秒轉錄組測序及生物信息學分析

Transcriptome Sequencing and Bioinformatics Analysis of Alsophila spinulosa

SHI YunLi'， YANG KaiBo'， LI QiJin'，HE QiuLan2，LIANG ShengHua2， CHEN JianHong2 HUANG HongBao2， HUANG YaoHeng2* （'Engineering Construction Management Branch of the China Southern Power Grid Peak and Frequency Modulation Power Generation Co.，Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510510， China； 2 Guangxi Key Laboratory of Special NonWood Forest Cultivationamp;Utilization，Guangxi Laboratory ofForestry/GuangxiForestry Research Institute，Nanning， Guangxi 530002， China；）

Abstract： 【Objective】As an ancient fern species existed from ancient time， Alsophila spinulosa has important ecological and economic value. This study aimed to reveal the gene expression characteristics of A. spinulosa through transcriptome sequencing， thereby providing a theoretical basis for its molecular breeding and functional research.【Method】In this study， high-throughput transcriptome sequencing and bioinformatics techniques were used to obtain the unigenes sequences of A. spinulosa.After data cleaning and quality control， the Trinity software was used for assembly，followed by annotation through comparison with five databases：NR， KOG， SwissProt， GO， and KEGG.Additionally， potential molecular markers were identified through SSR analysis.【Result】A total of 46 664 870 raw reads were obtained through transcriptome sequencing， and 43 877 810 clean reads were retained after filtering， accounting for 94% of the raw reads. The Q30 base distribution reached 96.65% ， and the GC content was 47.35% . 35 359 unigenes were assembled after redundancy removal， withatotallength of41138 988 bp.The longest unigenes was 15 891 bp， and the N50 was 1555 bp. The annotation results showed that the highest number of unigenes 26 213， 74.13% were matched to the NR database， with the highest homology to Adiantum capillus-veneris. In KOG， SwissProt，GO and KEGG，17 166（ 48.55% ，18208（ 51.49% ，12247（ 34.64% ，and9063（ 25.63% ） unigenes were annotated， respectively. 5 341 unigenes were annotated in all databases， accounting for approximately 15.11% . Furthermore， a total of 8 996 SSR loci were detected. 1 346 were single nucleotide repeats， accounting for approximately 14.96% ，among which A/T were the most. In dinucleotide repeats， most were AG/CT （3 405）， accounting for approximately 37.85% . The types of trinucleotide repeats were the most， mainly including AAG/CTT（526） and AGC/CTG（478）.【Conclusion】Through transcriptome sequencing and bioinformatics analysis， this study unvealed the gene function and metabolic network of A. spinulosa， providing a foundation for further investigation of functional genes， genetic diversity， and molecular markers.

Keywords： Alsophila spinulosa； transcriptome； bioinformatics； gene annotation； SSR

0 引言

【研究意義】秒楞（Alsophilaspinulosa）又名刺紗，是楞科（Cyathenaceae）秒屬（Al-sophila）的重要代表植物。作為現存唯一的樹形蕨類植物，被譽為“活化石”，并被列為國家二級保護野生植物（宗秀虹等，2016；廖阿慶，2024），具有重要的生態價值。秘的生態地位使其成為珍稀物種，但由于過度采伐，秘的生存面臨威脅，部分地區已瀕臨滅絕（RANILetal.，2017）。此外，秒楞株形美觀，莖蒼葉秀，髓可入藥，具有一定的觀賞價值和藥用價值（范劍明等，2023），因此其生態保護和利用具有重要的科學意義。研究秒轉錄組和相關生物學信息，有助于提高秒楞的種植、保護及其藥用開發的潛力。【前人研究進展】隨著新一代測序技術（NGS）的發展，RNA-Seq作為一種高效、可行的研究方法，已被廣泛應用于植物的基因表達譜分析（王悅等，2022）。高通量轉錄組測序技術在植物研究領域的應用較早且深入，無論是在木本植物還是草本植物中均有所成就。JU等（2018）和CHENG等（2024）分別分析了紫薇（Lagerstroemiaindica）和錦繡杜鵑（Rhododen-dronpulchrum）的轉錄組信息，分析了細胞模式調控的差異表達基因（differential expressed genes，DEGS），并在轉錄水平評估了這些基因之間的調控關系。LI等（2020）通過比較菠菜（Spinaciaolera-cea）雄花和雌花的轉錄組數據，對其可變剪接、可變多聚腺苷酸化及長鏈非編碼RNA進行了綜合分析，探索了菠菜的性別分化機制，為菠菜的功能基因組學研究奠定了基礎。轉錄組學已成為獲取基因序列的重要方法，對于揭示生物系統的遺傳網絡、挖掘候選基因以及進行功能鑒定等生物學研究至關重要（李健玲等，2023；夏銘澤等，2024）。蕨類植物擁有超過10000種現存物種，是無種子維管植物中種類最豐富的群體（SMITHetal.，2006）。水蕨（Ceratopteristhalictroides）為一年生水生或濕生的同型孢子蕨類植物，通過比較海南島的3個水蕨種群和邢氏水蕨的葉綠體基因rbcL序列，發現海南島的3個水蕨種群為南方型水蕨，同時為邢氏水蕨的分類提供了佐證（董元火等，2024）。秒楞一直受到學術界的關注，過去的研究主要集中在秒的群落學、繁育栽培以及化學藥理等方面，探索其生長環境、繁殖特性和藥用成分等（袁守良和白小節，2005；何琴琴，2011；侯夢丹等，2023；王文沛等，2023）。近期，在秒植物生理生化方面的研究已有相關報道，如對秒楞幼苗在干旱脅迫下的生理反應（呂朝燕等，2023）以及不同光照強度下葉片性狀和光合作用特性的變化（劉雯雯等，2024）進行了研究。【本研究切入點】目前，關于秒楞的轉錄組學研究仍較為有限，尤其是分子調控機制尚未得到深入探討。【擬解決的關鍵問題】本研究利用RNA-Seq技術，采用生物信息學方法對秒楞葉片的轉錄組進行分析，通過轉錄組數據探究秒的基因表達，旨在探討秒楞的分子調控機制，為秘的分子育種和藥用價值挖掘提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2024年10月，在廣西壯族自治區南寧市廣西林科院那坨苗圃中采集植株生長健壯、無病蟲害的秒楞葉片作為轉錄組測序樣品。采集的葉片立即放入液氮中進行快速冷凍，隨后轉移至一 冰箱中保存以備后續使用。

1.2秒RNA提取及文庫構建

使用TRIzol法提取每個秒楞樣品的總RNA。采用Agilent2100生物分析儀對每個樣品的總RNA的質量進行檢測，并使用NanoDrop-2000定量。采用 Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit （Illumi-na，美國）試劑盒構建文庫，將含有Oligo（dT）的磁珠富集帶有polyA尾巴的真核mRNA后，利用超聲波打斷。以打斷的mRNA為模板，加入隨機寡核苷酸，在逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈。然后用RNaseH降解RNA鏈，再通過DNA聚合酶和dNTPs合成第二條鏈cDNA。雙鏈cDNA經過純化、末端修復、加A尾、連接測序接頭后，用AMPureXP磁珠篩選出約200bp的cDNA片段，進行PCR擴增并再次純化，最終得到測序文庫。

1.3轉錄組測序及拼接組裝

利用IlluminaNovaSeq 6000測序平臺對秒葉片轉錄組文庫進行測序。在測序的flowcell中加入4種帶熒光標記的dNTP、DNA聚合酶和接頭引物進行擴增。每當一個熒光標記的dNTP被加入延伸的互補鏈中時，就會釋放出對應的熒光信號。測序儀通過捕獲這些熒光信號，并利用計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而解析出待測片段的序列信息，稱之為rawreads或rawdata。使用Trimmomaticv0.36對原始配對末端reads進行修剪和質量控制，獲得clean reads。然后用Trinityv2.8.6軟件對所有的干凈數據進行denovo組裝，之后再利用CD-HIT軟件聚類去冗余得到最終的unigenes序列文件。

1.4Unigenes功能注釋

使用Diamondv0.9.22.123軟件在NR數據庫、KOG數據庫、KEGG數據庫和SwissProt數據庫進行比對，利用eggNOG-mapperv5.0進行GO數據庫的注釋。取e-value 的注釋，篩選具有序列相似性最高的蛋白，從而獲得unigenes序列的功能注釋信息。

1.5 SSR分析

使用BWA和Samtools軟件將高質量測序reads與unigenes序列比對。用MicroSatellite對基因轉錄本進行SSR位點的檢測，對應的各重復類型最少重復次數為兩堿基6次，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基分別為5次，并對SSR的發生頻率、基元類型、基元長度和基元重復次數進行分析。使用MISA軟件識別SSR位點并進行引物設計。

2 結果與分析

2.1秒楞轉錄組測序及組裝

秘楞葉片經過RNA提取，cDNA文庫的構建之后，對其進行轉錄組測序，獲得46664870條raw reads，共計 。通過過濾reads中的接頭序列、質量較低的堿基以及短序列后，得到43877810條cleanreads，占rawreads的94% ，總長度為 。其中Q20basesratio高達 98.74% ，Q30basesratio高達 96.65% ，GC含量為 47.35% 。結果表明獲得的轉錄組數據質量較高，可以用于后續的數據分析。

由于秒楞沒有參考基因組，使用Trinity軟件對獲得的所有cleandata進行從頭組裝。去余后共獲得35359條unigenes，總長41138988bp。最長的unigenes為 ，平均長度為1163.47bp，N50為 。unigenes的N50值大于平均值，表明秘轉錄組的測序深度大，拼接效果較好。將質控后得到的高質量序列與拼接序列進行比對，比對率達到 92.76% ，再次表明組裝效果較好。35359條unigenes中，長度為 的數量最多，達到8876條，占比約 25.1% ；長度為

的數量最少，僅為11條，占比約0.03% （圖1）。

2.2秒轉錄組注釋

將秒組裝后的unigenes序列與五大常見數據庫進行比對，結果如圖2所示。其中，注釋到NR數據庫的unigenes數量最多，為26213條，占比約74.13% ；注釋到KOG數據庫的unigenes數量為17166條，占比 48.55% ；KEGG數據庫被注釋到的unigenes最少，為9063條，占比約 25.63% 。此外，至少在一個數據庫中注釋成功的unigenes數量為26253條，約占總基因數的 74.25% ；而在所有數據庫中均注釋成功的基因數量為5341條，約占總基因數的 15.11% 。

2.3 NR數據庫

將得到的序列與NCBI的數據庫（NR庫）進行比較，可以獲得unigenes序列與相近物種的匹配情況。由圖3可知，與紗轉錄組序列同源性最高的物種是鐵線蕨（Adiantumcapillus-veneris），達到11512條，約占匹配到序列總數的 43.92% 其次是蓮葉鐵線蕨（Adiantumnelumboides），為8841條，約占 33.73% ；排名第三的為水蕨（Ceratopter-isrichardii），比對到2981條，占比約 11.37% ；另外在扁枝石松（Diphasiastrumcomplanatum）、日本柳杉（Cryptomeriajaponica）、寬葉卷柏（Selag-inellamoellendorffii）、紅豆杉（Taxuschinensis）、地錢（Marchantiapolymorpha）、馬毛大葉蘚（Sphagnummagellanicum）、泥炭蘚（Sphagnumfallax）分別比對到699、148、99、90、86、75、73條，占比約為 2.67% 、 0.56% 、 0.38% 、 0.34% ，0.33% 、 0.29% 、 0.28% 。

2.4 KOG數據庫

為了進一步探索秒楞轉錄組中基因的功能特性，利用KOG數據庫對注釋到的17166條unigenes進行了功能分類，共劃分為25個功能類別，如圖4所示。從分類結果來看，功能類別中unigenes數量最多的是次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝（Secondary metabolites biosynthesis， transportandcatabolism，Q），包含2687條基因。其次是脂質轉運與代謝（Lipidtransport and metabolism，I），為2675條。功能未知（Functionunknown，S）

排名第三（2496條），表明轉錄組中仍然存在大量功能尚未明確的基因，這為后續功能研究提供了潛在的研究方向。轉錄后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋 白（Posttranscriptional modification，pro-tein turnover，chaperones，O）、信號傳導機制（Sig-nal transductionmechanisms，T），和轉錄（Tran-scription，K）的unigenes數量分別為1840、1653和1072條，顯示了秒在遺傳信息表達及能量代謝方面的活躍性。

2.5 GO注釋

對秒轉錄組unigenes進行GO功能注釋，共注釋到12247條unigenes，分為分子功能（molec-ular function，MF）、生物過程（biologicalprocess，BP）和細胞組分（cellularcomponent，CC）三大類和41個亞類（圖5）。在第一大類BP中，共含有24個亞類，其中細胞過程（cellularprocess）注釋到的unigenes數量最多，而碳利用（carbonutiliza-tion）、氮利用（nitrogenutilization）、生物黏附（biologicaladhesion）和生物礦化（biomineraliza-tion）中注釋到的數量少；在第二大類MF中，注釋到14個亞類，其中催化活性（catalytic activity）和結合因子（binding）的unigenes數量最多，而蛋白標簽（proteintag）、營養儲存活性（nutrient res-ervoiractivity）和小分子傳感器活性（smallmolec-ular sensor activity）的unigenes數量少；在第三大類CC中，僅注釋到3個亞類，其中細胞解剖學實體（cellular anatomical entity）的unigenes最多，而蛋白復合體（protein-containingcomplex）的unigenes數量最少。

2.6 KEGG通路分析

利用KEGG數據庫對秘的轉錄組數據進行注釋和功能分析，進一步揭示其生物學過程中的代謝路徑和基因功能分布情況。結果表明，注釋到的基因主要分布于五大功能分類系統，包括代謝過程、遺傳信息處理、環境信息處理、細胞過程、有機系統（圖6）。第一大系統代謝過程包含11個亞類，共9582條unigenes，其中全球及概覽地圖（Globalandoverviewmaps）相關unigenes最多（5473條），約占總數的 40% 以上；此外，氨基酸代謝（Aminoacidmetabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）和脂質代謝（Lipidmetabolism）的unigenes也占據了顯著比例，分別為629、1104、561條，共占約 17.40% 。第二大系統是遺傳信息處理系統，包含5個亞類，翻譯（Translation）亞類中比對到的unigenes最多，達到768條；折疊、分類和降解（Folding，sorting and degradation）亞類次之，為759條。第三大類為環境信息處理系統，包括2個亞類，主要涉及信號轉導（Signaltransduc-tion）和膜轉運（Membranetransport）通路，分別比對到458條和38條unigenes。第四大系統為細胞工程（Cellularprocesses），包括運輸與分解代謝（Transport andcatobolism）和細胞運動（Cellmotil-ity）2個亞類，分別比對到431條和138條unige-nes。在有機系統中，涉及環境適應（Environmen-tal adaptation）的unigenes較少，為296條。

2.7 SSR分析

利用轉錄組數據對秒楞進行SSR（簡單重復序列）位點的檢測和分析，共發現6種類型的SSR，包括單核苷酸重復（Mononucleotide）、雙核苷酸重復（Dinucleotide）和三核苷酸重復（Trinucleotide）等。如圖7所示，SSR位點中單核苷酸重復類型為1346條，占比約 14.96% ，其中以A/T重復最為豐富，表明其在秘基因組中的顯著優勢地位。此外，雙核苷酸重復類型中AG/CT最多（3405條），占比約 37.85% ，是雙核苷酸重復中最主要的類型。三核苷酸重復中類型最多，常見類型為AAG/CTT（526條）和AGC/CTG（478條），其數量顯著高于其他類型，顯示出秒楞特定基因區域在進化過程中的保守性。四核苷酸（Tetranucleotide）、五核苷酸（Pentanucleotide）和六核苷酸（Hexanucleotide）重復類型較少，分布數量相對較低。SSR位點多態性與基元的堿基數和重復次數相關（楊也等，2024），當基序長度大于等于 時，其多態性較高。根據SSR長度分類，長度小于 的SSR占大多數，而大于 的SSR比例較低。根據引物設計原則篩選了一些符合條件的引物（表1），這將為后續分子標記的開發提供參考。

3討論

目前國內對的研究主要集中在引種栽培（曾莉莉等，1997）、組織培養（郭秉左，2000）和基因結構（WANGetal.，2019）等方面，并取得了一定的研究成果。然而，在組學層面的研究主要集中在基因組學方面。在鐵線蕨的葉綠體基因組研究中展示了維管植物中未曾見過的一些獨特特征，如tRNA基因缺失，這種現象此前僅在非光合植物的葉綠體基因組中觀察到（WOLFetal.，2003）。通過比較4種蕨類植物葉綠體基因組序列，確認了2個主要的重排事件將高等薄囊蕨類與基部蕨類譜系區分開來。秒楞的葉綠體基因組在基因組成、基因順序和GC含量方面與薄囊蕨類植物鐵線蕨相似（GAOetal.，2009）。2020年首次從高通量測序數據中組裝和表征了秒的完整葉綠體基因組（MAetal.，2020）。轉錄組是指在特定時空條件下，某一生物體的細胞或組織轉錄的所有RNA的總和（張春蘭等，2012）。轉錄組測序被廣泛用于探索功能基因、確定代謝通路和轉錄調控機制等多個方面。本研究通過轉錄組測序和生物信息學分析，系統地揭示了秒的基因表達特征和代謝通路，提供了關于遺傳基礎和生態適應性相關的數據。首先，轉錄組測序共獲得35359條unigenes，與NR、KOG、SwissProt、GO和KEGG五大數據庫進行比對的結果表明，注釋到NR數據庫的基因占比最高（ 74.13% ），且在NR數據庫中顯示，秒與鐵線蕨同源性最高，與其他物種的同源性均較低。其次，KOG功能分類結果顯示，注釋到17166條unigenes，占比 48.55% ，與翻譯、核糖體生物合成及能量轉化等相關的基因豐度較高，進一步證明了秒楞在維持細胞基本生命活動方面的穩定性和適應能力。對基因通路進行KEGG分析結果表明，注釋到的unigenes最少（9063條），占比約 25.63% ，秒羅轉錄組中的基因主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、轉錄調控等重要生物學過程，揭示了秘在代謝調控和基因表達方面的復雜性。SSR分析發現了大量A/T和AG/CT重復序列，這些SSR位點不僅具有較高的多態性，且易于開發為分子標記，具有廣泛的應用潛力。未來的研究可以進一步探索在不同生態環境中的適應性機制以及特定功能基因的精細調控，為秒楞的保護與育種提供理論依據。

4結論

本研究通過轉錄組測序和生物信息學分析，揭示了秘楞的基因功能和代謝網絡，為今后進一步挖掘其功能基因、遺傳多樣性、分子標記奠定了基礎。

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（責任編輯 謝紅輝）