛋白質來源。

研究結果顯示，當常規的動植物蛋白質原料高比例或完全替代魚粉時，水產動物的抗氧化狀態和免疫能力通常會下降[7-9]。這可能是因為動植物蛋白質原料中存在抗營養因子和（或）缺乏某些必需氨基酸。相關研究表明，適量添加賴氨酸和蛋氨酸可以提高水產動物的抗氧化能力和免疫力[10-12]。然而，目前還沒有關于使用雞腸粉作為動物蛋白質源開發無魚粉飼料的相關報道。鯉（Cyprinus?carpio）是中國重要的淡水經濟養殖品種，在水產養殖中具有重要地位。根據《2021中國漁業統計年鑒》[13]的數據，2020年中國鯉養殖產量達到289.67萬噸，較2019年增加了1.14萬噸。因此，開發無魚粉飼料對鯉養殖具有重要意義。本研究選擇鯉作為研究對象，在不添加魚粉的情況下，主要以雞腸粉作為動物蛋白質源，并補充賴氨酸和蛋氨酸。旨在研究不同限制性氨基酸添加水平對鯉抗氧化能力和免疫酶活性的影響，為雞腸粉在淡水魚飼料中的應用提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗設計和管理

試驗使用的鯉魚種購買自遼寧省丹東市當地養殖場，并在一個尺寸為4.3?m×1.5?m×1.2?m的水泥池中進行了為期2周的預養，以適應試驗環境。在預養期間，投喂對照組飼料。魚類養殖試驗在大連海洋大學遼寧省北方魚類生物學及增養殖重點實驗室的循環水池（尺寸為4.3?m×3.0?m×1.4?m）中進行，并使用了網箱進行養殖。選取初始體質量為（55.54±0.2）g的鯉150尾，隨機分為5組，每組有3個重復，每個重復中放置10尾魚，共使用15個尺寸為1.3?m×0.8?m×07?m的聚乙烯網箱。養殖周期為8周，從2021年6月19日至8月14日，每日上午9：00和下午17：00各投喂一次，以保持魚類飽食狀態。每日清理底部一次，并進行一次水的置換，置換量約占總水量的1/5。試驗使用的水源為經過曝氣處理超過24?h的自來水。試驗期間保持自然光照，水溫維持在（27.0±1.0）℃，溶解氧濃度為（70±0.5）mg/L，pH值為（7.6±0.5）。

1.2?試驗飼料及試驗設計

雞腸粉由遼寧省鞍山裕豐飼料有限公司提供，其粗蛋白含量為65.47%，粗脂肪含量為1480%。其他試驗飼料原料均在大連當地市場購買。根據表1所示的飼料配方及其蛋氨酸和賴氨酸含量，以雞腸粉和豆粕為主要蛋白源，以豆油為主要脂肪源，配制了5組等氮等脂的飼料，分別命名為G1、G2、G3、G4、G5。參考鯉的營養需求[14]和原料中蛋氨酸和賴氨酸的含量確定蛋氨酸與賴氨酸的比值為0.318，并相應添加了限制性氨基酸。各組限制性氨基酸（Met∶Lys=0318）的添加量分別為0%（G1組，對照組）、05%（G2組）、1.0%（G3組）、1.5%（G4組）和2.0%（G5組）。所有飼料原料經過60目篩網過濾，混合均勻后，使用制粒機制成2?mm大小的顆粒飼料。飼料在42?℃烘箱中烘干至水分含量為10%，隨后裝入自封袋中，并儲存在-20?℃的冰箱中保存。

1.3?樣品采集及指標測定

試驗結束后，試驗魚禁食24?h，并使用50?mg/L的MS-222溶液麻醉。從每個網箱中隨機選取5尾魚，將其肝臟樣品提取至冰盤中，并進行混合。混合后的樣品裝入管中，在-80?℃保存待測。為了分析鯉肝臟的抗氧化指標和免疫酶活性，將肝臟樣品按照樣品質量與生理鹽水體積1∶9的比例，在冰水浴中使用玻璃研磨器進行研磨。隨后，將研磨后的樣品注入離心管中，在4?℃、3?500?r/min、10?min的高速離心下，取上清液進行后續測定。使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測定了鯉肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、肝臟酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活性（LZM）。

1.4?數據處理

試驗數據以平均值±標準誤（Mean?±?SE）的形式呈現，并使用GraphPad?Prism軟件進行圖表繪制。使用IBM的SPSS?25.0軟件進行單因素方差分析（One-way?ANOVA），并使用Duncan's方法進行多重比較，以分析各處理組之間的顯著性差異。將P值小于0.05的結果視為具有顯著差異。

2?結果

2.1?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

根據表3的結果顯示，當無魚粉飼料中添加限制性氨基酸后，鯉肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性呈現上升趨勢。具體來說，G4和G5組的T-AOC活性顯著高于對照組（P＜005），而G2、G3、G4和G5組的T-SOD和CAT活性也顯著高于對照組（P＜0.05）。同時，隨著限制性氨基酸補充水平的增加，丙二醛（MDA）含量呈現下降趨勢。此外，G5組的MDA含量顯著低于G1、G2和G3組（P＜0.05）。綜上所述，表3結果表明無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟的抗氧化能力產生影響。

表3?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

組別總抗氧化能力T-AOC/U·mg-1prot總超氧物歧化酶T-SOD/U·mg-1prot過氧化氫酶CAT/U·mg-1prot?丙二醛MDA/nmol·mg-1prot

G117.53±0.77a108.12±3.72a10.42±0.22a5.67±0.45c

G223.11±0.52ab135.52±1.61b11.89±0.19b4.90±0.36bc

G324.20±0.21ab136.82±1.00b12.18±0.21b4.18±0.37b

G436.28±3.94b172.32±4.79c14.30±0.12c3.86±0.07ab

G536.60±9.58b177.81±2.72c14.67±0.12c2.95±0.18a

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異（P<0.05），標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟免疫酶活性的影響

根據圖1至圖3的結果顯示，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（LZM）活性具有顯著影響（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟中的ACP、AKP和LZM活性呈現上升趨勢。具體而言，G3、G4和G5組的ACP活性顯著高于對照組（P＜0.05），而G4和G5組的AKP和LZM活性也顯著高于對照組（P＜0.05）。

3?討論

3.1?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟抗氧化能力的影響

水產動物具有抗氧化酶保護系統，包括T-SOD、CAT和GSH-Px等酶，可以清除過量的氧化自由基，減少脂質氧化引起的損害。脂質過氧化損傷的生物標志物是MDA，可以間接反映細胞的損傷程度[16]。相關研究已經表明，適量補充賴氨酸和蛋氨酸的飼料可以增強建鯉（Cyprinus?carpio?var.?Jian）[17]、草魚（Ctenopharyngodon?idellus）[18]和黃顙魚（Pelteobagrus?fulvidraco）[19]等水產動物的抗氧化能力。另外，遲淑艷等[20]的研究顯示，適量添加蛋氨酸的飼料可以增強斜帶石斑魚（Epinephelus?coioides）肝臟的SOD和CAT活性，提高其抗氧化能力。Ahmed等[21]的研究發現，適量添加賴氨酸的飼料可以增強虹鱒（Oncorhynchus?mykiss）中SOD和CAT的活性，降低MDA含量。此外，Huang等[18]認為適量添加賴氨酸的飼料可以調節草魚的抗氧化酶相關基因表達，增強其抗氧化酶活性。本次試驗的結果與前人的研究相一致，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后，鯉肝臟中的T-AOC、T-SOD和CAT活性呈上升趨勢，MDA含量則呈下降趨勢。這表明適量補充限制性氨基酸可以提高鯉肝臟的抗氧化能力，并降低MDA含量。具體而言，G5組的T-AOC、T-SOD和CAT活性顯著高于其他組，MDA含量顯著低于其他組，這表明2.0%限制性氨基酸補充量對于提高鯉肝臟的抗氧化能力有最佳效果。

3.2?無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟免疫酶活性的影響

魚類屬于低等脊椎動物，非特異性免疫系統在機體防御中極其重要，免疫酶活性，如ACP、AKP和LZM等，可以反映出機體的免疫能力[22]。李小軍[23]研究發現，適量添加蛋氨酸的飼料能夠提高虎龍雜交斑（E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）血清中LZM活性和免疫球蛋白（lgM）濃度，刺激頭腎中HSP70基因的表達，增強龍虎雜交斑的免疫能力。類似地，李雪吟[24]的研究顯示，適量添加賴氨酸的飼料能夠增強草魚腸道中LZM和ACP的活性，上調Hepcidin和LEAP-2基因的表達，增強草魚的免疫能力。在本試驗中，隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉肝臟中的ACP、AKP和LZM活性呈上升趨勢。G5組的ACP、AKP和LZM活性顯著高于其他組，這表明無魚粉飼料中適量添加限制性氨基酸可以提高鯉肝臟的免疫酶活性。Hu等[25]的研究指出，飼料中賴氨酸的缺乏會上調草魚皮膚、脾臟和頭腎中IL-1β促炎癥因子基因的表達，從而引發炎癥。Yang等[26]的研究也表明，賴氨酸可以作為一種營養物質降低大口黑鱸（Micropterus?salmoides）促炎癥因子mRNA的表達，從而減少炎癥反應。另外，賴氨酸的補充還可以在一定程度上增強機體對氧化自由基的清除能力，降低炎癥反應，這與本試驗中抗氧化酶和免疫酶活性的結果相一致。基于以上研究和試驗結果，可以得出結論，適量補充限制性氨基酸可以顯著提高鯉的免疫酶活性，并將對鯉的免疫能力產生積極影響。

4?結論

在本試驗條件下，適量補充限制性氨基酸到無魚粉飼料中能夠增強鯉肝臟的抗氧化能力和部分免疫酶活性，其中2.0%的補充量效果最佳。

參考文獻：

[1]

陳庭.雞肉粉替代魚粉飼料中添加包被氨基酸對凡納濱對蝦生長的影響[D].廈門：集美大學，?2015.

[2]?冷向軍，李小勤，?丙愛，等.魚類對晶體氨基酸利用的研究進展[J].水生生物學報，2009，?33（1）：119-123.

[3]?劉韜.發酵豆粕替代魚粉及添加晶體精氨酸和蛋氨酸對凡納濱對蝦生長和抗應激能力的免疫調節[D].上海：上海海洋大學，?2018.

[4]?彭祖想，嚴林，衛力博，等.雞腸粉替代魚粉對鯉生長、消化及免疫相關理化指標的影響[J].飼料工業，?2021，?42（22）：52-59.

[5]?HILL?J?C，ALAM?M?S，?WATANABE?W?O，et?al.Replacement?of?Menhaden?fish?meal?by?poultry?by-product?meal?in?the?diet?of?juvenile?red?porgy[J].North?American?Journal?of?Aquaculture，?2019，?81（1）：81–93.

[6]?CHAKLADER?M?R，FOTEDAR?R，HOWIESON?J，et?al.The?ameliorative?effects?of?various?fish?protein?hydrolysates?in?poultry?by-product?meal?based?diets?on?muscle?quality，?serum?biochemistry?and?immunity?in?juvenile?barramundi，?Lates?calcarifer[J].Fish?and?Shellfish?Immunology，2020，104（3）：567–578.

[7]?賈高旺，郭冉，張宇，等.家禽副產物酶解肽部分替代魚粉對大菱鲆生長性能、消化指標和特異性免疫指標的影響[J].動物營養學報，2019，31（5）：2201-2211.

[8]?王婧瑤，吳莉芳，王東，等.豆粕替代魚粉對黃金鯽生長、消化酶活力及非特異性免疫指標的影響[J].吉林農業大學學報，2022，44（1）：104-111.

[9]?閆曉波，何昊倫，譚北平，等.去皮豆粕替代魚粉對多鱗鱚生長性能、腸道消化酶活性和肝臟免疫指標的影響[J].動物營養學報，2019，31（9）：4118-4130.

[10]?宋嬌.混合植物蛋白替代魚粉對雜交鱘幼魚生長和免疫機能的影響研究[D].貴陽：貴州大學，2016.

[11]?YAGHOUBI?M，TORFI?MOZANZADEH?M，MARAMMAZI?J?G，et?al.Effects?of?dietary?essential?amino?acid?deficiencies?on?the?growth?performance?and?humoral?immune?response?in?silvery‐black?porgy?（Sparidentex?hasta）?juveniles[J].?Aquaculture?Research，2017，48（10）：5311-5323.

[12]?LI?X，MU?W，WU?X，et?al.The?optimum?methionine?requirement?in?diets?of?juvenile?hybrid?grouper?（Epinephelus?fuscoguttatus♀×?Epinephelus?lanceolatus♂）：?Effects?on?survival，?growth?performance，?gut?micromorphology?and?immunity[J].Aquaculture，2020，520：735014.

[13]?農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.2021中國漁業統計年鑒[M].北京：中國農業出版社，2021：41.

[14]?美國科學院國家研究委員會.魚類與甲殼類營養需要[M]．麥康森，李鵬，趙建民，譯.北京：科學出版社，2015：360-361.

[15]?石立冬，衛力博，翟浩杰，等.不同蛋白源飼料中添加限制性氨基酸對紅鯽Carassius?auratus生長、消化及免疫能力的影響[J].水產學雜志，2021，34（2）：56-64.

[16]?ELMADA?C?Z，HUANG?W，JIN?M，et?al.The?effect?of?dietary?methionine?on?growth，?antioxidant?capacity，?innate?immune?response?and?disease?resistance?of?juvenile?yellow?catfish?（Pelteobagrus?fulvidraco）[J].Aquaculture?Nutrition，2016，22（6）：1163-1173.

[17]?CHEN?Y，YANG?Y，WANG?Q，et?al.The?effects?of?methionine‐enriched?Artemia?nauplii?on?growth，?amino?acid?profiles，?absorption?enzyme?activity?and?antioxidant?capability?of?common?carp?（Cyprinus?carpio?var.?Jian）?larvae[J].Aquaculture?Research，2019，50（1）：1-8.

[18]?HUANG?D，MAULU?S，REN?M，et?al.Dietary?lysine?levels?improved?antioxidant?capacity?and?immunity?via?the?TOR?and?p38?MAPK?signaling?pathways?in?grass?carp，?Ctenopharyngodon?idellus?fry[J].Frontiers?in?Immunology，2021，12：122.

[19]?JIANG?J，XU?S，FENG?L，et?al.Lysine?and?methionine?supplementation?ameliorates?high?inclusion?of?soybean?meal?inducing?intestinal?oxidative?injury?and?digestive?and?antioxidant?capacity?decrease?of?yellow?catfish[J].Fish?physiology?and?biochemistry，2018，44（1）：319-328.

[20]?遲淑艷，王學武，譚北平，等.飼料蛋氨酸對斜帶石斑魚生長性能、抗氧化及糖異生相關酶活性的影響[J].水生生物學報，2015，39（4）：645-652.

[21]?AHMED?I，AHMAD?I.Dietary?lysine?modulates?growth?performance，?haemato‐biochemical?indices，?non‐specific?immune?response，?intestinal?enzymatic?activities?and?antioxidant?properties?of?rainbow?trout，?Oncorhynchus?mykiss?fingerlings[J].Aquaculture?Nutrition，2021，27：124-139.

[22]?FIRDAUS-NAWI?M，ZAMRI-SAAD?M.Major?components?of?fish?immunity：?A?review[J].Pertanika?Journal?of?Tropical?Agricultural?Science，2016，39（4）.

[23]?李小軍.飼料賴氨酸和蛋氨酸對虎龍雜交斑幼魚生長、飼料利用、腸道形態學和免疫的影響[D].海口：海南大學，2019.

[24]?李雪吟.賴氨酸對草魚腸道免疫和結構屏障作用及其機制研究[D].雅安：四川農業大學，2017.

[25]?HU?Y，FENG?L，JIANG?W，et?al.Lysine?deficiency?impaired?growth?performance?and?immune?response?and?aggravated?inflammatory?response?of?the?skin，?spleen?and?head?kidney?in?grown-up?grass?carp?（Ctenopharyngodon?idella）[J].Animal?Nutrition，2021，7（2）：556-568.

[26]?YANG?P，WANG?W，CHI?S，et?al.Effects?of?dietary?lysine?on?regulating?GH-IGF?system，?intermediate?metabolism?and?immune?response?in?largemouth?bass?（Micropterus?salmoides）[J].Aquaculture?Reports，2020，17：100323.