秒楞葉綠體基因組特征及其系統發育分析

Chloroplast Genome Characteristics and Phylogenetic Analysis of Alsophila spinulosa

CHEN JianHong'，LONG Fang2， LIU Cao2， LIANG ShengHua'，HE QiuLan'， HUANG HongBao'，HUANG YaoHeng'，ZHU ZeKuan2*

（' Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation amp; Utilization， Guangxi Laboratory of Forestry， GuangxiForestry Research Institute，Nanning， Guangxi 53002， China；2Engineeing Construction Management

Branch of the China Southern Power Grid Peak and Frequency Modulation Power Generation Co.， Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510510， China）

Abstract： 【Objective】 This study aimed to investigate the structural characteristics and functional genes of the chloroplast genome in Alsophila spinulosa，explore its genomic evolutionary characteristics，andrevealthephylogeneticrelationships ofA.spinulosawith itsrelated speciesbasedon chloroplast genome data， so as to provide a basis for the taxonomy and evolutionary studies of ferns. 【Method】Using high-throughput sequencing technology， the complete chloroplast genome sequence was obtained， and bioinformatics tools were employed for genome annotation and SSR analysis.Related fern species were selected as references， and a phylogenetic tree was constructed based on chloroplast protein-coding genes to analyze evolutionary relationships among them.【Result】The chloroplast genome of A. spinulosa had a typical tetradic structure， with a total length of approximately 156 196 bp and a GC content of 40.44% . A total of 132 functional genes were annotated， including 89 protein-coding genes， 35 tRNA genes， and 8 rRNA genes. In the chloroplast genomes， 127 SSRs were identified， and most of them（94， accounting for approximately 74.02% ）were single nucleotide SSRs. Codon preference analysis revealed that among the 30 codons with RSCU values greater than 1，28 ended with A or U and 2 ended with G or C. Phylogenetic analysis demonstrated that the chloroplast genome（PQ740943.1）of A. spinulosa used in this study and the chloroplast genome of A. spinulosa published in NCBI （NC012818.1）were in the same cluster， both sharing close relationships with Sphaeropteris； and A. spinulosa had a close genetic relationship with A.podophylla and A. denticulata.【Conclusion】The chloroplast genome of A. spinulosa contains a conserved genomic structure and gene composition. The results provide data support for the taxonomic position and evolutionary history of Alsophila plants. Furthermore， this study lays a foundation for the evolutionary studies， species identification and genetic diversity analysis of ferns.

Keywords： Alsophila spinulosa； chloroplast genome； codon preference； phylogenesis

0 引言

【研究意義】秒楞（Alsophilaspinulosa）是秒科秘屬蕨類植物，是白堊紀末、第三紀早期冰川的子遺植物，為現今僅有的木本蕨類植物，被列為國家二級保護植物。蕨類植物，又叫羊齒植物，喜愛陰涼環境（LIetal.，2014）。根據文獻記載，蕨類植物的起源可以追溯到約4億年前，是地球上最早出現的維管植物之一（王婷等，2022）。蕨類植物是植物界重要的類群，代表了種子植物之前的一個演化階段，在研究植物進化和系統發育方面扮演著重要角色（ROTHFELSetal.，2015）。葉綠體基因組因其在光合作用、氨基酸合成及生物分類學中的重要作用，被廣泛應用于植物的系統發育研究（SONGetal.，2022a，2022b）。秒楞不僅具有園林觀賞價值，還兼具藥用和科學研究意義（范劍明等，2023；廖阿慶，2024）。因此，研究屬植物葉綠體基因組特征并構建其系統發育關系，不僅對蕨類植物的分類與進化研究具有重要意義，也為保護瀕危植物提供科學依據。【前人研究進展】研究表明，蕨類植物最早具備較多的染色體數量，這與其早期分化及基因組重構密切相關（CLARKetal.，2016）。葉綠體基因組由環狀DNA分子組成，其進化速率低于核基因組，但高于線粒體基因組，在系統發育研究中發揮著重要作用（錢方等，2022；SHIetal.，2023）。高通量測序技術推動了植物葉綠體基因組研究的快速發展，積累了豐富的數據資源，為推測植物分期時間及生物地理提供了科學依據（WANGetal.，2021；龔琴，2024）。蕨類植物的葉綠體基因組大多系母系遺傳，在進化過程中可以保持相對的獨立性（GASTONYandYATSKIEVYCH，1992）。鐵線蕨中發現的PHY3嵌合體蛋白對紅藍光響應敏感，為蕨類植物在弱光環境下的生存發育提供了重要支撐（嚴岳鴻等，2019）。基于葉綠體基因組的鳳尾蕨屬研究表明，遠距離擴散是其全球分布的主要驅動力（CHAOetal.，2014）。【本研究切入點】目前，秒楞屬植物的葉綠體基因組數據仍較為有限，限制了對其系統發育關系和進化機制的深入研究。雖然已有多種蕨類植物的葉綠體基因組被解析并應用于分類學研究，但楞屬植物的葉綠體基因組特征尚未得到系統研究。因此，本研究將聚焦屬代表物種，通過葉綠體基因組測序，探索其基因組特征。【擬解決的關鍵問題】通過高通量測序技術解析秒屬代表物種的葉綠體基因組特征，并以此為基礎探討秒屬植物與其近緣物種的系統發育關系，為進一步研究紗屬植物的進化特征及其在蕨類植物分類學和進化生物學中的地位提供理論和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以種植于廣西壯族自治區南寧市廣西壯族自治區林業科學研究院那坨苗圃的紗楞植株為試驗材料，從生長健壯的植株上摘取新鮮葉片，用紙巾擦拭干凈后，隨即放入液氮中速凍，接著轉移至一 超低溫冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及測序

使用改良的CTAB法提取紗葉片的總DNA，檢測合格后，通過Covaris超聲波破碎儀將其隨機打斷，經末端修復、加A尾等標準流程構建DNA文庫，在IlluminaNovaseq 6000平臺進行測序獲得高質量數據（cleandata）。

1.2.2葉綠體全基因組序列組裝與注釋

使用PAdesv3.11.0軟件（BANKEVICHet al.，2012）對獲得的cleandata進行denovo組裝，設置kmer值分別為93、95、97、103、105、107、115。采用PGAv1.0.0軟件（QUetal.，2019）注釋秒葉綠體基因組，利用反向Blast確認基因在葉綠體基因組中的具體位置。最終，將拼接并注釋完成的葉綠體基因序列上傳至OGDRAW（GREINERetal.，2019），利用在線工具生成注釋圖譜。

1.2.3葉綠體基因組特征分析

利用MISAv1.0軟件（BEIERetal.，2017）對秒楞葉綠體基因組中的簡單重復序列（SSR）進行分析檢測。單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復閾值分別設為8、5、4、3、3和3，2個SSR位點間的最小檢出距離設置為 ，其余參數為默認參數。

1.2.4密碼子堿基組成和偏好性分析

通過Perl腳本提取基因組的蛋白質編碼序列，去除重復序列和長度小于 的序列，保留以ATG為起始密碼子并以TAA、TAG或TGA為終止密碼子的編碼序列。對過濾后的序列進行密碼子堿基組成分析，并使用CodonWv1.4.2軟件分析葉綠體基因組蛋白編碼基因的密碼子偏好性，計算相對同義密碼子使用度（relative synonymousco-don usage，RSCU）的值。

1.2.5 系統發育分析

從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nihgov/）中下載11個物種的葉綠體基因組序列與本研究獲得的秒楞序列一起進行系統發育分析（表1），其中7個來自屬（Alsophila，Cyathea），2個來自白秒楞屬（Sphaeropteris），以2個金毛狗屬（Ci-botium）物種的序列作為外群。通過MAFFTv7.037軟件（ROZEWICKIetal.，2019）進行多重序列比對，使用PhyloSuitevl.2.3軟件中的ModelFinder選擇最佳模型 進行系統發育分析；最后利用IQtreev2.2.0（MINHetal.，2020）構建最大似然（maximumlikelihood，ML）系統發育樹，1000次重復的Bootstrap檢驗。

2 結果與分析

2.1秒葉綠體基因組基本特征

楞葉綠體基因組組裝圖譜見圖1，為一段全長156196bp的雙鏈環狀四分體分子，其結構包括86 313bp的大單拷貝區（large single copy，LSC）、 的反向重復A區（invertedrepeatA，IRA）、21623bp的小單拷貝區（small singlecopy，SSC）以及24130bp的反向重復B區（in-vertedrepeatB，IRB），這些區域以順時針方向依次排列。其中，IRA和IRB是具有相同堿基序列但轉錄方向相反的一對重復區，該基因組的GC含量為 40.44% 。獲得的秒楞葉綠體全基因組序列已上傳至NCBI數據庫，獲得的序列登錄號為PQ740943.1。本研究的平均測序深度為159.44X，并以NC012818.1作為注釋的參考基因組。經過基因注釋后，秒楞共鑒定出132個基因，包括蛋白編碼基因89個、rRNA基因8個、tRNA基因35個。根據注釋信息，分為4類（表2）：一是psaA、psaB、psaC等44個與光合作用相關的基因，二是rps3、rps4、rps7、rps8等58個與蛋白質合成和DNA復制相關的基因，三是5個未知功能基因ycfl、ycf2、ycf32、ycf4和ycf12，四是6個其他基因matK、clpP、cemA、accD、ccsA和infA。此外，對楞葉綠體基因組的內含子進行了分析，發現rpsl6、trnG-UCC、atpF、rpoC1、trnL-CAA、trnV-UAC、petB、petD、rpll6、rpl2、trnA-UGC、trnI-GAU和ndhA等基因中各包含1個內含子，而clpP和ycf3基因則含有2個內含子。此外，ndhB和rps12基因中存在反式剪接現象。

2.2 SSR特征分析

對楞葉綠體基因組進行SSR分析，共檢測到127個符合預設條件的SSR（表3），其中大多數為單核苷酸SSR，共94個，約占總數的 74.02% ，其中A/T重復73個，C/G重復21個；二核苷酸SSR共19個，約占總數的 14.96% ，包含AG/CT和

AT/AT基因序列；三核苷酸SSR僅2個，約占總數的 1.57% ，包含AAG/CTT和AAT/ATT基因序列；四核苷酸SSR有12個，約占總數的 9.45% ，重復序列有5種類型，包含AAAG/CTTT、AAAT/ATTT、AACC/GGTT、AGAT/ATCT、AGGG/CCCT。

2.3 密碼子堿基組成及偏好性分析

對秒葉綠體密碼子進行分析所得的結果如表4所示，葉綠體基因編碼區包含21887個密碼子（不含終止密碼子），用于編碼20種已知氨基酸。其中，甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）各由單一密碼子編碼，其余氨基酸則由2至6種密碼子進行編碼（圖2）。出現次數最高的氨基酸為亮氨酸（Leu），包含UUG、CUA、CUU、UUA、CUG、CUC，總數為2260個，約占總數的 10.33% 。其次是編碼絲氨酸（Ser）的密碼子UCC、UCG、UCU、AGU、UCA、AGC，總數為1862個，約占總數的 8.51% ，其中UCU使用頻率最高，達483個。半胱氨酸（Cys）的密碼子使用頻率最低，包括同義密碼子UGC和UGU，總計233個，其中UGC僅有73個。RSCU是衡量葉綠體基因組中密碼子使用偏好性的重要指標，RSCU值等于1表示密碼子符合期望使用頻率，小于1.00表示使用頻率低于期望值，大于1.00表示使用頻率高于期望值（黃色彩等，2024）。本研究中共有30個密碼子的RSCU值大于1，其中28個以A或U結尾，僅2個以G或C結尾。使用頻率最高的密碼子為GCU，RSCU值達到1.78；最低的是AGC和GGC，RSCU值均為0.41。編碼Leu的CUA、編碼Met的AUG和編碼Trp的UGG的RSCU值為1，表明無偏好性。其余28個密碼子的RSCU值小于1，使用頻率較低。

Fig.2 Base composition of chloroplast protein encoding genes inA. spinulosa

2.4 系統發育分析

為了更好地了解紗楞的種屬親緣關系，將與屬、白紗楞屬、金毛狗屬共12個物種的葉綠體基因組序列構建ML系統發育樹（圖3）。不同屬物種根據親緣關系遠近聚類在一起，12個物種可分為2類。本研究的秒葉綠體基因組序列（PQ740943.1）與NCBI已公開的秒葉綠體基因組序列（NC012818.1）聚在一個分支，支持率為100% ；屬其他物種如小葉楞（A.podophyl-la）、鋸齒秒（A.denticulata）等與秒楞親緣關系較近，其次為白屬（Sphaeropteris）；金毛狗屬（Cibotium）2個物種聚在另一個分支，且與秒親緣關系較遠。

3討論

葉綠體是植物體內自我復制和母系遺傳的特異性細胞器，具有完整獨立的基因組，分子量小、保守性強，常作為研究物種分類和進化的重要對象（DANIELLetal.，2016）。本研究通過Ilumina測序平臺，獲得秘的葉綠體基因組全長為156196bp，總GC含量為 40.44% ，為典型的四分體結構，由86313bp的LSC區、21623bp的SSC區和24130bp的IRs重復區組成，與NCBI已經公布的葉綠體基因組（NC012818.1）基本結構（GAOetal.，2009）相似，與已報道的大多數物種的葉綠體基因組特征（ZHANGetal.，2012）也相符。不同植物之間葉綠體的tRNA基因數目存在差異，如山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）注釋到30個tRNA（崔英賢，2020），黑果枸杞（Lyciumruthenicum）注釋到36個tRNA（柳迪等，2024）。本研究共注釋到132個功能基因，包括89個蛋白編碼基因、35個tRNA基因和8個rRNA基因；而NC012818.1基因組注釋到117個功能基因，其中85個蛋白編碼基因、28個tRNA基因和4個rRNA基因（GAOetal.，2009）。SSR廣泛存在于動植物中，由于在進化過程中堿基容易錯位（JANSENetal.，2011），因此被用于物種鑒定、遺傳多樣性分析等領域（QIetal.，2014）。在秒楞葉綠體基因組中檢測到127個SSR位點，多數為單核苷酸SSR，共94個（約占總數的 74.02% ），以A/T為主。

密碼子偏好性是在基因突變和物種進化等多種因素影響下形成的，不同物種間密碼子的出現頻率不同（CHIAPELLOetal.，1998）。編碼葉綠體基因的密碼子共有21887個（終止密碼子除外），由61種密碼子編碼20種已知氨基酸。出現頻率最高的氨基酸為Leu，總數為2260個，約占總數的 10.33% ，其次是編碼Ser的密碼子1862個，約占總數的 8.51% ，其中UCU的使用頻率最高；出現頻率最低的是Cys，共233個，其中UGC僅含73個，這一結果與大多數被子植物的相關研究結果一致（柳迪等，2024；陸葉等，2024）。RSCU值大于1的密碼子有30個，其中堿基構成以A/U結尾的有28個，G/C結尾的為2個，表明葉綠體基因組的密碼子偏好以A/U結尾。基于葉綠體基因組序列的系統進化分析顯示，本研究的秒序列與NCBI上已公布的秒楞序列（NC012818.1）聚在一個分支，表明物種鑒別方法正確。另外，與小葉秘和鋸齒楞聚在一起，表明它們親緣關系較近。

4結論

本研究對秒葉綠體基因組的基本特征、遺傳特點和系統進化位置進行分析，發現與已公布的葉綠體基因組整體結構相似，下一步可通過序列比對深入分析兩者在SNP、InDel等分子標記上的差異，并可結合樣品地理位置、生境環境、表型差異等揭示秒種內及種間進化的分子特征，進一步為秒楞屬植物物種鑒定及系統發育關系研究提供理論依據，為蕨類植物的保護與研究提供參考。

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（責任編輯 謝紅輝）