和樞消積方對人肝癌細胞系HepG2增殖凋亡的影響 *

楊宗林 彭孟云 朱曉寧 汪 靜※

（1.西南醫科大學中西醫結合學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院肝膽病科，四川 瀘州 646000）

原發性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第6 大最常見的癌癥，是我國第4 位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因［1］。早期HCC 可選擇手術、局部消融、肝動脈化療栓塞等治療，但術后易復發，5 年復發率高達70%［2］。因此，探索和發現有效的HCC 治療策略仍然具有迫切性。丙型肝炎病毒（HCV）非結構5A蛋白（NS5A）反式激活基因13（HCV NS5A trans-regulated protein 13，NS5ATP13）是利用抑制性消減雜交技術發現的新基因［3］，研究［4］發現其可影響細胞的增殖、分化、rRNA 轉錄等，與腫瘤進展密切相關。和樞消積方是西南醫科大學附屬中醫醫院汪靜教授多年來治療HCC 的經驗方。在長期臨床中我們發現，該方能顯著減緩肝癌的進展、提高患者生存率。然而其治療HCC的機制尚不明確，推測其抗癌作用可能與調控NS5ATP13 有關，本研究采用和樞消積方作用于人肝癌細胞系HepG2，觀察和樞消積方對HepG2 增殖凋亡的影響，并初步探究其分子機制，為和樞消積方治療HCC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人肝癌細胞系HepG2，由賽百慷（上海）生物技術股份有限公司提供。

1.1.2 實驗藥物和樞消積方（由柴胡、黃芩、黃芪、雞內金、生麥芽、醋鱉甲等組成）由西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科提供。將所有飲片混勻，2500 mL 蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min，收集藥液，藥渣再加1000 mL蒸餾水煎煮30 min，合并2次藥液，濃縮至含原藥材1.5 g∕mL，0.22 μm微孔濾器過濾除菌備用。

1.1.3 實驗試劑Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購自上海碧云天生物技術有限公司；B 淋巴細胞瘤-2 基因（BCL-2）、BCL-2 相關X 蛋白（BAX）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）、磷酸（p）-GSK-3β 單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、p-MTOR、NS5ATP13 單克隆抗體購自美國加州Santa Cruz公司。

1.2 研究方法

1.2.1 CCK-8法檢測各組細胞活力及藥物濃度篩選將HepG2 細胞接種于96 孔板，加入不同濃度和樞消積方（0 μg∕mL、 3.75 μg∕mL、 7.50 μg∕mL、 15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL、60.00 μg∕mL）干預24 h，配制CCK-8工作液，每孔加入100 μL 工作液，37 ℃孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm 的吸光度（A） 值。 細胞活力=（A加藥-A空白）∕（A對照-A空白）×100%，細胞增殖抑制率=（A對照孔-A實驗孔）∕（A對照孔-A空白孔）×100%。以半數抑制濃度（IC50）為最佳藥物濃度，設為高劑量組，并根據高劑量組濃度的1∕4 及1∕2 設置低劑量組及中劑量組（分別為7.50 μg∕mL、15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL）。分別檢測不同濃度和樞消積方干預HepG2 細胞24 h、48 h、72 h后的光密度（OD）值，計算相對應的細胞活力及增殖抑制率。

1.2.2 平板克隆實驗檢測各組細胞增殖能力將HepG2細胞以500 個∕孔接種于6 孔板中，按實驗分組分別加入低、中、高劑量和樞消積方藥液干預，37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h后換用完全培養基繼續培養，每2 d更換培養基，出現肉眼可見的克隆時，終止培養。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、甲醛固定、結晶紫染色，觀察細胞克隆數，拍照記錄。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western Blot）使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。99 ℃，10 min 加熱變性后，進行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳1.5 h 后將蛋白質轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，封閉、孵育一抗、二抗，曝光顯色并保存圖像。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件及GraphPad Prism Version 8.0.2 進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較用配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 和樞消積方對人肝癌細胞系HepG2細胞活性的影響與對照組相比，隨著和樞消積方濃度的增加，HepG2細胞活性逐漸降低，當和樞消積方濃度≥7.50 μg∕mL 時，差異有統計學意義（P＜0.01）；當和樞消積方濃度為30.00 μg∕mL時，IC50約為50%，故本實驗選用7.50 μg∕mL、15.00 μg∕mL、30.00 μg∕mL 分別作為低、中、高劑量組進行后續實驗。見圖1。

圖1 不同濃度和樞消積方對HepG2細胞活性及抑制率的影響

采用CCK-8 法檢測低、中、高劑量組和樞消積方干預HepG2 細胞24 h、48 h、72 h 后的細胞活力。結果顯示，與對照組相比，各組和樞消積方作用于HepG2 細胞48 h和72 h后均可顯著降低HepG2細胞活力（P＜0.01），該作用呈劑量依賴性；但在24 h 時僅高劑量表現出對細胞活力的抑制（P＜0.01），低、中劑量組與對照組比較差異無統計學意義。見圖2。

圖2 和樞消積方干預24 h、48 h、72 h對HepG2細胞活性的影響

2.2 和樞消積方對人肝癌細胞系HepG2細胞增殖的影響與對照組相比，和樞消積方各劑量組均可降低HepG2 細胞的集落生成，以高劑量最為明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 平板克隆實驗檢測和樞消積方對HepG2細胞增殖的影響

2.3 和樞消積方對人肝癌細胞系HepG2細胞BCL-2、BAX的影響與對照組相比，Western Blot顯示各組和樞消積方均可促進BCL-2 蛋白表達降低、BAX 蛋白表達升高。見圖4。

圖4 和樞消積方對BCL-2、BAX蛋白的表達的影響

2.4 和樞消積方對NS5ATP13及AKT/GSK/MTOR信號轉導通路的影響與對照組相比，各組和樞消積方均可顯著降低NS5ATP13 蛋白表達，其中高劑量組最明顯（P＜0.05）。與對照組相比，僅高劑量組和樞消積方使AKT、GSK、MTOR 蛋白表達下調，但差異無統計學意義（P＞0.05）。但相較于低劑量組，中、高劑量組和樞消積方可顯著降低AKT、GSK、MTOR 蛋白表達（P＜0.05），呈劑量依賴性。與對照組相比，和樞消積方中、高劑量組均可使p-AKT、p-GSK、p-MTOR 蛋白表達降低（P＜0.05），而低劑量組降低不明顯，可能與濃度過低有關。見圖5。

圖5 和樞消積方對NS5ATP13及AKT/GSK/MTOR 信號通路的影響

3 討論

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率一直居高不下，近10年針對HCC的診斷、治療有了很大進展，但晚期HCC 患者5 年生存率仍很低［5］。中醫藥在肝癌治療中有獨特的優勢，強調從整體出發，辨證論治，充分調動機體的防御功能，可以改善患者臨床癥狀，減輕手術及分子靶向、生物免疫治療等的不良反應，在臨床中有著重要作用［6］。和樞消積方是西南醫科大學附屬中醫醫院汪靜教授多年來治療HCC 的經驗方，該方主要由柴胡、黃芩、黃芪、雞內金、生麥芽、醋鱉甲等組成，方中柴胡、黃芩，取小柴胡湯之意，行調和少陽樞機之功，輔以健脾益氣、活血化瘀、軟堅散結之品，諸藥合用，使氣機調暢、肝胃調和、脾氣得健、癥積自消。在本研究中，我們采用不同濃度的和樞消積方作用于HepG2細胞，通過CCK-8法、平板克隆實驗證明和樞消積方可抑制HepG2 細胞的增殖能力，呈濃度依賴性。

細胞凋亡在腫瘤的發生發展中起著重要作用，其中線粒體介導的內源性凋亡通路是調控細胞凋亡的中心，主要通過調節BCL-2 蛋白家族來發揮調節功能，BCL-2和BAX 是其中的重要分子，二者共同影響線粒體功能并調節線粒體釋放凋亡激活因子來調控細胞凋亡［7］。本研究通過Western Blot顯示和樞消積方可抑制BCL-2、上調BAX 的蛋白表達，推測和樞消積方可通過調控線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）∕AKT 信號通路是人類癌癥中被激活最常見的信號通路，在細胞周期調控、細胞增殖分化、蛋白質合成和葡萄糖代謝活動起重要作用，研究［8］顯示其在肝癌的發展中起到關鍵作用。AKT是PI3K信號通路的重要效應器，磷酸化的AKT參與細胞增殖、代謝、存活和運動等多項細胞活動［9］。GSK-3 是一種絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶，通過多種途徑調節細胞的增殖、分化［10］，活化的AKT 可以抑制GSK-3β 的活性［11］，發揮抑癌作用，是治療肝癌的潛在靶點。MTOR是細胞代謝的重要調節點，磷酸化的AKT 可直接使MTOR 活化，促進蛋白質的生物合成、誘導細胞增殖，同時增加對細胞凋亡的抑制，促進腫瘤進展［12］。NS5ATP13是新發現的基因，研究顯示［13］其與肝癌、食管癌、腎癌等進展密切相關，是治療腫瘤的潛在靶點。前期研究［14］顯示降低NS5ATP13 可抑制AKT∕GSK∕MTOR 信號通路活化，從而抑制HepG2 細胞增殖并誘導細胞凋亡。

在本研究中，我們發現和樞消積方可抑制p-AKT、p-GSK、p-MTOR及NS5ATP13的蛋白表達，推測和樞消積方可能通過抑制NS5ATP13 來抑制AKT∕GSK∕MTOR 信號轉導通路的活化，進而抑制HepG2 細胞的增殖并誘導細胞凋亡，發揮抗癌作用。

綜上所述，本研究證明了和樞消積方可以抑制HepG2 細胞的增殖，并誘導其凋亡。其機制可能與和樞消積方抑制NS5ATP13 正反饋AKT∕GSK∕MTOR 信號通路有關。