Pdx-1、Ngn3聯合MafA誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞移植治療1型糖尿病大鼠的效果

閆淑芳,袁慧娟

(1.河南大學淮河醫(yī)院 內分泌科,河南 開封 475000;2.河南省人民醫(yī)院 內分泌科,河南 鄭州 450003)

糖尿病作為慢性代謝性疾病,發(fā)病率逐年上升,尋求新的治療方法十分必要。大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可通過轉染胰腺轉錄因子被成功分化為胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs)。胰腺的轉錄因子是控制胰腺的分化、發(fā)育、增殖和凋亡的關鍵基因。胰十二指腸同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1,Pdx-1)作為胰腺分化的關鍵轉錄因子,其外源性表達可以誘導非β細胞表達胰腺β細胞的相關基因,尤其是胰島素基因[1-2]。前期研究已經證實Pdx-1可誘導BMSCs轉分化為IPCs。另一個關鍵因子神經元素3(neurogenin,Ngn3)激活并啟動上皮祖細胞分化為胰腺內分泌細胞[3]。V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(V-type tendon fibrosarcoma oncogene homolog A,MafA)主要功能是在Pdx-1基因表達的前提下反式激活胰島素相關基因的表達,參與胰腺β細胞的形成以及維持胰腺β細胞的功能。前期研究成功應用Pdx-1、Ngn3和MafA共轉染BMSCs誘導為IPCs,且具有胰島素分泌細胞的特性[4],那么分化的細胞移植到糖尿病大鼠體內是否具有降低血糖的作用呢?本研究擬通過Pdx-1、Ngn3和MafA共轉染BMSCs誘導為IPCs,移植到1型糖尿病大鼠的腎被膜下觀察其療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠60只,雄性,90～120 g,購自鄭州大學實驗動物中心,飼養(yǎng)于鄭州大學人民醫(yī)院中心實驗室,恒溫18～23 ℃,相對濕度55%～66%,光線明暗各12 h,自由進食進水,適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要儀器及試劑

腺病毒載體pAd-EGFP、pAd-Cherry、pAd-MafA-EGFP和pAd-Pdx-1-T-Ngn3-Cherry(毒滴度為1010pfu·mL-1)(上海吉凱基因化學有限公司);高糖培養(yǎng)基、低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國);鏈脲佐菌素、水合氯醛、40 g·L-1多聚甲醛、胰島素抗體(abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1轉染及誘導BMSCs

取生長良好的P3代細胞,待細胞融合達50%～60%,pAd-MafA-EGFP和pAd-Pdx-1-T-Ngn3-Cherry以MOI均為30轉染BMSCs。常規(guī)培養(yǎng)于體積分數10%胎牛血清、4.5 mmol·L-1葡萄糖DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、體積分數5%CO2恒溫培養(yǎng)箱,每日倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及熒光表達情況,每2 d換液1次,每次換液前用磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗細胞兩遍。

1.3.21型糖尿病大鼠模型的構建

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,禁食12 h,腹腔一次性注射鏈脲菌素(55 mg·kg-1),3 d后監(jiān)測每日血糖,選取連續(xù)7 d測空腹血糖>16.65 mmol·L-1作為1型糖尿病大鼠模型[5]。45只SD大鼠均造模成功,造模后1周隨機分組進行移植。15只normal組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.3腎被膜下移植

取P3代BMSCs以及誘導7 d后的IPCS,胰蛋白酶消化備用。15只健康大鼠作為正常對照組,將造模成功的45只SD大鼠隨機分為3組:sham-operation組、BMSCs組、IPCs組。腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠,剝離左側腎臟,1 mL注射器吸取0.2 mL BMSCs(細胞數2×106)注射到BMSCs組大鼠的腎被膜下,0.2 mL IPCs(細胞數2×106)注射到IPCs組大鼠的腎被膜下,sham-operation組和normal組大鼠腎被膜下注射等體積的生理鹽水。

1.3.4移植后監(jiān)測空腹血糖、體重及行IPGTT實驗

移植后第0、7、14、21、28天分別監(jiān)測大鼠的體重和空腹血糖。將大鼠放至捕鼠器中固定,用剪刀剪去少許大鼠尾部尖端,擠出少量血液,滴在血糖試紙凹槽中,記錄血糖儀顯示的血糖數值。鼠籠放置于天平上,設置天平歸零,將大鼠放入鼠籠中,觀察讀數并記錄。移植后21 d,將大鼠禁食12 h,葡萄糖按照每公斤體重2 g灌入大鼠胃內[6],注射前及注射后30、60、90 min監(jiān)測大鼠血糖并記錄。

1.3.5免疫組織化學

移植后第28天按照每公斤體重3 mL水合氯醛麻醉大鼠,完整取出腎臟,生理鹽水沖洗,迅速投入40 g·L-1多聚甲醛固定3 h,取出組織放入包埋盒,切片制片后進行組織化學染色,顯微鏡下拍照并進行ODI統(tǒng)計比較。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 移植后大鼠空腹血糖及體重變化情況

移植后第0、7、14、21、28天分別監(jiān)測血糖,BMSCs和IPCs組大鼠血糖隨時間下降,移植第21天兩組大鼠空腹血糖低于移植第0天,且均低于同期sham-operation組(P<0.05),移植第28天,IPCs組大鼠空腹血糖低于BMSCs組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠在移植各階段空腹血糖水平

移植后第0、7、14、21、28天分別稱量各組大鼠體重,移植第28天normal組大鼠體重高于移植第0天(P<0.05),sham-operation組大鼠體重低于第0天(P<0.05),而IPCs組大鼠體重高于移植第0天(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠在移植各階段體重水平

2.2 大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗

糖尿病大鼠葡萄糖耐量試驗曲線下面積大于正常大鼠,但各組糖尿病大鼠間也存在差異,糖尿病大鼠中IPCs組和BMSCs組曲線下面積小于sham-operation組,且IPCs組曲線下面積最小(P<0.05)。見圖1。

A圖為各組大鼠腹腔糖耐量實驗血糖水平曲線;B圖為各組大鼠腹腔糖耐量實驗血糖水平曲線下面積; *P<0.05。

2.3 大鼠腎臟免疫組化

大鼠腎臟免疫熒光顯示,normal組和sham-operation組大鼠腎臟組織未見明顯胰島素表達,BMSCs組和IPCs組大鼠腎臟組織可見棕色熒光的胰島素表達(圖2),BMSCs組和IPCs組胰島素熒光光密度高于sham-operation組(P<0.05),且IPCs組胰島素光密度高于BMSCs組(圖3)(P<0.05)。

A為normal組;B為sham-operation組;C為BMSCs組;D為IPCs組。

圖3 大鼠腎臟免疫組織化學圖片

3 討論

BMSCs分化為IPCs治療糖尿病成為新的研究熱點,前期研究已證實在體外BMSCs可被 Pdx-1-Ngn3聯合MafA誘導分化為可分泌胰島素并表達胰島素相關基因的IPCs[4-5,7]。那么其移植到體內能否存活及治療糖尿病大鼠呢?本研究擬通過Pdx-1-Ngn3聯合MafA誘導BMSCs分化為IPCs,移植到1型糖尿病大鼠體內,觀察其存活情況及療效。

本研究免疫組織化學結果提示移植組大鼠腎臟組織中存在胰島素分泌,證實移植的細胞可在移植部位存活并發(fā)揮分泌胰島素的功能,進而降低糖尿病大鼠的血糖以及改善高糖毒性所致的體重減輕現象。這與既往研究證實干細胞的可降低糖尿病大鼠的血糖[1]一致。

隨著移植時間的變化,各組大鼠血糖的變化提示移植細胞在體內發(fā)揮著降低糖尿病大鼠血糖的作用,且IPCs移植后糖尿病大鼠空腹血糖較其他糖尿病大鼠更低。這與體外實驗發(fā)現的IPCs較BMSCs分泌胰島素的水平高[4]是一致的。相反,各移植組糖尿病大鼠的體重隨時間變化出現增加趨勢,不排除這一現象系糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)得以緩解的表現,也不排除系糖尿病大鼠的胰島素抵抗得以解除所致[8]。研究顯示干細胞的外分泌及定向趨化作用可修復受損細胞的功能[9]。

腹腔糖耐量實驗曲線下面積顯示,移植組糖尿病大鼠的腹腔糖耐量實驗曲線下面積小于sham-operation組,考慮可能與干細胞移植后兩方面的作用有關,一是通過降低β細胞周圍的血糖濃度使其高糖毒性解除改善內分泌功能,二是通過趨化作用修復受損的β細胞改善糖尿病大鼠的胰島功能[10]。IPCs組腔糖耐量實驗曲線下面積小于BMSCs組,可能與關鍵轉錄因子調控后其分化以及功能更加完善有關[3,11]。

該研究證實BMSCs體外誘導分化后移植到糖尿病大鼠體內可發(fā)揮降糖作用,其創(chuàng)新之處在于,既往研究多選擇尾靜脈、腹腔等部位移植細胞[11-12],對于后續(xù)干細胞的追蹤存在一定的弊端,而本研究采用腎被膜下移植可使干細胞的追蹤易于進行。但其也存在不足之處,例如本研究的大鼠樣本量較小,研究時間較短,難免存在觀察方面的誤差。后續(xù)的研究可進一步加大樣本量,延長實驗觀察時間,也可對移植細胞進行熒光染色進行追蹤。

4 結論

BMSCs經體外誘導分化后移植到糖尿病大鼠體內可發(fā)揮分泌胰島素的功能,從而降低糖尿病大鼠血糖。Pdx-1、Ngn3和MafA聯合誘導后的IPCs發(fā)揮上述作用較BMSCs明顯增強。