血管生成素樣蛋白8敲除減輕脂多糖誘導的肝臟脂質沉積

羅珊 馮瑩 范丹丹 鄭雯鑫 郭興榮 阮緒芝

1湖北醫藥學院基礎醫學院附屬太和醫院，胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，臍帶血造血干細胞治療臨床醫學研究中心（湖北十堰 442000）；2湖北省十堰市太和醫院內分泌風濕免疫科（湖北十堰 442000）；湖北醫藥學院3生物醫學工程學院，4全科醫學院（湖北十堰 442000）

膿毒癥是由侵入機體的病原微生物引發的全身炎癥反應，病原菌產生的內、外毒素及多種炎癥介質可導致多器官功能障礙綜合征，是住院患者病殘和死亡的主要原因［1］。盡管近年來對膿毒癥發病機制的認識不斷加深、治療手段逐步提高，但其病死率仍然居高不下［2］。由于肝臟是平衡宿主體內平衡和調節宿主防御作用的重要器官，因此成為膿毒癥中關鍵“靶器官”［3］。研究［4］表明，機體發生感染時，脂肪組織釋放的游離脂肪酸（FFAs）和甘油進入血液。正常情況下，FFAs主要被肝臟攝取進入β-氧化過程，產生能量和代謝中間化合物。但是膿毒癥小鼠肝臟β-氧化過程受阻，進而引起脂質堆積和脂肪毒性［5］。因此，探究膿毒癥中肝臟β-氧化過程等代謝的調節機制，進而開發針對性的干預治療措施，既可以改善能量供應、也可以緩解膿毒癥引起的肝臟毒性損傷，具有重要的臨床意義。

血管生成素樣蛋白8（ANGPTL8）是最新發現的ANGPTLs 家族成員，主要在肝臟和棕色脂肪組織表達［6］。研究［7-9］表明，ANGPTL8 在急性肝損傷、肝纖維化和肝癌中通過調節糖脂代謝和炎癥反應發揮重要作用。但是ANGPTL8 在膿毒癥脂代謝紊亂中的作用未見報道。本研究致力于探討ANGPTL8 在膿毒癥小鼠肝臟脂質沉積和過氧化中的作用及機制，為膿毒癥相關性肝損傷的預防和治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6 ～ 8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購自湖北醫藥學院實驗動物中心，均飼養在SPF 級動物房中，可自由獲取水和食物，溫度維持在（23 ±1 ）℃，濕度維持在50% ～ 60%，光/暗循環12 h。所有動物實驗經湖北醫藥學院動物倫理委員會批準［批準號：SYXK（鄂）2023-085］。

1.1.2 材料與儀器 Trizol 總RNA 提取試劑（R1000）、反轉錄試劑盒（F0202）、2x Realab Green qPCR Fast mixture（R0202）、LPS（L2880）購于蘭博利德公司。ANGPTL8 抗體（ab180915）、CAV1 抗體（K110092P）分別購于abcam、北京索萊寶公司。改良油紅O 染色試劑盒（G1261）購于北京索萊寶公司。谷丙轉氨酶（ALT/GPT）（C009-2-1）、谷草轉氨酶（AST/GOP）（C010-2-1）、甘油三酯（TG）（A110-1-1）和丙二醛（MDA）（A003-1-2）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（C1089）、 Cy3 標記山羊抗兔IgG（H+L）（A0516）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、4%多聚甲醛固定液（P0099）購于碧云天生物技術有限公司。ChemiDocTM、CFX ConnectTM、熒光定量PCR檢測系統均購自BIORAD，NanoDrop 分光光度計、多功能酶標儀購自Thermo Scientific，DMi8 熒光顯微鏡、冰凍切片機CM1950 均購自Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構建 （1）膿毒癥小鼠模型構建：取6 ～8 周齡野生型小鼠12 只，給予單次腹腔注射LPS（10 mg/kg）構建膿毒癥小鼠模型，分別于造模后0、24、48 h（每個時間點3只）取外周血和肝臟組織，分離血清，-80 ℃保存備用。取6 ～ 8周齡ANGPTL8敲除小鼠和對照小鼠各8 只，構建膿毒癥小鼠模型，分別于造模后0 h 和48 h（每個時間點4 只）取外周血和肝臟組織，分離血清，-80 ℃保存備用。（2）HepG2 細胞模型構建：HepG2 細胞傳代貼壁后，給予LPS（4 μg/mL）刺激，分別于處理0、4、8、12、24 h 后檢測ANGPTL8 的表達。

1.2.2 ALT、AST、TG 和MDA 檢測 按照ALT、AST 測試盒說明書步驟，取5 μL 小鼠血清加入到96 孔板測定孔中，分別加入ALT、AST 基質液，酶標儀測定OD值后根據標準曲線計算ALT、AST 含量，評估小鼠肝功能。取小鼠肝組織100 mg 加生理鹽水900 μL 制備肝組織勻漿液，按照TG、MDA測試盒說明書步驟進行加樣孵育，酶標儀測定OD值后計算TG 和MDA 含量，評估小鼠肝臟脂肪含量及脂質過氧化指標。

1.2.3 肝組織HE、油紅O 染色和肝臟細胞凋亡檢測 取小鼠肝左側葉，固定后石蠟包埋切片，厚度為4 μm，行HE 染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變；取小鼠肝右側葉，經固定、脫水后，冰凍切片，厚度為5 μm，參照改良油紅O 染色試劑盒步驟進行油紅O 及蘇木素染色，漂洗后顯微鏡下觀察肝組織脂質沉積程度；將上述冰凍切片參照TUNEL 試劑盒步驟進行染色，光學顯微鏡觀察陽性細胞數量，并進行統計評估肝細胞凋亡水平。

1.2.4 免疫熒光技術檢測ANGPTL8 的表達 取LPS（4 μg/mL）處理24 h 的HepG2 細胞，免疫固定液固定15 min，漂洗后山羊血清室溫封閉1 h，過夜孵育一抗（ANGPTL8），室溫避光孵育二抗（Cy3標記山羊抗兔IgG（H + L）2 h，漂洗后光學顯微鏡觀察分析ANGPTL8 的表達量。

1.2.5 RNA-seq測序篩選關鍵差異基因 取WT和ANGPTL8 KO 膿毒癥小鼠的肝臟組織，送至華大基因進行RNA-seq 測序，將組織樣品進行破碎裂解、抽提純化后制備mRNA 文庫，后續使用華大基因Dr. Tom 多組學數據挖掘系統進行數據分析、繪圖及挖掘。使用DESeq2 （v1.4.5）進行差異基因檢測，條件為P≤ 0.05，并使用pheatmap （v1.0.8）繪制基因在不同樣本中的表達量聚類熱圖，條件為P≤ 0.05 且|logFC| ＞ 1。

1.2.6 實時熒光定量PCR 檢測ANGPTL8、CAV1的mRNA 水平 應用Primer Premier 5 設計引物，引物序列如下：actin（H）-F：5'CCTGGCACCCAGCACAAT 3'，actin（H）-R：5'GGGCCGGACTCGTCATAC 3'；actin（M）-F：5'GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG 3'，actin（M）-R：5'ATGCCACAGGATTCCATACC 3'；ANGPTL8（H）-F：5'GCACAATAGAACTCCTGGGGC 3'，ANGPTL8（H）-R：5'CCTCCTCCATCTGAGTCTCCAAC 3'；ANGPTL8（M）-F：5'CTGCCTCCTGTGGACCTTAG 3'，ANGPTL8（M）-R：5' TCTGTACACGCCATTGAGGG 3'；CAV1（M）-F：5' GAACCAGAAGGGACACACAG 3'，CAV1（M）-R：5' GGAAAGAGAGAATGGCGAAG 3'。取上述LPS 處理過的小鼠肝組織和HepG2 細胞，提取總RNA，反轉錄為cDNA，染料法熒光定量PCR 檢測，根據2-ΔΔCT法計算分析。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測CAV1 水平 稱取10 mg 小鼠肝組織，經含磷酸酶蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液500 μL 冰上裂解1 h，離心后取上清液，加入上樣緩沖液后水浴（100 ℃）10 min制備蛋白樣品。蛋白樣品經電泳分離，半干轉法將蛋白轉印至PVDF 膜，封閉液室溫封閉20 min 后依次孵育一抗和二抗，洗膜后進行曝光顯影，進行分析統計。

1.3 統計學方法 本研究通過GraphPad Prism 8.3分析數據，計量資料均采用均數±標準差來表示。多組間比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS誘導的膿毒癥小鼠肝臟脂質異常沉積 通過LPS（10 mg/kg）腹腔注射誘導膿毒癥小鼠模型，分別收取對照組和模型組小鼠外周血和肝臟組織。肝臟HE 染色發現LPS 刺激24 h 出現細胞水腫，48 h 出現小泡性脂肪變；肝臟油紅O染色結果顯示24 h 和48 h 脂滴明顯（圖1A）。血清ALT 和AST 檢測結果顯示LPS 誘導后24 h、48 h ALT 和AST 均明顯上調（圖1B）。檢測肝組織勻漿液TG 及MDA 含量可反映肝臟脂質沉積及脂質過氧化損傷程度，結果顯示LPS處理后24 h和48 h 肝勻漿TG及MDA顯著高于對照組（圖1C）。以上結果表明，LPS誘導的膿毒癥小鼠肝臟脂質代謝紊亂及肝功能異常。

圖1 LPS 誘導的膿毒癥肝臟脂質異常沉積Fig.1 LPS induced abnormal lipid deposition in septic liver

2.2 LPS上調ANGPTL8表達 為了明確ANGPTL8在LPS 誘導膿毒癥小鼠肝臟中的表達水平，提取肝臟組織總RNA，利用qPCR 檢測ANGPTL8的mRNA表達。結果顯示，LPS 刺激后48 h ANGPTL8 的mRNA表達顯著高于對照組（圖2A）。隨后利用LPS刺激HepG2 細胞體外構建急性炎癥損傷細胞模型，通過qPCR 和免疫熒光檢測LPS 刺激不同時間ANGPTL8的表達。結果顯示，LPS刺激24 h，HepG2細胞ANGPTL8 表達顯著高于對照組（圖2B-C）。提示ANGPTL8 在LPS 刺激后表達明顯上調，其可能在LPS 誘導的膿毒癥肝損傷中發揮重要作用。抑制ANGPTL8 表達可能對肝臟具有保護作用。

圖2 LPS 上調ANGPTL8 的表達Fig.2 LPS upregulates the expression of ANGPTL8

2.3 ANGPTL8 缺失減輕LPS 對小鼠肝臟脂質沉積的作用 利用ANGPTL8 敲除小鼠和對照小鼠構建膿毒癥小鼠模型，肝臟HE 染色和油紅O 染色顯示，LPS 刺激48 h，較WT 小鼠，ANGPTL8 敲除小鼠肝臟病變和脂質沉積明顯減輕（圖3A）。血清檢測結果表明，LPS 刺激48 h，ANGPTL8 敲除小鼠肝功能指標ALT、AST水平顯著低于WT小鼠（圖3B）。此外我們還發現，LPS刺激48 h時ANGPTL8敲除小鼠肝勻漿TG及MDA含量顯著低于WT小鼠（圖3C）。以上結果表明抑制ANGPTL8 可減輕LPS 導致的肝功能異常及肝臟脂質異常沉積和過氧化。

圖3 ANGPTL8 缺失減輕LPS 對肝臟脂質沉積的作用Fig. 3 ANGPTL8 knockout attenuates LPS- induced hepatic lipid deposition

2.4 ANGPTL8 的缺失抑制LPS 誘導的肝細胞凋亡 取上述膿毒癥小鼠肝臟組織，行冰凍切片組織TUNEL 染色。在LPS 誘導48 h 后，對TUNEL陽性細胞進行統計分析，結果顯示，ANGPTL8 敲除小鼠肝細胞陽性細胞數量明顯低于對照小鼠（圖4），提示ANGPTL8 的缺失抑制LPS 誘導的肝細胞凋亡。

2.5 膿毒癥ANGPTL8 敲除小鼠和WT 小鼠肝臟組織RNA-seq 分析 為進一步明確ANGPTL8在膿毒癥小鼠肝臟脂代謝紊亂中的作用機制，我們將LPS 刺激48 h 的ANGPTL8 敲除小鼠和對照小鼠肝臟組織進行RNA-seq 測序。分析發現差異基因大都與脂肪代謝相關。其中CAV1 基因在ANGPTL8敲除小鼠肝臟表達顯著高于WT小鼠（圖5A-B），而其編碼的Caveolin-1 蛋白是細胞膜穴樣凹陷的標志性結構蛋白，是脂肪細胞質膜上的主要脂肪酸結合蛋白，在游離脂肪酸和甘油三酯脂滴的運輸或儲存中［10］。利用qPCR 及Western blot 驗證CAV1的表達，結果顯示，LPS 刺激后，ANGPTL8 敲除小鼠肝臟CAV1 表達較WT 小鼠明顯上調（圖5C、D）。上述結果表明，ANGPTL8 缺失可能通過上調肝臟CAV1 的表達從而減輕LPS 誘導的肝臟脂質沉積和過氧化。

圖5 ANGPTL8 抑制LPS 誘導膿毒癥肝臟CAV1 的表達Fig. 5 ANGPTL8 inhibits CAV1 expression in LPS -induced septic liver

3 討論

膿毒癥可激活機體的免疫反應，引起全身異常免疫反應和炎癥風暴，進一步誘導細胞功能障礙和凋亡和組織特異性破壞，導致多器官功能障礙和死亡［11］。肝臟作為機體重要的免疫應答器官，在調節內環境穩態、宿主防御激活及代謝等場所中發揮關鍵作用［12-13］。早期的研究［14］認為，肝損傷是膿毒癥的終末期特征，主要表現為轉氨酶升高和黃疸。但是越來越多的證據表明，在膿毒癥早期，肝臟的生物轉化和轉運功能已經受損，導致肝細胞中膽紅素、膽汁酸和外源性有害物質積累，膽汁酸結合能力和藥物代謝受到干擾［15］。膿毒癥相關性肝損傷短期死亡率高，預后差，治療的挑戰之一是目前臨床缺乏膿毒癥肝損傷的早期診斷標志物。因此，探索膿毒癥肝損傷的發病機制，對于其早期預防和治療進而改善患者預后至關重要。

膿毒癥期間，免疫系統的強烈激活和許多患者的不理想喂養狀態導致了一種能量剝奪狀態，從而導致饑餓反應。一線能量供應分子，如糖原和葡萄糖在數小時內耗盡，并由脂肪組織釋放的脂質補充［16］。多項研究［17-18］證實，膿毒癥患者和動物模型的肌肉、肝臟和心臟ATP/ADP 比值大幅度下降，而活化能量代謝通路可以減輕膿毒癥小鼠腎功能障礙、增加生存率。最新研究［7］表明，ANGPTL8 敲除可抑制高脂喂養引起的肝臟炎癥、脂肪變性和肝纖維化。本研究結果表明LPS 可使肝臟ANGPTL8的表達增加，ANGPTL8 缺失可減輕膿毒癥小鼠肝功能異常、肝組織細胞凋亡和脂肪變性。因此，ANGPTL8 可能介導膿毒癥相關肝臟脂質代謝紊亂，抑制其表達可以改善肝臟脂肪代謝，進一步減輕脂質過氧化導致的肝臟毒性損傷。

CAV1 是質膜小窩的結構蛋白，能夠從質膜轉移到脂肪細胞脂滴，有助于調節脂質儲存，與肝臟脂質積累、脂質和葡萄糖代謝、線粒體生物學和肝細胞增殖的調節密切相關［10，19-20］。有文獻［21-23］報道，人類CAV1 純合致病變異，可導致先天性全身性脂肪營養不良；小鼠CAV1 缺失可誘導進行性脂肪營養不良伴胰島素抵抗和高甘油三酯血癥；非酒精性脂肪肝病患者和高脂喂養的小鼠肝臟CAV1 的表達降低。本研究通過肝臟RNA-seq發現LPS刺激后，ANGPTL8 KO 小鼠肝臟組織CAV1 的mRNA 和蛋白表達均顯著高于WT 小鼠。因此推測ANGPTL8 可能通過抑制CAV1 介導膿毒癥小鼠肝臟脂質代謝紊亂。

綜上所述，本研究表明，ANGPTL8 缺失通過上調CAV1 抑制肝臟脂質沉積、脂質過氧化和細胞凋亡，進而減輕肝臟損傷和功能障礙。因此，ANGPTL8 血清學檢測及其抑制劑在膿毒癥肝損傷的防治中具有重要應用價值。鑒于ANGPTL8 是一種分泌蛋白，而膿毒癥屬于全身炎癥反應綜合征，ANGPTL8 是否在膿毒癥其他器官（肺臟、腎臟和心臟等）損傷中發揮作用還需要深入研究。

【Author contributions】LUO Shan performed the experiments and wrote the article. FENG Ying， FAN Dandan and ZHEN Wenxin performed the experiments. GUO Xingrong revised the article. RUAN Xuzhi designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.