血管栓塞用明膠海綿微球的制備及表征

譚奕勛 云曉 王春曼 吳芬敏 楊頂建 海南百邁科醫(yī)療科技股份有限公司 （海南 定安 571200）

內(nèi)容提要： 目的：制備一種可用于血管栓塞的明膠海綿微球，表征其理化性能，并通過動物試驗初步驗證其用于體內(nèi)栓塞的安全性和有效性。方法：在制備明膠海綿微球時，將含有明膠的水相，添加到含有乳化劑的油相中，構(gòu)建油包水的乳化體系，隨后加入交聯(lián)劑固化得到明膠海綿微球；對制得的微球開展了包括顯微外觀、粒徑、溶脹率、彈性在內(nèi)的理化性能表征；將制得的明膠海綿微球通過微導管注入豬腎臟血管，觀察栓塞效果以及術(shù)后的并發(fā)癥等情況以驗證微球用于體內(nèi)栓塞的安全性和有效性。結(jié)果：以此法制得的明膠海綿微球，表面光滑，呈規(guī)則球形；溶脹后的粒徑呈類正態(tài)分布，粒徑范圍50～2000μm，平均溶脹率為355%，通過質(zhì)構(gòu)儀對微球施加粒徑50%的壓縮形變后，微球不破碎，不變形；豬腎臟栓塞動物試驗表明，微球能夠有效栓塞靶血管，引起靶組織的缺血梗死，體內(nèi)降解時長約為28d，降解后血管可復通，試驗過程中未見與明膠海綿微球相關(guān)的并發(fā)癥。結(jié)論：該方法制得的明膠海綿微球呈完整球形，形狀規(guī)則，粒徑分布范圍廣，經(jīng)篩分后具有可用于不同尺寸血管栓塞的潛力。微球具有適中的溶脹率與良好的彈性，便于在術(shù)中通過導管進行輸送并能夠與靶血管緊密嵌合；豬腎臟栓塞動物試驗的結(jié)果亦表明制得的明膠海綿微球安全性和有效性良好，降解時長適中，運用于血管栓塞具有較大的市場前景。

血管內(nèi)栓塞術(shù)是指通過導管向靶血管內(nèi)注入栓塞材料，使靶血管閉塞，從而達到預期治療目的的一種技術(shù)[1]。目前血管內(nèi)栓塞術(shù)在臨床上被廣泛應用于阻塞靶血管治療各種原因?qū)е碌某鲅⑾鞴俟δ堋⒅委熝芑渭皠屿o脈瘺等血管病，栓塞腫瘤供血血管和血流改道等多個方面[2-4]。栓塞材料的性質(zhì)在很大程度上決定了栓塞血管的層次、持續(xù)時間以及栓塞效果。栓塞材料有可吸收和不可吸收兩類，臨床常用的可吸收材料包括明膠海綿、海藻酸等，不可吸收材料主要是聚乙烯醇[5-7]。其中，明膠材料因其生物相容性好，有成熟的臨床應用經(jīng)驗，可生物降解且容易獲得等特性，被廣泛應用于血管栓塞領(lǐng)域[8]。然而，目前國內(nèi)臨床主要應用明膠海綿顆粒栓塞劑，或者通過手工剪碎明膠海綿片的方式簡易制得明膠栓塞材料，這類栓塞材料具有形狀不規(guī)則，粒徑分布不均一，尺寸不可控，易團聚且機械性能不佳等缺點，增大了栓塞過程中栓塞劑漂移至體內(nèi)其他正常器官造成異位栓塞的風險[9]。為了克服不規(guī)則顆粒型栓塞劑存在的不足，越來越多的微球型栓塞劑被開發(fā)出來，其具有規(guī)則的球形與均一的粒徑，血管順應性更好，栓塞時能到達更為遠端的血管。國內(nèi)尚未有明膠海綿微球型栓塞劑上市，因此，開發(fā)一種具有市場應用潛力的明膠海綿微球型栓塞劑，并驗證其用于血管栓塞的安全性和有效性具有重大的意義。本文基于乳化交聯(lián)法，開發(fā)了一種可用于工業(yè)化生產(chǎn)明膠海綿微球的方法，并對制得的明膠海綿微球的顯微外觀、粒徑、溶脹率、彈性性能進行了考察。隨后，使用豬腎臟模型對明膠海綿微球用于血管栓塞的安全性和有效性進行了驗證。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗起止時間：2021年6月～2023年2月。

試驗動物：12只普通白豬，體重47～61kg，按照試驗周期分為2d、14d、28d和42d組，每組3只。

試劑：藥用明膠（25kg/袋，西安天正藥用輔料有限公司）；二甲基硅油（500mL/瓶，上海麥克林生化科技有限公司）；司盤80（500mL/瓶，上海麥克林生化科技有限公司）；丙酮（500mL/瓶，西隴科學股份有限公司）；戊二醛（AR，50%水溶液500mL/瓶，上海麥克林生化科技有限公司）；注射用水（海南中玉藥業(yè)有限公司）。

儀器設備：恒溫水浴鍋（B-220）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）；反應釜（JBP-20-2M）；低溫冷卻液循環(huán)水泵（DLSB-5/20）；離心機（PS300）；超聲波清洗機（XC-1200）；電熱恒溫鼓風干燥箱（9425A）；質(zhì)構(gòu)儀（CTA-10HD）；工業(yè)顯微鏡（SK2610B）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（ZEISS SIGMA）。

1.2 方法

1.2.1 明膠海綿微球的制備

在37°C下，將400g明膠充分溶解于去離子水中形成30%明膠水溶液。隨后，在37°C、200r/min轉(zhuǎn)速的攪拌條件下，將30%明膠水溶液逐滴添加入含有16g司盤80的2000mL二甲基硅油中，持續(xù)攪拌30min形成油包水的乳化體系。接下來，調(diào)整溫度至2°C，并逐滴添加15mL戊二醛，在攪拌環(huán)境下保溫交聯(lián)反應5h。反應完成后，過濾得到微球，并依次使用丙酮和去離子水分別洗滌微球3次。最后，將微球通過篩網(wǎng)篩分（如必要）并冷凍干燥。

1.2.2 明膠海綿微球性狀與功能考察

1.2.2.1 明膠海綿微球顯微外觀考察

取適量凍干微球以及在0.9%生理鹽水中充分溶脹的微球，分別使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡以及工業(yè)顯微鏡對微球的顯微外觀形態(tài)進行觀察。

1.2.2.2 明膠海綿微球粒徑分布考察

分別取未經(jīng)篩分的凍干明膠海綿微球以及在0.9%生理鹽水中充分溶脹的微球，使用光學顯微鏡在30x放大倍數(shù)下觀察并測量微球粒徑，計算平均粒徑并使用SPSS分析軟件繪制粒徑分布圖。

1.2.2.3 明膠海綿微球溶脹率考察

取50mg凍干微球，將其浸泡于0.9%生理鹽水5mL中，分別在浸泡2、5、10、30、60min后取出，用濾紙吸干表面水分，迅速稱重并計算溶脹率，重復3次。根據(jù)下列公式計算明膠海綿栓塞微球在上述三種溶脹介質(zhì)下的溶脹率（SR）見公式（1）：

式中：m0—為溶脹前的質(zhì)量（單位：mg）；m1—為溶脹后的質(zhì)量（單位：mg）。

1.2.2.4 明膠海綿微球彈性考察

取在0.9%生理鹽水中充分溶脹的微球1粒，用濾紙吸除表面水分后，置于質(zhì)構(gòu)儀的樣品臺上。選擇直徑為5mm的圓柱形探頭，觸發(fā)點為0.5g，測試模式為“壓縮保持”。測試過程中，探頭首先下降（速度為5mm/min）至微球壓縮形變至直徑的50%，保持靜止10s，隨后探頭回升（速度為5mm/min）。記錄壓縮、靜止及回升過程中探頭和微球之間的作用力，并觀察壓縮后微球的形態(tài)變化。

1.2.2.5 明膠海綿微球豬腎臟栓塞試驗

測試手術(shù)全程使用無菌操作，對所有試驗白豬進行鎮(zhèn)靜及誘導麻醉后，切開左側(cè)或右側(cè)股動脈后置入血管鞘。在數(shù)字減影血管造影機引導下，將明膠海綿微球通過微導管注射至腎下極三級動脈及其所有下游動脈，直至栓塞完全，即栓塞靶血管顯影全部消失。術(shù)后2d、14d、28d和42d分別對計劃解剖的動物再次行造影觀察腎動脈血流分布情況，隨后處死相應動物，解剖觀察腎組織的梗死情況，并行組織病理學檢查。

2.結(jié)果

2.1 明膠海綿微球顯微外觀

凍干微球在電子顯微鏡下觀察的形態(tài)如圖1所示，微球呈現(xiàn)規(guī)則球形，表面基本光滑，略有褶皺，分散性好，沒有粘連。充分吸水溶脹后的微球在光學顯微鏡下觀察，如圖2所示，微球呈規(guī)則圓形，無破碎，表面光滑，呈透明，顆粒大小均勻，分散性好，無粘連。

圖1.凍干微球掃描電子顯微鏡圖

圖2.溶脹微球的光學顯微鏡圖

2.2 明膠海綿微球粒徑分布

經(jīng)光學顯微鏡下觀察及測量，凍干微球的粒徑范圍在30～1200μm，平均580μm，粒徑分布結(jié)果如圖3所示；在生理鹽水中充分溶脹的微球粒徑范圍在50～2000μm，平均840μm，粒徑分布結(jié)果如圖4所示。

圖3.凍干微球的粒徑分布直方圖

圖4.溶脹微球的粒徑分布直方圖

2.3 明膠海綿微球溶脹率

微球溶脹率隨時間的變化如圖5所示。凍干微球在生理鹽水中迅速吸水溶脹，在約10min時達到溶脹穩(wěn)態(tài)，穩(wěn)態(tài)時的溶脹率約為355%。

圖5.微球溶脹趨勢

2.4 明膠海綿微球彈性

微球彈性測定過程中，其受力隨測試時間變化以及隨微球形變變化的情況分別如圖6所示。測試結(jié)果如圖7所示，在探頭向下壓縮微球的過程中，微球的負載隨形變的增加而增加，直至達到設置的形變壓縮量50%。在保持壓縮的10s內(nèi)，微球負載保持基本恒定，處于“平臺期”，說明微球在壓縮過程中無破裂，有較好對抗外界壓力的能力。在探頭下降和上升過程中，微球負載的變化曲線基本對稱，說明壓縮微球時發(fā)生的是彈性形變，微球結(jié)構(gòu)在壓縮過程中無明顯變化，彈性良好。

圖6.微球壓縮形變過程

圖7.彈性測試曲線圖

2.5 明膠海綿微球豬腎臟栓塞

術(shù)中栓塞前后豬腎臟血流造影如圖8所示，明膠海綿栓塞微球注入后，豬腎臟下極三級及以下血管基本無可見血管造影信號，顯示血管被完全栓塞。腎臟上極血流信號栓塞前后無明顯差異，沒有微球漂移形成異位栓塞的跡象。

圖8.術(shù)中栓塞前后豬腎臟血流造影圖

術(shù)后2d、14d、28d和42d動物解剖前造影結(jié)果及術(shù)后栓塞即刻的對比結(jié)果（圖9）顯示，2d和14d時栓塞血管均未觀察栓塞靶血管明顯復通；28d時，栓塞血管近端可見一定程度的復通；42d時，血管進一步復通，遠端終末小血管仍處于栓塞狀態(tài)。各時間組動物解剖后腎臟大體觀察見圖10，2d組被栓塞的腎臟下極明顯缺血壞死，呈鮮紅色；14d組腎臟下極組織梗死進一步加重，呈黃色夾雜暗紅色斑片，體積減少，發(fā)生萎縮；28d組和42d組腎臟下極可見組織梗死現(xiàn)象進一步加重，腎臟下極萎縮程度加深，梗死區(qū)域整體呈黃褐色伴有不規(guī)則斑塊。各時間組腎臟上極均未見明顯異常及梗死灶。

圖9.術(shù)后即刻及解剖前腎臟造影圖

圖10.術(shù)后不同時間點解剖前腎臟大體觀察圖

組織病理學檢查（圖11）發(fā)現(xiàn)，2d組腎下極各級動脈均可見栓塞微球，微球形態(tài)基本保持球形，內(nèi)部可見輕微變形和細小的裂縫，微球大小無明顯減少。腎臟下極呈現(xiàn)嚴重的血管損傷及廣泛的腎組織缺血壞死，多形核細胞顯著升高；14d時，微球降解現(xiàn)象明顯，在部分弓狀及小葉間動脈中可見藍黑色塊狀微球降解物，多數(shù)前期受損血管在微球降解或血栓形成的基礎上進一步引發(fā)機化過程，組織缺血壞死加重，纖維組織輕度增生；28d時，微球已基本降解，未見殘留物，腎下極壞死鈣化范圍廣，慢性炎性細胞進一步增加，纖維組織增生更為明顯；42d組，未見微球，腎下極血管可見部分或全部閉塞，多數(shù)腎小球纖維化，腎小管萎縮，間質(zhì)中大量纖維組織增生，腎盂周圍有較明顯的脂肪浸潤。

圖11.術(shù)后不同時間點栓塞血管病理檢查圖

3.討論

本文開發(fā)了一種適用于工業(yè)化批量生產(chǎn)明膠海綿微球的方法，合成步驟簡便，反應條件易于控制。明膠水溶液首先在含乳化劑的油相中充分分散，形成油包水的乳化體系，隨后明膠與交聯(lián)劑甲醛反應，在明膠分子間形成化學鍵，固化為微球。

由該方法制得的微球呈現(xiàn)規(guī)則的圓球形，表面光滑且分散性好，無粘連，利于注射輸送及栓塞靶血管。凍干后的微球在生理鹽水中能夠快速溶脹，溶脹后的微球具有良好的彈性，在臨床上通過導管輸送時，經(jīng)壓縮后能夠快速恢復原形，與血管壁緊密嵌合，起到良好的栓塞效果。

臨床上常規(guī)所需的栓塞微球范圍在50～2000μm，不同粒徑大小的微球適用于不同尺寸血管的栓塞[10]。本文制備的微球溶脹后粒徑在50～2000μm，落在臨床常用的范圍內(nèi)，具有較大的臨床實際應用價值。

微球豬腎臟動脈栓塞試驗表明，微球在體內(nèi)降解完全的時間約為28d，能夠?qū)崿F(xiàn)對靶血管的致密栓塞，有效阻斷血液流動。明膠微球?qū)儆诳晌账ㄈ麆瑒游镌囼灥慕Y(jié)果表明，在微球降解過程中，部分血管復通，也有部分血管因微球引發(fā)顯著的血栓及機化過程發(fā)生永久閉塞，但栓塞靶部位均發(fā)生不可逆的缺血壞死。解剖大體觀察及組織病理學檢查均表明，栓塞靶部位的組織梗死以及纖維化程度隨著時間的延長而不斷加深，這意味著可降解的明膠海綿微球能夠?qū)崿F(xiàn)靶部位的有效栓塞，不會出現(xiàn)栓塞部位隨著微球降解而恢復正常的情況。此外，腎臟上極未見梗死灶及異常，意味著微球栓塞后并未發(fā)生向其他部位漂移造成非靶部位異位栓塞的并發(fā)癥，明膠微球的安全性良好。

本文制備的明膠海綿微球具有形狀規(guī)則、顆粒大小均勻、分散性及彈性好等特性，初步的動物試驗表明微球在體內(nèi)降解時長適中，實現(xiàn)靶部位栓塞的有效性及安全性良好。