廣葉繡球菌低分子質(zhì)量多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件及提取工藝優(yōu)化

劉朋肖,高蘇,梁瑞娜,安苗苗,趙國柱

(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京,100083)

繡球菌又名花椰菜菇、花茸,是一種名貴的食藥用菌,營養(yǎng)豐富,味道鮮美,廣葉繡球菌(Sparassislatifolia)隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、蘑菇綱(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、繡球菌科(Sparassidaceae)、繡球菌屬(Sparassis)(Index Fungorum-Names Record),是我國及東亞地區(qū)主要的野生和栽培種[1],屬于中低溫型食用菌,在偏酸性條件下適宜生長,子實體生長發(fā)育階段對光照的需求高于其他食用菌,因此又有“陽光蘑菇”之稱[2]。多糖是繡球菌中重要的生物活性成分,以β-葡聚糖為主,占子實體干質(zhì)量的40%,在食藥用菌中位于前列[3]。天然的β-葡聚糖主要有2種存在形式:β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖,前者具有廣泛的生物學(xué)活性。繡球菌富含β-(1→3)-葡聚糖,具有抗氧化性[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]等功效,開發(fā)利用價值極高。目前,廣葉繡球菌主要是以人工培育獲得子實體食用為目的,多糖的開發(fā)利用不足。人工培育子實體需要嚴(yán)格的、特定的條件如光照等,從接種到收獲子實體需要約120 d[8],生長周期長、成本高,因此,通過液體發(fā)酵培養(yǎng)繡球菌是高效獲取多糖的重要途徑。繡球菌子實體凍干品中提取的多糖分子質(zhì)量高達(dá)400 kDa,具有溶解困難、黏度大等特點,不利于其提取及活性的發(fā)揮[9]。研究發(fā)現(xiàn),多糖的分子質(zhì)量差異受菌株、不同培養(yǎng)方式[10]、培養(yǎng)條件[11]及提取工藝[12]的影響。分子質(zhì)量較低的繡球菌多糖具有更好的水溶性和生物活性,能夠暴露出更多的還原性末端,提高其抗氧化能力[13]。

繡球菌液體發(fā)酵獲取低分子質(zhì)量多糖的研究不多,發(fā)酵菌絲體與多糖產(chǎn)量的動態(tài)變化規(guī)律尚不明確,提取工藝還不完善。本課題組前期通過復(fù)合篩選綜合評定初步獲得一產(chǎn)低分子質(zhì)量多糖(25 641 Da)的廣葉繡球菌發(fā)酵菌株XQJ-1[14],為了增加多糖產(chǎn)量,更好的研究多糖結(jié)構(gòu)與活性,本研究對其發(fā)酵條件,培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分(碳源種類及含量、氮源種類及含量及培養(yǎng)基pH)進(jìn)行優(yōu)化,通過響應(yīng)面法優(yōu)化繡球菌胞內(nèi)多糖的提取工藝(提取時間、提取次數(shù)、液料比、提取溫度),以提高繡球菌菌絲體干重,增加胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量和提取效率,為相關(guān)研究及繡球菌低分子質(zhì)量多糖的深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

繡球菌XQJ-1,本實驗室篩選分離獲得,經(jīng)ITS rDNA分子與形態(tài)鑒定為廣葉繡球菌[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然,121 ℃滅菌20 min;

種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖200,酵母粉6,KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,pH 4.0,121 ℃滅菌20 min;

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,蛋白胨5,KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見分光光度計,上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司;SIGMA 1-14離心機(jī),希格瑪貿(mào)易有限公司;DHG 9626A烘箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;TG16A-WS離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HZC-250全溫振蕩培養(yǎng)箱,蘇州培英實驗設(shè)備有限公司;SPX-250生化培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液體菌株的制備及初始培養(yǎng)

用接種針在繡球菌XQJ-1菌株斜面上挑取一小塊菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上,26 ℃避光培養(yǎng)8 d,待菌絲體鋪滿培養(yǎng)基,取1.0 cm2菌塊置于100 mL液體菌種培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,26 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 d,獲得液體菌種;以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將液體菌種接種于裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,26 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 d,獲得菌體發(fā)酵液。

1.3.2 繡球菌XQJ-1生物量測定

用無菌紗布過濾收集菌絲體,40 ℃烘干24 h至恒質(zhì)量,用分析天平稱重,保留2位小數(shù)。將繡球菌XQJ-1菌絲體研磨成粉末備用。

1.3.3 胞內(nèi)多糖測定

采用熱浸法提取胞內(nèi)多糖,參照游雄等[15]的方法稍作改動。菌絲體粉末以10 mL/g的液料比,加入蒸餾水,95 ℃浸提2次后合并浸提液。浸提液濃縮至原體積的1/4后,加入4倍體積的無水乙醇,在4 ℃醇沉過夜后離心收集沉淀,冷凍干燥,得到粗多糖。配制1 mg/mL粗多糖溶液。采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[16],吸取上述粗多糖溶液2 mL,加入1 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))的苯酚混合,室溫靜置10 min后,加入濃硫酸5 mL,30 ℃水浴30 min,于紫外分光光度計490 nm處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.3.4 培養(yǎng)天數(shù)對胞內(nèi)多糖的影響

按上述1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)繡球菌XQJ-1,從第10天開始測定其胞內(nèi)多糖及菌絲體生物量,共測量至第21天。

1.3.5 培養(yǎng)基成分對胞內(nèi)多糖的影響

在1.1.2節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下,按上述1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)繡球菌XQJ-1,采用單因素-驗證的方法分別考察不同碳源及含量(10、15、20、25、30 g/L)、不同氮源及含量(2、5、8、11、14 g/L)及初始pH值(3、4、5、6)(表1),不同單因素對繡球菌XQJ-1液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖及菌絲體干重的影響,每組實驗設(shè)3個重復(fù)。

表1 繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的條件優(yōu)化Table 1 Optimization of intracellular polysaccharide production conditions of Sparassis latifolia XQJ-1

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化液體發(fā)酵繡球菌XQJ-1胞內(nèi)多糖的提取方法

按1.3.2節(jié)方法獲得繡球菌XQJ-1菌絲體粉末,采用1.3.3節(jié)中的熱浸法對其菌絲體多糖進(jìn)行提取,設(shè)置不同的提取次數(shù)、提取溫度及料液比,其他條件不變。

通過單因素試驗確定提取繡球菌XQJ-1胞內(nèi)多糖的最優(yōu)水平,采用Design-Expert 8.0.6軟件,以液料比、提取時間、提取溫度3個因素設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗,一共17組方案點,每組設(shè)置3個重復(fù),試驗因素的水平如表2所示。

表2 Box-Behnken design 實驗因素水平Table 2 Box-Behnken design experimental factors and level

按1.3.3節(jié)的方法計算多糖含量,多糖得率的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實驗3個重復(fù),采用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行方差分析,Origin 9.1繪圖軟件處理實驗數(shù)據(jù)并繪制圖表,數(shù)據(jù)多重比較采用Tukey法。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對液體發(fā)酵繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響

繡球菌液體發(fā)酵21 d,定時取樣測定菌絲體干重及胞內(nèi)多糖的含量。如圖1所示,繡球菌XQJ-1生長周期較長,前10 d為生長的遲滯期,大量合成細(xì)胞分裂所需要的酶類、ATP及其他細(xì)胞成分,菌體生長緩慢;第10～16天進(jìn)入對數(shù)期,菌絲體生物量快速增加;17～18 d時為穩(wěn)定期,此后由于養(yǎng)分消耗及代謝產(chǎn)物的積累,菌絲體生長停滯甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,菌絲體干重逐漸下降。隨著菌絲體生物量的變化,胞內(nèi)多糖也表現(xiàn)先增長后降低的趨勢,在16 d達(dá)到最大值,隨著培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的不足,胞內(nèi)多糖的自我消耗增多,產(chǎn)量不斷下降。綜合菌絲體干重與胞內(nèi)多糖的含量變化,第17天收集菌絲體干重最高,且胞內(nèi)多糖與16 d相比并無顯著差異,故選擇第17天為液體培養(yǎng)繡球菌XQJ-1的最佳時間。

圖1 繡球菌XQJ-1液體培養(yǎng)過程中菌絲體干重與 胞內(nèi)多糖變化情況

2.2 培養(yǎng)基成分對液體發(fā)酵繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響

2.2.1 碳源種類對繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源制作培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的其他成分保持不變,26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)17 d。由圖2可知,當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度為15～25 g/L時,繡球菌菌絲體干重顯著高于葡萄糖、蔗糖不同濃度組(P<0.05),因此可溶性淀粉較適合菌絲體的生長。當(dāng)可溶性淀粉用量為15 g/L時,菌絲體多糖達(dá)最大產(chǎn)量為350.78 mg/L。綜合考慮多糖產(chǎn)量及成本,后續(xù)驗證實驗中選擇15 g/L的可溶性淀粉為培養(yǎng)基的碳源。

圖2 碳源種類及含量對繡球菌XQJ-1液體培養(yǎng)過程中 菌絲體干重與胞內(nèi)多糖的影響

2.2.2 氮源種類對繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選擇蛋白胨、酵母粉、牛肉膏為氮源,其他成分保持不變,26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)17 d。由圖3可知,分別以5 g/L和8 g/L的牛肉膏為氮源時,繡球菌菌絲體多糖產(chǎn)量均較高且無顯著差異(P>0.05),而選用8 g/L的牛肉膏做氮源時,菌絲體生物量顯著高于其他組(P<0.05),因此將8 g/L的牛肉膏作為篩選的氮源。

圖3 氮源種類及含量對繡球菌XQJ-1液體培養(yǎng)過程中 菌絲體干重與胞內(nèi)多糖的影響

2.2.3 初始pH對繡球菌XQJ-1產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響

將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至3、4、5、6,于26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)17 d。由圖4可知,隨著pH值的升高,菌絲體干重呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在pH值為5時,有最大干重6.0 g/L,當(dāng)pH值從3升至5時,菌絲體產(chǎn)量呈上升趨勢,但變化幅度不大;當(dāng)pH值繼續(xù)增加時,菌絲體產(chǎn)量急劇下降,pH值為7時基本不生長,所以未做檢測。胞內(nèi)多糖也呈現(xiàn)先增加再減少的變化趨勢,在初始pH值為5時,胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高,達(dá)到432.65 mg/L,因此選擇初始pH值為5進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 不同初始pH值的培養(yǎng)基對繡球菌XQJ-1液體培養(yǎng) 過程中菌絲體干重與胞內(nèi)多糖的影響

綜合以上單因素試驗結(jié)果,優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成(g/L)為:馬鈴薯200,可溶性淀粉15,牛肉膏8、KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,初始pH值為5。

2.2.4 液體培養(yǎng)繡球菌XQJ-1最適方法驗證

按照單因素優(yōu)化的最適培養(yǎng)基組成,對繡球菌XQJ-1進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)至第17天收集菌絲體,經(jīng)檢測菌絲體干重為(6.03±0.25) g/L,胞內(nèi)多糖為(433.25±37.46) mg/L,符合實驗預(yù)期,可以看出該方法重復(fù)性較好,可用于后續(xù)大批量發(fā)酵實驗,為繡球菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化液體發(fā)酵繡球菌XQJ-1胞內(nèi)多糖的提取方法

2.3.1 提取胞內(nèi)多糖單因素試驗

提取次數(shù):由圖5-a可知,隨著提取次數(shù)的增加,繡球菌菌絲體多糖的得率逐漸增加,但超過2次后得率并無顯著性增加(P>0.05),且浸提多次操作繁瑣,耗時較長,因此確定在后續(xù)實驗中浸提次數(shù)為2次。提取時間:由圖5-b可知,隨著浸提時間的增加,繡球菌菌絲體多糖的得率先上升再下降,說明提取時間過長或過短都不利于多糖的提取和釋放,提取時間為2.5 h時,多糖得率最大,因此確定2.5 h為最佳提取時間。液料比:由圖5-c可知,液料比(mL∶g)從10∶1上升到30∶1的過程中,繡球菌菌絲體多糖得率顯著上升,進(jìn)一步提高液料比后則呈下降趨勢,因此確定30∶1為最佳液料比。提取溫度:由圖5-d可知,隨著提取溫度升高,多糖得率整體也呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在85 ℃多糖得率最大,因此確定85 ℃為最佳提取溫度。

a-提取次數(shù);b-提取時間;c-液料比;d-提取溫度

2.3.2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

在2.3.1節(jié)的單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken design中心組合試驗原理設(shè)計試驗,結(jié)果見表3。對標(biāo)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到多糖得率與各因素關(guān)系為:Y=8.81-0.45A+0.2B+0.75C-0.037AB+0.35AC-0.03BC-0.83A2-0.93B2-0.96C2。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

由表4的方差分析結(jié)果可得:R2=0.980 2,說明所得回歸方程模型極顯著(P<0.01),并且模型的失擬項檢驗不顯著(F>0.05),說明該回歸方程能夠較好反應(yīng)實際試驗情況,可以利用該模型對多糖提取的最佳條件進(jìn)行預(yù)測分析。通過比較回歸系數(shù),在一次項中,提取時間A與提取溫度C達(dá)到極顯著水平(P<0.01),液料比B達(dá)到顯著水平(P<0.05),得到各因素對繡球菌菌絲體多糖得率的順序為:提取溫度C>提取時間A>液料比B。在平方項中,A2、B2及C2的回歸系數(shù)均極顯著(P<0.01),說明提取時間A、液料比B及提取溫度C與繡球菌菌絲體多糖得率之間存在著明顯的二次關(guān)系。在交互項中,只有提取時間與提取溫度的交互項AC的回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平(P<0.05),表明提取時間與提取溫度的交互作用對繡球菌菌絲體多糖得率有顯著影響。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

3D響應(yīng)面圖(圖6)的擬合曲面為凸形,說明多糖存在最大得率,進(jìn)一步對方程求解,得到的最優(yōu)提取條件為:提取時間2.4 h,液料比為31.08∶1(mL∶g),溫度88.53 ℃,預(yù)測得率9.0%。為便于實際操作,將得到的最優(yōu)條件進(jìn)行校正,校正后的最優(yōu)條件為:提取時間2.4 h,液料比31∶1(mL∶g),溫度89 ℃。采用校正后的條件進(jìn)行重復(fù)驗證實驗,實際得率(8.82±0.15)%,與模型預(yù)測值偏差2%,說明模型具有良好的擬合性和重復(fù)性。

a、c、e為響應(yīng)面3D圖:a-提取時間和液料比;c-提取時間和提取溫度;e-液料比和提取溫度; b、d、f為響應(yīng)面等高線圖:b-提取時間和液料比;d-提取時間和提取溫度;f-液料比和提取溫度

3 討論

目前對液體發(fā)酵培養(yǎng)廣葉繡球菌及胞內(nèi)低分子質(zhì)量多糖的獲取研究還不充分,豐富液體發(fā)酵廣葉繡球菌方法,提高菌絲體干重、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量和提取效率是非常必要的。本研究發(fā)現(xiàn),廣葉繡球菌XQJ-1菌絲體干重與胞內(nèi)多糖積累趨于同步動態(tài)變化,說明協(xié)同分析二者的產(chǎn)量和質(zhì)量十分重要。研究發(fā)現(xiàn)繡球菌液體搖瓶發(fā)酵通常在15 d達(dá)到較高的菌體生物量[17],與本研究(17 d)相近。實驗顯示繡球菌對碳源利用范圍較為廣泛,可以較好的利用單糖、二糖和多糖等。以菌絲體干重和菌絲體多糖為指標(biāo),本研究篩選得到的最佳碳源是可溶性淀粉,與游雄等[15]的研究結(jié)果一致,說明繡球菌對于可溶性淀粉類大分子多糖有更好的利用能力。氮源篩選結(jié)果顯示,繡球菌對不同氮源的利用效率依次為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉。但氮源需求可能因繡球菌來源菌種不同及培養(yǎng)條件差異而發(fā)生變化,根據(jù)目前已有的研究可以發(fā)現(xiàn)繡球菌更傾向于利用成分復(fù)雜有機(jī)氮源,其中的核苷酸、維生素礦物質(zhì)元素等可有效促進(jìn)繡球菌的生長[9-10]。pH會引起微生物細(xì)胞膜的通透性和培養(yǎng)基成分的離子狀態(tài)變化,進(jìn)而影響胞外酶的活性及菌體生長,調(diào)控代謝通路,本研究發(fā)現(xiàn)繡球菌生長的最適pH值為5,與KUROSUMI等[18]優(yōu)化得到繡球菌液體培養(yǎng)的最適條件為pH=5的結(jié)果一致,當(dāng)pH值超過5,繡球菌菌絲體及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量急劇下降,pH值為7時甚至停止生長,說明偏酸性條件有利于菌絲體生物量及多糖的積累。研究表明pH=5時,多糖合成過程中關(guān)鍵酶磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)和UDPG焦磷酸化酶(UDP-glucosepyro phosphosphprylase,UGPase)活性最高,有利于多糖的合成[19]。

天然多糖的提取方法包括順序提取、酸堿提取、酶輔助提取、超聲提取等方法,由于酸、堿會造成糖苷鍵的斷裂,而酶解處理又會引入其他蛋白,超聲波對多糖的降解程度高,通常這些方法得到的多糖為高分子質(zhì)量多糖[20-23],本研究則通過熱水提醇提取多糖的方法對提取次數(shù)、提取時間、液料比、提取溫度的響應(yīng)面工藝優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)為2時,能使多糖最大限度地溶解于熱水中,提高低分子質(zhì)量多糖提取效率。廣葉繡球菌XQJ-1多糖提取率隨提取時間先增加后降低,ZHANG等[24]的結(jié)論中表明提取的時間越長產(chǎn)量越低。液料比對多糖的提取具有一定的影響,液料比的增加促進(jìn)水向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散,利于多糖的溶出,但過高的液料比會導(dǎo)致胞內(nèi)的雜質(zhì)易于溶出,不利于多糖提取。崔麗霞等[25]采用響應(yīng)面法對繡球菌子實體多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化,在液料比為38.8∶1(mL∶g)的條件下沸水浴提取3 h多糖得率可達(dá)9.9%,與本研究的液料比為31∶1(mL∶g)相近。此外,影響多糖溶解度的因素還有提取溫度,隨著溫度的升高,分子運動加快,多糖溶解度上升,但溫度過高時,多糖結(jié)構(gòu)易被破壞,造成多糖分解流失,影響其生物活性[26]。本研究通過Box-Behnken設(shè)計實驗進(jìn)一步對繡球菌菌絲體多糖的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,在單因素試驗過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度超過85 ℃、提取時間超過2.5 h后,菌絲體多糖的得率出現(xiàn)下降趨勢,表明溫度過高或提取時間過長可能會造成多糖的降解,從而造成得率的下降。在單因素優(yōu)化中,液料比在30∶1(mL∶g)時有最大多糖得率,說明液料比過高或過低也不利于多糖的提取。在響應(yīng)面實驗中,只有提取時間和提取溫度表現(xiàn)出了較好的交互作用,而液料比與其他因素的交互作用不明顯,擬合曲面均為凸形說明存在最大值。

目前,對廣葉繡球菌多糖的研究一般集中在高分子質(zhì)量多糖組分上[6],然而由于其黏度高,水溶性差,結(jié)構(gòu)構(gòu)象復(fù)雜,很難通過屏障黏附到細(xì)胞表面受體或穿透細(xì)胞膜,導(dǎo)致其生物活性有限[27-28]。某些低分子質(zhì)量多糖,特別是10～100 kDa的多糖,已被證明具有較強的生物活性,如抗氧化能力和抗腫瘤等[29-30]。DUAN等[4]從繡球菌發(fā)酵液、菌絲體、子實體中采用堿水提法和熱水浸提法提取6種低分子質(zhì)量多糖,分子質(zhì)量相似并集中在(30～50 kDa),具有顯著的抗氧化能力。此外,通過不同的解聚手段獲得的相對低分子質(zhì)量廣葉繡球菌多糖表現(xiàn)出更高的抗氧化活性,尤其在還原力方面,由于低分子質(zhì)量多糖暴露的還原性末端多,因而比高分子質(zhì)量多糖的還原性強[10]。同時低分子質(zhì)量多糖更容易黏附到細(xì)胞表面受體或者穿透細(xì)胞膜,從而表現(xiàn)出更顯著的活性,對研究多糖的藥理活性尤為重要。因此,在本研究中,通過對其培養(yǎng)條件及提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,在最佳培養(yǎng)條件下,采用熱水浸提法獲得較高廣葉繡球菌XQJ-1菌絲體干重、胞內(nèi)多糖含量及提取效率,并經(jīng)過對多糖主要組分進(jìn)行初步鑒定,獲得分子質(zhì)量為25 641 Da的低分子質(zhì)量多糖,并具有顯著的抗結(jié)腸癌的能力[14]。

4 結(jié)論

本研究對液體發(fā)酵的廣葉繡球菌的低分子質(zhì)量多糖培養(yǎng)條件及提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。單因素優(yōu)化培養(yǎng)條件,驗證結(jié)果顯示:液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為15 g/L可溶性淀粉,氮源為8 g/L牛肉膏,pH值為5,發(fā)酵17 d時,廣葉繡球菌XQJ-1的菌絲體干重為(6.03±0.25) g/L,胞內(nèi)多糖達(dá)(433.25±37.46) mg/L,處于較高的優(yōu)化水平;響應(yīng)面法對XQJ-1胞內(nèi)多糖的提取優(yōu)化表明,提取次數(shù)2次,提取時間2.4 h,液料比31∶1(mL∶g),溫度89 ℃時,胞內(nèi)多糖得率為(8.82±0.15)%,較優(yōu)化前(6.24%)提高了41.3%,達(dá)到較高的提取效率。為廣葉繡球菌進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。