腦膠質(zhì)瘤組織ZEB2、CCL20表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性

肖仕和 李鋼 劉仲海 劉珍

三亞中心醫(yī)院 （海南三亞 572000）

腦膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)上皮組織膠質(zhì)細(xì)胞病變引發(fā)的腫瘤，是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的腫瘤類型，占比高達(dá)50%左右［1-2］。目前，臨床常給予手術(shù)切除、術(shù)后放化療、免疫治療等干預(yù)，但患者的預(yù)后極差，中位生存期僅10 ～ 15 個(gè)月，而導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤患者整體生存時(shí)間短的潛在原因主要是其具有易侵襲、易遠(yuǎn)處遷移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，且其對(duì)臨床治療具有較強(qiáng)的抵抗性［3-4］。因此，尋找有效的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)于腦膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷，并指導(dǎo)臨床治療具有重要價(jià)值。E 盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box-binding protein 2， ZEB2）是一種可參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過(guò)程的細(xì)胞因子［5］，MYUNG 等［6］表示，ZEB2 在兒童與成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與活性，影響腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。CC 趨化因子配體20（CC chemokine ligand 20， CCL20）是一種重要的趨化因子，在多種癌癥的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可參與血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等多種病理過(guò)程［7］，SCHULZ 等［8］表示，前列腺癌細(xì)胞中CCL20 表達(dá)水平上調(diào)，其作為致癌因子參與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。上述研究中ZEB2、CCL20 均與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，但目前關(guān)于二者在腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中的表達(dá)如何，是否與預(yù)后存在相關(guān)性，國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究檢測(cè)了腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中ZEB2與CCL20 表達(dá)情況并分析了二者與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系，以期為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療與預(yù)后改善提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月至2020 年1 月在本院行手術(shù)治療的156 例腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織作腫瘤組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為原發(fā)性腫瘤；（2）切除的腫瘤組織經(jīng)病理檢查確診為腦膠質(zhì)瘤；（3）患者臨床資料均保存完整；（4）術(shù)前均未進(jìn)行放化療等相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦外傷、顱腦手術(shù)者；（2）合并其他部位或類型腫瘤者；（3）合并其他類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；（4）合并有嚴(yán)重并發(fā)癥者；（5）合并有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病、全身感染性疾病者；（6）合并心肝腎等臟器嚴(yán)重功能不全者。另收集同時(shí)期52 例在本院行其他腦部手術(shù)切除的正常腦組織為正常組。腫瘤組：男108 例，女48 例；年齡19 ～ 77 歲，平均（41.25 ±7.13）歲。正常組：男38例，女14例；年齡21 ～ 75歲，平均（41.75 ± 7.02）歲。兩組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。本研究患者均知情并自愿簽署知情同意書，且經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：LLKY210110）。

另收集患者的臨床資料，包括：性別、年齡、術(shù)前卡式評(píng)分（KPS）、術(shù)前水腫、術(shù)前癲癇、腫瘤最大直徑、腫瘤病理分級(jí)、手術(shù)術(shù)式、術(shù)后放療、術(shù)后化療、替莫唑胺使用情況等。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本收集及ZEB2、CCL20水平檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)（SP）法檢測(cè)組織ZEB2、CCL20 表達(dá)情況，試劑盒均購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。（1）術(shù)中獲取組織樣本并采用4%的多聚甲醛固定液（上海彩佑實(shí)業(yè)）于4 ℃下固定過(guò)夜；（2）固定好的組織樣本制成蠟塊并切成4 μm 厚的切片；（3）65 ℃下烤片1.5 h，二甲苯溶液脫蠟，梯度乙醇溶液水化，磷酸緩沖液（PBS）沖洗干凈；（4）檸檬酸鹽溶液（0.1 mmol/L，pH=6）高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗干凈；（5）加入過(guò)氧化物酶阻斷劑阻斷10 min（避光環(huán)境），PBS 沖洗干凈，再加入10%山羊血清封閉20 min 后擦去周邊殘余液；（6）加入一抗（均按照1∶100 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；次日取出，復(fù)溫45 min，PBS 沖洗干凈，加入二抗37 ℃孵育（ZEB2進(jìn)行30 min，CCL20 進(jìn)行20 min），取出并用PBS沖洗干凈；（7）使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 ～10 min，蘇木素復(fù)染5 ～ 7 min，乙醇水化、二甲苯透明、封片、鏡檢。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 由兩位病理學(xué)醫(yī)師結(jié)合雙盲法判定。ZEB2 定位于細(xì)胞核，CCL20 主要定位于細(xì)胞質(zhì)和膜。以染色強(qiáng)度與染色范圍評(píng)分乘積判斷：染色強(qiáng)度：不著色為0 分，弱著色為1 分，中等著色為2 分，強(qiáng)著色為3 分；染色范圍：＜ 5%為0 分，5% ～ 25%為1 分，26% ～ 50%為2 分，51% ～ 75%為3 分，＞ 75%為4 分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積＜ 4 為陰性表達(dá)，≥ 4 為陽(yáng)性表達(dá)［9］。

1.3 隨訪與預(yù)后分組 術(shù)后對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者隨訪3 年，隨訪形式為電話隨訪，截止至患者病死或2023 年1 月，根據(jù)患者隨訪結(jié)束時(shí)的生存情況進(jìn)行分組，將隨訪結(jié)束時(shí)生存患者納入預(yù)后良好組，將病死患者納入預(yù)后不良組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件分析統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)；“例（%）”描述計(jì)數(shù)資料，以χ2檢驗(yàn)分析兩組間差異；計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 生存曲線分析腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織ZEB2、CCL20 表達(dá)水平與生存率的關(guān)系；采用COX 回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素；P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組與正常組組織中ZEB2、CCL20 表達(dá)量比較 SP 結(jié)果表示，腫瘤組ZEB2、CCL20 陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組（P＜ 0.05），見表1 和圖1。

圖1 腫瘤組織與正常腦組織ZEB2、CCL20 表達(dá)（50 μm）Fig.1 Expression of ZEB2 and CCL20 in tumor tissue and normal brain tissue （50 μm）

表1 腫瘤組與正常組組織中ZEB2、CCL20 表達(dá)比較Tab.1 Comparison of ZEB2 and CCL20 expression between tumor group and normal group 例（%）

2.2 腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織ZEB2、CCL20 表達(dá)與生存情況的關(guān)系 156 例腦膠質(zhì)瘤患者3 年生存率為69.87%（109/156）。ZEB2、CCL20 陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率分別為60.38（64/106）、58.16%（57/98），均低于ZEB2、CCL20 陰性表達(dá)患者生存率90.00%（45/50）、89.66%（52/58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rank χ2= 14.129、18.117，P＜ 0.001），見圖2。

圖2 腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中ZEB2、CCL20 表達(dá)與生存率的關(guān)系Fig.2 Relationship between ZEB2 and CCL20 expression and survival rate in tumor tissues of glioma patients

2.3 預(yù)后不良與預(yù)后良好組腦膠質(zhì)瘤患者臨床資料比較 預(yù)后不良組年齡＞ 40 歲、腫瘤最大直徑≥ 6 cm、腫瘤病理分級(jí)為Ⅲ-Ⅳ級(jí)、ZEB2 陽(yáng)性表達(dá)、CCL20 陽(yáng)性表達(dá)患者占比均高于預(yù)后良好組（P＜ 0.05），術(shù)前KPS 評(píng)分＞ 70 分、行全切除術(shù)、術(shù)后放療、術(shù)后化療、替莫唑胺化療≥ 4 療程患者占比均低于預(yù)后良好組（P＜ 0.05）；但其患者的性別、術(shù)前水腫、術(shù)前癲癇情況與預(yù)后良好組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 預(yù)后不良與預(yù)后良好組腦膠質(zhì)瘤患者臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between the poor prognosis group and the good prognosis group of glioma patients例（%）

2.4 COX 回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素 將表2 中P＜ 0.05 的因素納入為自變量，腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后納入因變量，進(jìn)行COX 回歸分析，變量賦值見表3。單因素COX 分析顯示，年齡、術(shù)前KPS、腫瘤最大直徑、腫瘤病理分級(jí)、手術(shù)術(shù)式、術(shù)后放療、替莫唑胺療程、ZEB2 表達(dá)、CCL20 表達(dá)均是腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素（P＜ 0.05）；多因素COX 回歸分析表示，年齡、腫瘤最大直徑、腫瘤病理分級(jí)、ZEB2 與CCL20 陽(yáng)性表達(dá)均是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜ 0.05），術(shù)前KPS、術(shù)后放療、替莫唑胺療程為保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

表3 COX 變量賦值表Tab.3 COX variable assignment table

表4 COX 回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響因素Tab.4 COX regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一類發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致死率高，治愈率低，進(jìn)展迅速的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率在全部顱內(nèi)惡性腫瘤中的占比已高達(dá)81%，且呈現(xiàn)出明顯的上漲趨勢(shì)，但其5 年存活率卻不足5%［10］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦膠質(zhì)瘤在國(guó)內(nèi)的年均發(fā)病率已達(dá)到（5 ～ 8）/10 萬(wàn)，其5 年病死率在所有的全身性腫瘤中已高居第3 位，嚴(yán)重威脅著國(guó)人的生命健康［11］。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療方法雖在不斷創(chuàng)新、優(yōu)化，但治療效果不佳，對(duì)患者的生存與預(yù)后改善效果并不突出［12-14］，故探索與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)的生物因素非常必要。

ZEB2是一類由人2號(hào)染色體2q22.3區(qū)域Zfhxlb基因編碼合成的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，具有EMT 誘導(dǎo)作用與促癌功效［15］。ZEB2可抑制E-cadherin表達(dá)，激活多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），誘發(fā)EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［16］；其也可特異性結(jié)合E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的增強(qiáng)子，抑制E-cadherin 轉(zhuǎn)錄合成，促進(jìn)癌細(xì)胞的游走、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致癌癥進(jìn)展［17］。WANG等［18］表示，微小RNA可靶向抑制ZEB2表達(dá)，調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展。CHENG 等［19］表示，ZEB2 的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。NAGAISHI等［20］表示，ZEB2 可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤皮膚轉(zhuǎn)移，且越高級(jí)別的皮膚轉(zhuǎn)移患者的ZEB2 表達(dá)水平越高。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中ZEB2 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織，ZEB2 陽(yáng)性表達(dá)者的生存率明顯低于陰性表達(dá)者，預(yù)后不良患者的ZEB2 陽(yáng)性表達(dá)率高于預(yù)后良好患者，與上述報(bào)道的ZEB2 發(fā)揮促癌作用一致。推測(cè)ZEB2可能通過(guò)誘發(fā)EMT、誘導(dǎo)癌細(xì)胞浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方式促進(jìn)癌癥進(jìn)展、惡化，因此，ZEB2 表達(dá)水平升高，使得腦膠質(zhì)瘤的惡化與進(jìn)展越嚴(yán)重，生存預(yù)后越差。

CCL20 是1997 年由ROSSI 首次發(fā)現(xiàn)的一類對(duì)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞均具有趨化作用的細(xì)胞因子，可參與機(jī)體的免疫與炎癥反應(yīng)，與乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)［21］。CHEN 等［22］表示，介導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可上調(diào)CCL20 表達(dá)水平，促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。FAN 等［23］表示，CCL20 高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺腺癌患者EMT 效應(yīng)顯著增強(qiáng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，激活腫瘤壞死因子通路，促進(jìn)癌癥發(fā)展，是不良預(yù)后的重要標(biāo)志；而當(dāng)其被敲除后，患者癌細(xì)胞EMT 過(guò)程、增殖現(xiàn)象、對(duì)抗治療反應(yīng)等均受到明顯抑制。NAN 等［24］表示，在食管癌患者中，啟動(dòng)子的低甲基化致使CCL20 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，CCL20 在食管癌中發(fā)揮促進(jìn)癌癥進(jìn)展、引發(fā)免疫紊亂的作用。MO 等［25］表示，陰莖癌患者的血清CCL20 水平明顯升高，CCL20 敲低可顯著抑制癌細(xì)胞系中信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-AKT信號(hào)通路，削弱MMP 表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡逃逸等惡性表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中CCL20 陽(yáng)性表達(dá)率高于正常腦組織，CCL20 陽(yáng)性表達(dá)者的生存率明顯低于陰性表達(dá)者，預(yù)后不良者的CCL20 陽(yáng)性表達(dá)率高于預(yù)后良好者，與上述報(bào)道的CCL20 發(fā)揮促腫瘤作用一致。推測(cè)CCL20 可能通過(guò)強(qiáng)化EMT 效應(yīng)、誘發(fā)炎癥因子表達(dá)、激活腫瘤因子通路、增加癌細(xì)胞惡性表現(xiàn)、對(duì)抗治療等途徑促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。

另本研究還發(fā)現(xiàn)，年齡＞ 40 歲、腫瘤最大直徑≥ 6 cm、腫瘤病理分級(jí)為Ⅲ-Ⅳ級(jí)、ZEB2 與CCL20陽(yáng)性表達(dá)均是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，術(shù)前高KPS、術(shù)后放療、替莫唑胺療程≥ 4 為保護(hù)因素，提示腫瘤組織ZEB2 與CCL20 表達(dá)情況均可用作腦膠質(zhì)瘤患者長(zhǎng)期預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，同時(shí)提示臨床需增加對(duì)腫瘤組織ZEB2 與CCL20 陽(yáng)性表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者的關(guān)注度，及早實(shí)施特異性干預(yù)，改善患者生存預(yù)后。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織ZEB2 與CCL20 表達(dá)均上調(diào)，兩者均與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)，均可用于腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的臨床評(píng)估，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)提供了有益的信息。不足之處：本研究樣本量較小，且預(yù)后不良與預(yù)后良好組病例相差較大，結(jié)果可能存在偏倚。今后的研究中將對(duì)荷瘤模型小鼠及臨床病理樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，以更深入地闡明ZEB2 與CCL20 在腦膠質(zhì)瘤中的功能和調(diào)控機(jī)制。

【Author contributions】XIAO Shihe designed the study and wrote the article.LI Gang and LIU Zhen collected all the case data. LIU Zhonghai revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.