蓮子心米曲霉發(fā)酵物對特應性皮炎緩解效果的研究

余鑫偉,章玲,李媛媛,賈洪雷,劉春環(huán),趙炳天,楊成*

1(合成與生物膠體教育部重點實驗室,江南大學 化學與材料工程學院,江蘇 無錫,214122)

2(上海膚徠生物高科技有限公司,上海,201400)

蓮子心(Nelumbinis Plumula)是睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaertn.)成熟種子的干燥幼葉及胚根,其最早記載可以追溯到晚唐時期的《食性本草》[1]。作為藥食同源的蓮子心具有清心安神,交通心腎,澀精止血等功效,其特征性成分是以蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿為主的芐基異喹啉類生物堿,中國藥典中也以甲基蓮心堿作為指標成分,規(guī)定為其含量不得低于0.7%[2-3]。

研究表明,蓮子心中的特征性生物堿具有抗炎功效。MENG等[4]研究了在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的BV2細胞模型中,蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿可抑制炎癥因子NO、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的釋放,從而可緩解炎癥導致的神經(jīng)退行性疾病;藍秋梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿可以緩解LPS誘導的大鼠軟骨細胞炎癥和抑制細胞外基質(zhì)的降解,從而起到緩解骨關(guān)節(jié)炎的作用;蓮心堿可以減輕小鼠敗血癥誘導的脾臟組織炎癥、氧化應激和細胞凋亡[6]。

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)作為一種以瘙癢和濕疹性病變?yōu)樘卣鞯穆匝装Y性皮膚病,因反復發(fā)作,現(xiàn)已成為一種可危害身心健康的皮膚科常見疾病。YANG等[7]闡明了在TNF-α和干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)刺激的HaCaT炎癥細胞模型中,甲基蓮心堿可通過抑制MAPK和NF-κB磷酸化水平緩解特應性皮炎,并且在2,4-二硝基氯苯誘導的BALB/c老鼠皮炎模型中得到了驗證。因此,蓮子心生物堿可能是一種治療AD的潛在藥物。然而,根據(jù)當前的研究報道,蓮子心生物堿在體內(nèi)經(jīng)歷初步代謝后才能被利用。林敏亭等[8]的研究表明,在Caco-2細胞中,蓮子心生物堿主要通過去甲基化來實現(xiàn)生物利用;韓棟年[9]研究發(fā)現(xiàn),蓮子心生物堿在小鼠體內(nèi)主要經(jīng)歷羥基化、去甲基化、葡萄糖醛酸化以及硫酸化等過程后方能被有效利用。因此,若欲在體外水平上應用蓮子心生物堿,需先進行其初步代謝分解。

發(fā)酵的歷史悠久,作為最簡單、自然、有價值的技術(shù)之一[10],發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)被應用于生產(chǎn)生活的方方面面。微生物發(fā)酵中藥,可以利用微生物中發(fā)達的酶系增強其藥效或者產(chǎn)生新的藥效。米曲霉作為一種食品工業(yè)上常見的菌種,具有發(fā)達的酶系。曹藝等[11]研究發(fā)現(xiàn)米曲霉可使中藥材中的馬兜鈴酸類化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化,這表明米曲霉在蓮子心特征性生物堿轉(zhuǎn)化上存在可能。

本研究利用米曲霉對蓮子心特征性生物堿進行轉(zhuǎn)化,通過建立TNF-α和IFN-γ雙炎癥因子誘導的HaCaT細胞AD炎癥模型,探究了蓮子心發(fā)酵液及萃取后的水油兩相物質(zhì)對細胞炎癥的影響,旨在開發(fā)功能性食品、化妝品及藥品領(lǐng)域中用于改善皮膚狀態(tài)的中藥發(fā)酵制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉(CICC 40636);DMEM高糖培養(yǎng)基,青霉素-鏈霉素雙抗,胰蛋白酶溶液,美國Gibco公司;PBS緩沖溶液,美國Cytiva公司;胎牛血清,新西蘭Newzerum公司;ELISA檢測試劑盒,美國SAB公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、總谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒,中國碧云天公司;HaCaT人永生化角質(zhì)形成細胞(BNCC 339817),北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT),美國Sigma公司;其余試劑均為AR級,上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

Synergy-H1多功能酶標儀,美國Biotek公司;MPW-325R低溫離心機,波蘭MPW公司;Ultimate 3000 RS超高效液相色譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

馬鈴薯瓊脂斜面(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。

將在-80 ℃保存的菌種經(jīng)過劃線接種到PDA斜面培養(yǎng)基上,放置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌株長出綠色孢子后,使用無菌的生理鹽水進行沖洗,以備后續(xù)使用。

1.3.2 蓮子心發(fā)酵液的制備

種子培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L、葡萄糖3.2 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、吐溫-80 0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蓮子心30 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、吐溫-80 0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。

在種子培養(yǎng)基中接種2%(體積分數(shù))的孢子懸浮液,然后在30 ℃的恒溫搖床中以200 r/min的速度培養(yǎng)48 h。隨后將培養(yǎng)好的種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,繼續(xù)在30 ℃、200 r/min搖床中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.3 蓮子心發(fā)酵過程監(jiān)測

分別取發(fā)酵前后的上清液1 mL,10 000 r/min離心2 min,將離心后的上清液通過0.22 μm微孔濾膜過濾,以便用于HPLC檢測。同時配制0.2 mg/mL的標準品混合物進行對照檢測。

色譜條件:色譜柱為AcclaimTM120-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水;流動梯度:0～30 min,65%～80%甲醇,30～40 min,100%甲醇;檢測波長283 nm;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL(標準品),20 μL(樣品)。

1.3.4 蓮子心發(fā)酵樣品(fermented nelumbinis plumula,FPN)的處理及鑒定

發(fā)酵液Fm經(jīng)紗布過濾后,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用0.45 μm微孔濾膜過濾。過濾清液經(jīng)二氯甲烷萃取(體積比3∶1),得到水相Fw和油相Fo,并分別通過旋蒸法除去其中的液體。同時將發(fā)酵0 d的培養(yǎng)基進行同樣的處理得到發(fā)酵前原液Bm,發(fā)酵前水相Bw,發(fā)酵前油相Bo。

采用硅膠G薄層板,將Bo(1 mg/mL)、Fo(20 mg/mL)和蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿混合物(Std)分別進行點樣,點樣量5 μL,展開劑為乙酸乙酯-二氯甲烷-三乙胺(體積比為6∶3∶1),待展開劑接近硅膠板上沿時,將硅膠板取出,烘干后用稀碘化鉍鉀溶液噴霧顯色。同時利用LC/MS對Bo和Fo中含有芐基四氫異喹啉特征吸收波長(λ=283 nm)的生物堿成分進行分析。

1.3.5 HaCaT細胞培養(yǎng)及FPN對細胞存活率的測定

將人類永生化表皮細胞(HaCaT)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至培養(yǎng)皿底部覆蓋70%～80%時進行傳代培養(yǎng)。

生長狀態(tài)良好的HaCaT細胞以1×105個/mL的密度接種至96孔板中,每個孔加100 μL細胞懸浮液,培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基,用PBS清洗3次,然后加入100 μL DMEM培養(yǎng)基配制的待測樣品。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基并用PBS清洗3次,之后加入100 μL DMEM配制的0.5 mg/mL的MTT溶液,在培養(yǎng)箱中反應4 h后,棄去溶液,然后加入100 μL二甲亞砜溶液,混勻后在490 nm處測量吸光度,通過吸光度差異計算細胞存活率。

1.3.6 HaCaT細胞中氧化應激參數(shù)的測定

HaCaT細胞以5×105個/mL接種至6孔板中,每孔加入1.5 mL細胞懸浮液。當細胞生長至培養(yǎng)皿底部達到80%的覆蓋率時,進行加樣處理。對照組加1.5 mL DMEM培養(yǎng)基,模型組加入含有15 ng/mL TNF-α和15 ng/mL IFN-γ(TI)[12]的DMEM培養(yǎng)基,樣品組加入含有樣品和TI的DMEM培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,用預冷的PBS緩沖液清洗3次,收集細胞。根據(jù)試劑盒的說明,測定細胞中超氧化物歧化酶SOD、MDA、GSH和CAT的含量。

1.3.7 HaCaT細胞中分泌因子的測定

使用1.3.6節(jié)的方法對HaCaT細胞進行接種和加樣。培養(yǎng)24 h后,收集上清液,2 500 r/min離心12 min,之后按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA)的說明書測定上清液中胸腺激活調(diào)節(jié)趨化因子(thymus and activation-regulated chemokine,TARC)、巨噬細胞來源趨化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)和IL-6的含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均進行至少3次的重復,采用Origin 2022處理數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)分析采用One-way ANOVA模型進行顯著性分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程的成分變化及產(chǎn)物鑒定

2.1.1 蓮子心發(fā)酵過程生物堿成分變化

圖1為發(fā)酵上清液和標準品混合物在λ=283 nm下的HPLC圖,峰1為蓮心堿,峰2為異蓮心堿,峰3為甲基蓮心堿。在發(fā)酵前,蓮子心中主要的生物堿成分為異蓮心堿和甲基蓮心堿,含量分別為0.04 mg/mL和0.14 mg/mL。隨著發(fā)酵的進行,異蓮心堿的峰面積降低90%,甲基蓮心堿的峰面積降低91%,同時在t=6 min和t=8 min位置出現(xiàn)2個與芐基異喹啉生物堿衍生物特征吸收峰一致的信號峰。因此,可以推斷米曲霉能夠分解蓮子心中的異蓮心堿和甲基蓮心堿,并且能夠產(chǎn)生至少2種新的生物堿。

圖1 蓮子心發(fā)酵過程生物堿成分的變化

2.1.2 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

Bo,Fo薄層色譜分析(thin-layer chromatography,TLC)結(jié)果見圖2-a,1、2和3分別為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿。二氯甲烷萃取后,芐基異喹啉類生物堿衍生物在油相中得到富集。Fo相比與Bo顯示出至少兩種極性更大的生物堿成分,這與HPLC結(jié)果是一致的。為了詳細了解產(chǎn)物結(jié)構(gòu),對Bo,Fo進行LC/MS分析,總離子流圖如圖2-b所示。通過對比相關(guān)文獻,結(jié)合保留時間,準分子離子峰,二級碎片離子峰等信息,鑒定了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),具體結(jié)果見表1。研究發(fā)現(xiàn),通過微生物發(fā)酵,甲基蓮心堿和異蓮心堿可以分解成N-甲基烏藥堿和杏黃罌粟堿。

表1 發(fā)酵后油相中成分鑒定Table 1 Identification of components in the oil phase after fermentation

a-TLC圖;b-總離子流圖

2.2 FPN對HaCaT細胞存活率的影響

如圖3-a所示,Fm和Bm在不同濃度下均與對照組之間存在顯著性差異,特別是當樣品濃度在2 mg/mL時,細胞存活率降至80%左右。對比Fm與Bm的毒性,在濃度低于2 mg/mL時,兩者毒性接近,當濃度提升到20 mg/mL及以上時,Fm組的細胞存活率高于Bm組。對于Bw和Fw,Bw組在3 mg/mL的濃度下細胞存活率顯著下降(P<0.001),而Fw組在1 mg/mL的濃度時就會使細胞存活率顯著下降(P<0.001),當樣品濃度大于0.5 mg/mL時,Fw組的細胞存活率低于Bw組(圖3-b)。而在Bo和Fo的考察中,Bo和Fo組在濃度0.031 mg/mL及以上時顯著降低細胞存活率,當樣品濃度在0.016 mg/mL及以上時,Bo的毒性要高于Fo(圖3-c)。

a-Bm和Fm;b-Bw和Fw;c-Bo和Fo

綜上所述,蓮子心經(jīng)米曲霉發(fā)酵,發(fā)酵原液的毒性呈下降趨勢,發(fā)酵水相的毒性提升,而發(fā)酵油相的毒性降低,且將分別選取Bm(2 mg/mL)、Fm(2 mg/mL)、Bw(0.25 mg/mL)、Fw(0.25 mg/mL)、Bo(0.016 mg/mL)和Fo(0.016 mg/mL)的濃度作為后續(xù)的細胞實驗濃度。

2.3 FPN對TI誘導的HaCaT細胞氧化應激的影響

FPN處理對氧化應激參數(shù)的影響如圖4所示。與對照組相比,TI刺激的模型組SOD活性、GSH含量和CAT活性分別顯著降低74%、74%和78%,MDA水平顯著升高380%(P<0.001),表明細胞中產(chǎn)生了氧化應激損傷。Bm、Fm和Fo組的SOD活性相比于模型組顯著提升,Fo相比于Bo組的SOD活性顯著提升62%(圖4-a)。相較與模型組,Bm、Fm、Bw、Bo和Fo組的GSH含量顯著增加。Fm相比于Bm組,Fo相比于Bo組,GSH含量分別增加19%和72%(圖4-b)。相比于模型組,FPN可以引起細胞中CAT活性顯著性升高。Fm相較于Bm組,CAT活性提升33%,Fo相較于Bo組,CAT活性提升164%(圖4-c)。此外,相比與模型組,FPN樣品均可引起細胞內(nèi)MDA水平的下降,且Fo相比與Bo組,細胞內(nèi)MDA水平顯著下降45%(圖4-d)。

a-SOD;b-GSH;c-CAT;d-MDA

2.4 FPN對TI誘導的HaCaT細胞趨化和炎癥因子的影響

FPN對HaCaT細胞因子分泌的調(diào)控效果見圖5。相較于對照組,TI刺激的HaCaT細胞中MDC、TARC和IL-6的分泌分別顯著升高117%、190%和880%(P<0.001),表明TI刺激引發(fā)了HaCaT細胞中的炎癥反應。在對MDC的分泌調(diào)控中,FPN樣品組的MDC含量相比于模型組顯著下降,Fm相比于Bm組顯著下降16%,Fo相比與Bo顯著下降20%(圖5-a)。同樣,與模型組相比,FPN樣品使HaCaT細胞內(nèi)的TARC釋放顯著減少。Fm相比于Bm組,TARC的含量顯著下降20%,Fo相比與Bo組,TARC的含量顯著下降22%(圖5-b)。在炎癥因子IL-6的分泌調(diào)控上,FPN樣品組的分泌水平相比于模型組顯著降低,Fm相比于Bm組,IL-6的含量顯著降低38%(圖5-c)。

3 結(jié)論

蓮子心生物堿在肝臟中主要經(jīng)過CYP2D1和CYP3A1的催化發(fā)生芐基和喹啉環(huán)上的去甲基化[17],然而在體外缺少相應的酶。本研究采用微生物發(fā)酵的方法,選用米曲霉作為發(fā)酵菌種,蓮子心中的甲基蓮心堿和異蓮心堿被分解成分子量更小的生物堿。隨后,對發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵液進行處理及富集,將其應用于后續(xù)AD效果上的研究。

通過研究FPN對HaCaT細胞細胞活力的影響,觀察到Fm相比與Bm表現(xiàn)出更低的細胞毒性,Fo的細胞毒性小于Bo,這表明經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的小分子生物堿具有更低的毒性。而Fw的毒性高于Bw。可能是在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的積累[18]所引起的。這一發(fā)現(xiàn)為理解生物堿對細胞的影響提供了重要線索,并為其在潛在應用中的安全性提供了支持。

TNF-α和IFN-γ協(xié)同作用下可誘導HaCaT細胞產(chǎn)生炎癥因子(IL-6、IL-8和IL-1β)和趨化因子(TARC和MDC),因此TI刺激HaCaT細胞模型常被用作特應性皮炎的體外模型[19]。氧化應激和炎癥相互依存[20],多數(shù)疾病的發(fā)生中伴隨著炎癥和氧化應激,例如AD[21]、心血管疾病[22]和糖尿病[23]等。此研究表明,FPN能有效緩解細胞的氧化應激損傷,同時抑制細胞炎癥因子和趨化因子的釋放,進而實現(xiàn)對細胞炎癥的抑制效果,這表明米曲霉發(fā)酵液在治療AD上具有潛在價值。而且FPN中的Fo表現(xiàn)出最佳的抑制效果,這表明發(fā)酵后含有小分子生物堿的組分具有優(yōu)異的抗炎效果。同樣,WENG等[24]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論,armepavine可以通過抑制TNF-α引起的HSC-T6細胞中NF-κB通路活化而起到抗炎效果。

綜上,本研究選擇米曲霉進行蓮子心發(fā)酵,成功實現(xiàn)了對其特征性生物堿成分的轉(zhuǎn)化。同時建立了TNF-α/IFN-γ雙炎癥因子刺激的AD體外細胞模型,發(fā)現(xiàn)FPN均可以緩解細胞氧化應激和抑制細胞炎癥,且含有小分子芐基異喹啉生物堿的Fo表現(xiàn)出更強的負調(diào)控作用。這一研究為中藥發(fā)酵原料的產(chǎn)品開發(fā)提供了新思路,并為其在新劑型,新功效的多方面應用提供參考。