貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪成熟特性及生物活性的影響

劉同吉,王藝會(huì),薛瑞,任青霞,楊貞耐

(北京工商大學(xué),北京老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京,100048)

傳統(tǒng)上制作干酪所使用的凝乳酶主要從小牛或小羊等反芻動(dòng)物的皺胃中提取。凝乳酶不僅能促使牛乳凝結(jié),而且在干酪成熟中發(fā)揮重要作用[1]。隨著干酪消費(fèi)的不斷增長(zhǎng),尋求不同來(lái)源凝乳酶滿足干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展已成為我國(guó)乳制品行業(yè)發(fā)展的新挑戰(zhàn)[2]。通常大多數(shù)植物來(lái)源的凝乳酶被證明不適用于干酪的生產(chǎn),這類凝乳酶因具有較強(qiáng)的蛋白水解能力而導(dǎo)致干酪產(chǎn)量下降,并在干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生苦味和質(zhì)地缺陷[3];同時(shí)酶的生產(chǎn)可能受到植物栽培和氣候變化等因素的限制。微生物來(lái)源的凝乳酶具有來(lái)源廣泛、易于獲得、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn),這使得微生物凝乳酶成為最具潛力的凝乳酶制劑[4]。

不同微生物來(lái)源凝乳酶的蛋白水解特性差異較大,其在干酪成熟過(guò)程中對(duì)乳蛋白的水解程度不同,導(dǎo)致干酪的品質(zhì)特性不同[5]。ZHAO等[6]研究發(fā)現(xiàn),與利用商業(yè)凝乳酶制作的切達(dá)干酪相比,利用從傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中分離出的微生物凝乳酶所制作的切達(dá)干酪水分含量更低,且在成熟60～90 d后干酪變得更柔軟,揮發(fā)性化合物濃度更高。利用解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶制備切達(dá)干酪和馬蘇里拉干酪,其在干酪成熟過(guò)程中的適度蛋白水解,使干酪保持質(zhì)構(gòu)和功能特性[7]。用芽孢桿菌spp.P45凝乳酶生產(chǎn)的藜麥粉奶油干酪,具有高保水性[8]。微生物凝乳酶的蛋白水解活性不僅影響干酪的理化特性,而且通過(guò)酶解乳蛋白釋放不同的生物活性肽[9]。MUSHTAQ等[10]研究發(fā)現(xiàn)使用細(xì)菌凝乳酶制作的干酪其抗氧化能力和金屬離子螯合能力顯著優(yōu)于使用動(dòng)物凝乳酶和植物凝乳酶制作的干酪,這與微生物凝乳酶水解蛋白釋放的活性肽有關(guān)。

本研究前期從中國(guó)傳統(tǒng)酒曲中篩選得到1株高產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌菌株,經(jīng)鑒定命名為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)YH-1(CGMCC No.25636),該菌株產(chǎn)的凝乳酶的比酶活為5 762.724 SU/mg,經(jīng)LC-MS/MS鑒定,確定該酶為一種金屬蛋白酶,該酶通過(guò)裂解κ-酪蛋白中Lys 21-Ile 22和Tyr 30-Val 31處的肽鍵導(dǎo)致牛乳凝固[11]。擬利用貝萊斯芽孢桿菌YH-1發(fā)酵制備的凝乳酶應(yīng)用于切達(dá)干酪加工,研究干酪成熟過(guò)程中各項(xiàng)理化指標(biāo)、游離氨基酸含量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等,以及干酪生物活性包括抗氧化活性、降血糖活性和金屬螯合能力的變化,目的在于進(jìn)一步研究不同微生物來(lái)源凝乳酶應(yīng)用于干酪加工的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛奶(脂肪3.2%,蛋白質(zhì)3.06%,乳糖4.33%),北京三胖奶牛場(chǎng);商品發(fā)酵劑(R-704)和凝乳酶(Stamix 1150),科漢森有限公司;氯化鈉和氯化鈣均為食品級(jí)。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶的制備

制備方法參考ZHAO等[12],略有修改。將貝萊斯芽孢桿菌YH-1在YPD培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h,離心(10 000×g, 4 ℃, 30 min),收集上清液。在4 ℃條件下向粗酶液中緩慢加入(NH4)2SO4使其飽和度達(dá)到60%。在低溫條件下(4 ℃)靜置12 h后離心(10 000×g,30 min)取上清液,對(duì)上清液進(jìn)行鹽析處理,收集沉淀后用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=6.8)溶解,在4 ℃冰箱里透析48 h(透析袋8 000～14 000 Da),每8 h換一次水,冷凍干燥得到粗酶。將粗酶溶解于Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=6.8)中,然后通過(guò)DEAE-FF陰離子交換柱純化凝乳酶,上樣量為5 mL,再用含NaCl的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫(0～1 mol/L),流速為3 mL/min,最后收集具有高蛋白酶活性的餾分,經(jīng)脫鹽、超濾后制備純化凝乳酶。

1.3 儀器與設(shè)備

干酪加工實(shí)驗(yàn)設(shè)備,自制;7090A-7000型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀,美國(guó)Aglient公司;CR21GⅢ冷凍離心機(jī),日本Hitachi公司;CT3型質(zhì)構(gòu)儀,美國(guó)Brookfield公司;Kjeltec8100型凱氏定氮儀,美國(guó)FOSS公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 切達(dá)干酪制作工藝

切達(dá)干酪制作參考WANG等[13]的方法,略有修改。利用同批次的生牛乳制作3組干酪,每組制作3個(gè)平行樣品。分別使用混合酶[YH-1凝乳酶30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和商品酶70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),干酪B]和YH-1凝乳酶(干酪C)制作的切達(dá)干酪作為實(shí)驗(yàn)組,以商品酶制作的干酪(干酪A)作為對(duì)照組。

工藝流程如下:

原料乳→巴氏殺菌(65 ℃,30 min)→32 ℃加入發(fā)酵劑(1.5%)→32 ℃發(fā)酵30 min→加入凝乳酶(10 000 SU/L)及CaCl2(0.005 g/100 mL)→32 ℃凝固45 min→切割,靜置5 min,39 ℃排乳清(pH=6.1～6.2)→保持凝塊溫度在36 ℃,至pH=5.2～5.3,15 min翻一次面→入模擠壓成型→鹽水(20% NaCl)浸泡20 min→擦干表面水分,壓模過(guò)夜→真空包裝→4 ℃成熟12周

1.4.2 切達(dá)干酪理化指標(biāo)

干酪得率計(jì)算方法如公式(1)所示:

(1)

依據(jù)GB 5009.3—2016測(cè)定干酪水分含量;根據(jù)GB 5009.6—2016的方法測(cè)定干酪脂肪含量;根據(jù)AOAC 920.123 (2001) 凱氏定氮法測(cè)定干酪蛋白質(zhì)含量;干酪鹽含量參照邱婷等[14]方法測(cè)定。pH值測(cè)定方法如下:將6 g樣品溶解在6 mL的溫水中(45 ℃),孵育30 min后離心(6 000×g,10 min),去除脂肪,取下層溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 切達(dá)干酪微生物指標(biāo)測(cè)定

將5 g干酪溶解在45 mL的無(wú)菌水中,磁力攪拌1 h后用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋,稀釋后的樣品溶液涂布在M17固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.4 pH 4.6可溶性氮與12%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性氮含量的測(cè)定

根據(jù)GUO等[15]方法,稍微改動(dòng)。將20 g干酪溶解在40 mL的無(wú)菌水中,調(diào)節(jié)溶液pH至4.6后進(jìn)行孵育(40 ℃,1 h),離心(6 000×g,10 min)后取出下層溶液,定容至100 mL,取出10 mL放入凱氏定氮消化管中測(cè)定樣品的氮含量。

取上述pH 4.6可溶性氮溶液,加入10 mL的TCA(12%),混勻后室溫靜置1 h,離心(6 000×g,10 min)取10 mL溶液進(jìn)行消化測(cè)定。

1.4.5 干酪質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定干酪樣品的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。測(cè)試前將樣品在25 ℃下放置30 min。質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)參數(shù)為:探頭型號(hào)TA3/100,下降速度5.0 mm/s,測(cè)試速度1.0 mm/s,形變百分量50%,觸發(fā)力0.2 N,間隔時(shí)間0 s。

1.4.6 干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

參照王亞?wèn)|等[16]方法。用GC-MS法測(cè)定干酪風(fēng)味。將5 g磨碎后的干酪加到30 mL萃取瓶中,在50 ℃的水浴鍋中平衡20 min,固相微萃取40 ℃吸附40 min后插入進(jìn)樣口解析(250 ℃,10 min)。

1.4.7 干酪游離氨基酸含量的測(cè)定

依據(jù)ZHAO等[6]方法處理樣品:在樣品中加入800 μL乙腈水(體積分?jǐn)?shù)為50%),振蕩后超聲30 min再靜置60 min,離心(12 000×g,10 min)取上清液過(guò)0.22 μmol/L濾膜后上機(jī)檢測(cè)和用50%乙腈水稀釋50倍上機(jī)檢測(cè)。

UPLC-Qtrap-MS方法:色譜柱 (BEH Amide Column, 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)柱溫40 ℃,流速0.25 mL/min;流動(dòng)相:A-水(0.1%甲酸),B-乙腈(0.1%甲酸);運(yùn)行12 min,進(jìn)樣4 μL。

質(zhì)譜條件:ESI離子源;氣簾氣35 arb;碰撞氣7 arb;離子噴霧電壓4 500 V;離子源溫度450 ℃;離子源氣體55 arb;離子源氣體55 arb。

1.4.8 干酪生物活性的測(cè)定

1.4.8.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參照AYYASH等[17]方法,制備不同成熟期干酪的多肽樣品(按上述1.4.4節(jié)方法得到的pH 4.6可溶性蛋白溶液,過(guò)0.22 μm濾膜)測(cè)試多肽樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.4.8.2 抗氧化活性的測(cè)定

分別對(duì)干酪不同成熟階段取樣制備的多肽樣品測(cè)定其DPPH自由基清除率和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。

DPPH自由基清除率參考FAN等[18]方法。

采用ABTS測(cè)定試劑盒測(cè)定多肽樣品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力,ABTS陽(yáng)離子自由基吸光度測(cè)定波長(zhǎng)為734 nm或405 nm。

1.4.8.3 金屬鐵離子螯合能力的測(cè)定

按MIAO等[19]方法將樣品溶解于pH 6.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液,取250 μL樣品,加入25 mmol/L的硫酸亞鐵溶液20 μL,37 ℃水浴30 min,取出后加入2.5 mmol/L 的菲啰嗪溶液15 μL 進(jìn)行混合,10 000 r/min離心10 min,于562 nm處測(cè)定其吸光度。用無(wú)離子水作為空白對(duì)照。鐵離子的螯合能力計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:B0為對(duì)照組的吸光度(使用水代替樣品);B1為樣品的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)干酪樣品至少3次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果用x±s表示,采用方差分析檢驗(yàn)各樣本間的顯著性差異,P<0.05,差異顯著,采用Origin 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪的理化指標(biāo)

由表1可知,干酪A和干酪B的得率、總蛋白含量以及氯化鈉含量之間沒(méi)有顯著差別(P>0.05),而干酪C的得率和脂肪含量略低于干酪A,蛋白質(zhì)含量高于干酪A,這可能是由于YH-1凝乳酶水解蛋白質(zhì)后,蛋白網(wǎng)絡(luò)被破壞,部分脂肪流失,干酪的得率也隨之下降[20]。

表1 切達(dá)干酪的得率及主要組成成分比較Table 1 Comparison of the yield and main components of Cheddar cheeses

2.2 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中的pH、水分及微生物變化

如圖1-A可知,在成熟期間干酪整體的pH值呈下降趨勢(shì),這可能是由于貯藏期內(nèi)干酪中酪蛋白水解產(chǎn)生大量游離的氨基和羧基,導(dǎo)致質(zhì)子釋放到周圍的介質(zhì)中,使pH值降低。另外,成熟期間脂肪分解所產(chǎn)生的游離脂肪酸同樣會(huì)使干酪pH值降低[21]。干酪C的pH值始終低于干酪A和干酪B,可能是因?yàn)閅H-1凝乳酶的蛋白水解作用可以增強(qiáng)干酪中乳酸菌的代謝活動(dòng),其產(chǎn)酸能力增加。如圖1-B可知,干酪C的水分含量在成熟期內(nèi)顯著低于(P<0.05)干酪A和干酪B。在成熟前期,3組干酪的水分含量有上升的趨勢(shì),且在第8周水分含量最高,可能是因?yàn)楦衫抑袣埩舻牡鞍酌钙茐牧说鞍踪|(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使干酪中的弱結(jié)合水轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x水[22]。由于干酪C的pH較低且接近酪蛋白的等電點(diǎn),這促進(jìn)了干酪中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用,進(jìn)一步使蛋白質(zhì)基質(zhì)的持水能力降低,從而導(dǎo)致奶酪的水分含量下降[23]。圖1-C結(jié)果表明,3組干酪的活菌數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。前3周乳酸菌數(shù)量明顯增加,這可能是由于干酪中的乳酸菌在干酪成熟初期可以利用乳糖進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。在干酪成熟后期,B組的活菌數(shù)顯著高于(P<0.05)A組和C組,可能是因?yàn)榛旌夏槊傅乃猱a(chǎn)物更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。

A-pH值;B-水分含量;C-活菌數(shù)

2.3 pH 4.6可溶性氮及12%TCA可溶性氮的變化

干酪蛋白的初級(jí)水解可以用pH 4.6可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示,pH 4.6可溶性氮含量越高,表明實(shí)驗(yàn)干酪的初級(jí)蛋白水解水平較高[24]。由圖2-A可知,在成熟期間,所有實(shí)驗(yàn)組干酪的pH 4.6可溶性氮含量總體呈上升趨勢(shì),在第8周時(shí),干酪C的pH 4.6可溶性氮含量開始迅速增加,顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B。在第12周,干酪A、干酪B和干酪C的pH 4.6可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.8%、23.45%和25.9%。該結(jié)果表明YH-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪乳蛋白的分解能力較強(qiáng)。12%TCA可溶性氮反映干酪蛋白的二次水解,可代表游離氨基酸和小分子肽(2～20個(gè)殘基)的含量[25]。另外,12%TCA可溶性氮的增加與凝乳酶水解蛋白能力有關(guān),凝乳酶水解蛋白能力越高,干酪在成熟過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生更多的12%TCA可溶性氮[26]。3組干酪的12%TCA可溶性氮在0～12周呈上升趨勢(shì),干酪A由3.45%上升至7.15%,干酪B由3.4%上升至7.8%,干酪C由3.65%上升至7.2%,且在第12周B組干酪的12%TCA可溶性氮含量顯著高于(P<0.05)A組和C組。該結(jié)果表明混合凝乳酶對(duì)干酪的蛋白水解作用產(chǎn)生更多的游離氨基酸和小分子肽。

A-pH 4.6可溶性氮;B-12%TCA可溶性氮

2.4 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的變化

在成熟期間,干酪C的硬度、彈性、咀嚼性和膠著性總體上低于干酪A和干酪B,且在整個(gè)成熟期內(nèi)干酪C的硬度都顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B,可能是因?yàn)楦衫褻脂肪和水分含量較低造成的(見(jiàn)表1)。LI等[27]研究發(fā)現(xiàn)低脂干酪的硬度、膠黏度和咀嚼性高于全脂干酪,因?yàn)橹究梢宰鳛橐环N柔軟的填充物鑲嵌入酪蛋白網(wǎng)絡(luò)中[28]。在成熟過(guò)程中,由于酪蛋白的不斷水解,3組干酪的硬度、咀嚼性和膠著性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3)。由于干酪中蛋白酶的作用,干酪中總酪蛋白組分和酪蛋白單體組分(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和αs2-酪蛋白)含量不斷下降,酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)坍塌,干酪的硬度、內(nèi)聚性與彈性隨之降低。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)隨著酪蛋白和大片段肽鍵的斷裂,蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸減弱,質(zhì)構(gòu)特性也隨之改變,其質(zhì)構(gòu)特性與可溶性肽和完整酪蛋白隨時(shí)間的變化趨勢(shì)相似[29]。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合凝乳酶干酪的質(zhì)構(gòu)特性與商品凝乳酶干酪沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

A-硬度;B-彈性;C-咀嚼性;D-膠著性

2.5 游離氨基酸含量的變化

在干酪成熟過(guò)程中,游離氨基酸含量與殘留凝乳酶的活性有關(guān)。殘留的凝乳酶會(huì)繼續(xù)水解干酪中的酪蛋白,產(chǎn)生小分子的肽,并進(jìn)一步水解生成氨基酸。從表2可知,成熟12周干酪的游離氨基酸含量均高于新鮮干酪,說(shuō)明干酪在成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)深度水解作用加強(qiáng)。3組干酪中,干酪B中的游離氨基酸含量相對(duì)較高,其次是干酪C,干酪A中的相對(duì)較少。在8種人體必需氨基酸中,干酪B的纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸的含量最多,干酪C的蘇氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和異亮氨酸含量最多;在一些非必需氨基酸中,干酪B的脯氨酸、酪氨酸和谷氨酸含量最多,干酪C的絲氨酸、丙氨酸和天門冬氨酸含量最多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用YH-1凝乳酶和混合凝乳酶制成的干酪,相比于對(duì)照組能產(chǎn)生更多的游離氨基酸。游離氨基酸對(duì)干酪的滋味和香味都有促進(jìn)作用[30]。

表2 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中游離氨基酸的變化 單位:ng/mgTable 2 Changes of free amino acids in Cheddar cheeses during ripening

2.6 切達(dá)干酪成熟前后的風(fēng)味變化

對(duì)3組切達(dá)干酪不同成熟時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了SPME-GC-MS分析。3組干酪共檢測(cè)出39種風(fēng)味物質(zhì),其中11種醇類、6種酮類、12種酸類、4種酯類、其他類6種。隨著成熟期的延長(zhǎng),風(fēng)味化合物種類無(wú)明顯差別,附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036210)顯示了3組干酪在1、4、8、12周時(shí)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量比的變化。

醇類化合物是組成干酪中風(fēng)味物質(zhì)的重要成員,主要通過(guò)氨基酸代謝、甲基酮還原、乳糖代謝和亞油酸、亞麻酸降解等生化反應(yīng)生成[31]。其中乙醇是3組干酪醇類風(fēng)味物質(zhì)的主要成分,3組干酪在成熟期內(nèi)的乙醇含量呈現(xiàn)略微減少的趨勢(shì),可能是由于貯存期內(nèi)干酪中發(fā)生醇解和酯化反應(yīng),降低了乙醇的含量[32]。RICHOUX等[33]研究發(fā)現(xiàn),乙醇限制了瑞士奶酪中乙酯的合成,在干酪中添加400 μg/g的乙醇后,乙醇與奶酪中的酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng),生成乙酯等風(fēng)味物質(zhì),證明了乙醇在干酪中含量的降低有利于其風(fēng)味物質(zhì)的增加。

酮類化合物的感知閾值低,可賦予干酪水果香味、花香味和霉味,主要通過(guò)多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝產(chǎn)生[34]。3組干酪中均檢出3-羥基-2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、2-十三酮和2,3-丁二酮。其中3-羥基-2-丁酮由檸檬酸代謝生成,賦予干酪奶油香味,在整個(gè)成熟期間的含量:B干酪>C干酪>A干酪;由干酪中乳酸菌代謝生成的2-壬酮賦予了干酪水果味;由亞油酸氧化后生成的2-壬酮使干酪具有奶油味和桃香味等[16]。

脂肪酸類化合物不僅是干酪中主要的風(fēng)味物質(zhì),也是酯類、醛類和甲基酮類等其他風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì),因此對(duì)干酪的風(fēng)味的形成有著重要的作用[31]。其中辛酸、己酸、乙酸和癸酸在3組干酪中含量較高,這些短鏈的脂肪酸類化合物閾值較低,在較高的濃度情況下會(huì)產(chǎn)生令人不悅的風(fēng)味,如酸敗、哈喇等味道[35]。第4、8、12周,干酪B和C的乙酸、丁酸和辛酸的含量均高于干酪A,說(shuō)明混合凝乳酶對(duì)于干酪酸類風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)較大。

酯類化合物是奶酪中常見(jiàn)的揮發(fā)性化合物,賦予干酪令人愉快的水果味,其風(fēng)味可以降低因游離脂肪酸含量較高而產(chǎn)生的腐臭氣味。酯類化合物可以通過(guò)不同的反應(yīng)形成,包括酯化反應(yīng)和酯交換[32]。成熟過(guò)程中,3組干酪酯類化合物檢出含量較低,其中干酪B和C中共檢出4種酯類,干酪A中檢測(cè)出3種酯類。干酪A在第0周時(shí)酯類物質(zhì)含量較高,隨著成熟期的延長(zhǎng),干酪B和C的含量均高于干酪A。

2.7 干酪成熟過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析

對(duì)不同凝乳酶干酪不同成熟期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量變化進(jìn)行熱圖分析,如圖4所示。不同凝乳酶制作的干酪風(fēng)味物質(zhì)存在差異。第1周的干酪A未和其他組別的干酪歸為一類,說(shuō)明成熟初期干酪A的風(fēng)味物質(zhì)與其他干酪差別較大。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),干酪A(成熟4、8和12周)與干酪B(成熟1周)可聚為一類;成熟1、4和8周的干酪C可聚為一類;干酪B(成熟4、8和12周)與干酪C(成熟12周)可聚為一類。結(jié)果表明,分別用YH-1凝乳酶與商業(yè)凝乳酶所制作的切達(dá)干酪在風(fēng)味成分上存在差異,而用2種混合凝乳酶所制作的干酪B在不同成熟時(shí)期可以分別與干酪A與干酪C聚類,說(shuō)明YH-1凝乳酶有著部分代替商業(yè)凝乳酶制作切達(dá)干酪的潛力。

圖4 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析

2.8 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中生物活性的變化

3組干酪在成熟過(guò)程中生物活性的變化如圖5所示。對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用歸因于蛋白酶水解產(chǎn)生的生物活性肽,抑制α-葡萄糖苷酶被認(rèn)為是通過(guò)減少碳水化合物水解來(lái)控制糖尿病的有效方法[36]。α-葡萄糖苷酶的抑制率(圖5-A)隨著成熟期的延長(zhǎng)而逐漸升高,抑制率逐漸上升至60%以上,3組干酪的變化趨勢(shì)一致,無(wú)顯著性差別(P>0.05),由此說(shuō)明YH-1凝乳酶不會(huì)影響干酪的降血糖活性。

圖5 切達(dá)干酪成熟過(guò)程中的生物活性變化

干酪B和C的DPPH自由基清除率(圖5-B)在第3周達(dá)到最大,分別為65.78%和62.12%,之后有所下降,干酪A在第四周達(dá)到最大,為56.86%,然后開始下降;3組干酪的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率(圖5-C)均處于上升趨勢(shì),干酪C的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率在前8周顯著高于(P<0.05)A組,在第8周達(dá)到最大,為71.39%,A、B兩組在第12周達(dá)到最大,分別為65.36%和72.91%,說(shuō)明干酪的成熟期以及不同的凝乳酶都會(huì)影響干酪的抗氧化活性,且YH-1凝乳酶組和混合凝乳酶組干酪的抗氧化活性優(yōu)于商品酶組干酪。AYYASH等[17]研究了用牛奶和駱駝奶所制的干酪在成熟期間抗氧化活性的變化,發(fā)現(xiàn)在干酪在成熟第28天時(shí),干酪的DPPH自由基清除率和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率顯著增加。趙笑等[7]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率,細(xì)菌凝乳酶制作的干酪顯著優(yōu)于對(duì)照組干酪,尤其是在干酪成熟的第4～8周,DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率最高分別為16.49%和78.38%。

干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生的多肽或氨基酸通過(guò)螯合作用,能夠提高鐵的生物利用率和吸收率[19]。如圖5-D所示,干酪A和B的鐵離子螯合能力均在第4周達(dá)到最大,分別為53.24%和56.11%,干酪C則在第12周達(dá)到最大,顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B,為60.06%。TIMON等[37]發(fā)現(xiàn)用微生物蛋白酶制作的干酪的抗氧化能力和金屬螯合能力顯著高于用動(dòng)、植物蛋白酶制作的干酪,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。因此,用YH-1凝乳酶制作的切達(dá)干酪能有效地提高干酪的抗氧化能力和鐵離子螯合能力。

3 結(jié)論

本研究利用貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶及其部分代替商品凝乳酶制備切達(dá)干酪,比較了添加不同凝乳酶切達(dá)干酪的成熟特性及生物活性的差異。結(jié)果表明,與商品凝乳酶制備的干酪相比,利用YH-1凝乳酶制備的切達(dá)干酪具有更高的蛋白含量、更低的水分含量和pH值,干酪硬度增加。YH-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪具有更強(qiáng)的蛋白水解作用,使干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生更多的游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),并且可以提高干酪抗氧化和螯合鐵離子的生物活性。此外,在成熟期內(nèi),混合凝乳酶干酪與商品凝乳酶干酪在理化和質(zhì)構(gòu)指標(biāo)上相似,但前者游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及生物活性更高。因此,為改善切達(dá)干酪的品質(zhì)特性,同時(shí)提高干酪的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和生物活性,可使用貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶部分代替商品凝乳酶生產(chǎn)切達(dá)干酪。本研究為微生物凝乳酶在切達(dá)干酪中的應(yīng)用提供了技術(shù)依據(jù)。