DCN基因多態性對大白豬繁殖性能影響

符彬彬 李清春 和軍飛 盧世豪 陳鑫 何凡 祁夢凡 張化鵬 魯慧文 黃濤

摘要：目的 為探究核心蛋白聚糖（DCN）基因單核苷酸多態性對大白母豬繁殖性能的影響。方法 利用DNA混池測序，確定DCN基因的SNPs，采用GenoPlexs基因分型技術對316頭大白母豬群進行基因分型，并與大白母豬的繁殖性能進行關聯分析。結果 在DCN基因內含子4和外顯子4分別鑒定到rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A）突變位點。其中，rs55618082（C/A）發生同義突變后導致DCN基因mRNA二級結構和自由能發生變化。rs346372784（C/T）位點對大白母豬母系指數、繁殖指數、初生重、總仔數EBV、活仔數EBV有極顯著影響（P<0.01），對乳頭數、死胎數、活仔數有顯著影響（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點對母系指數、繁殖指數、乳頭數、妊娠期、初生重、總仔數EBV、活仔數EBV有極顯著影響（P<0.01）。結論 DCN基因rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A）突變影響大白豬的繁殖性能，可用于大白豬的標記輔助選育。

關鍵詞：大白豬；DCN基因；多態性；繁殖性狀

中圖分類號：S828.2文獻標志碼：A文獻標識碼

Effects of DCN gene polymorphisms on the reproductive performance of Yorkshire

Pigs

FU? Binbin1，LI? Qingchun1，HE? Junfei1， 2，LU? Shihao1，CHEN? Xin1，HE? Fan1，QI? Mengfan1，ZHANG? Huapeng1，LU? Huiwen2，HUANG? Tao1，2*

（1 College of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi， Xinjiang 832000， China; 2 Xinjiang Pig Breeding

Engineering and Technology Research Center，Changji， Xinjiang 831100， China）

Abstract：? Objectives To investigate the influence of single nucleotide polymorphisms （SNPs） within the Decorin （DCN） gene on the reproductive traits of Yorkshire sows. Methods The SNPs of DCN gene was determined by sequencing PCR product of mixed-pool DNA， and GenoPlexs genotyping technology was utilized to genotype a population of 316 Yorkshire sows

and to analyze the association with reproductive performance of Yorkshire sows.

Results Two mutation sites， rs346372784（C/T） in intron 4 and rs55618082（C/A） in exon 4 of the DCN gene， were identified in this study. rs55618082（C/A） exhibited a synonymous mutation， leading to changes in the secondary structure and free energy of the DCN gene mRNA. The rs346372784（C/T） locus exhibited highly significant effects on maternal index， reproductive index， teat number， birth weight， EBV of total litter size （P<0.01）， and EBV of numberborn alive in Yorkshire sows， as well as significant effects on stillbirths， and live piglet numbers （P<0.05）. The rs55618082（C/A） locus showed highly significant effects on with maternal index， reproductive index， teat number， gestation length， birth weight， EBV of total number born， and EBV of number born alive （P<0.01）. Conclusion The mutations at rs346372784（C/T） and rs55618082（C/A） in the DCN gene impact the reproductive performance of Yorkshire sows， indicating their potential as genetic markers for assisted breeding in the Yorkshire population.

Key words： Yorkshire sows;DCN gene;polymorphism;reproductive traits

核心蛋白聚糖（decorin，DCN）最早是從牛胎盤中分離得到的富含亮氨酸的小蛋白多糖，包含一個糖胺聚糖（GAG）鏈和一個核心蛋白，具有12個富含亮氨酸的重復序列［1-2］。DCN通過與多種蛋白質相互作用，包括生長因子、酪氨酸激酶受體、細胞外基質成分和酶，發揮多效性功能［3］。近年來，研究發現DCN可通過抑制TGF-β通路，參與細胞增殖、遷移、侵襲等生物學功能［4-5］，及哺乳動物卵泡發育生長發育［6］的過程。目前研究表明，DCN基因廣泛參與不同物種中卵泡發育和生長調控。在山羊中，Peng［7］發現DCN基因可顯著增加卵泡顆粒細胞的凋亡并阻斷細胞G0/G1期周期進程。在湖羊中，Yao［8］發現在顆粒細胞中lnc FDNCR作為海綿吸附miR-543-3p，反式激活miR-543-3p的靶基因的DCN基因并抑制TGF-β通路，從而促進顆粒細胞凋亡。本課題組前期研究發現DCN基因可通過TGF-β通路調控豬顆粒細胞的增殖，促進凋亡過程［9］。以上研究均表明DCN參與調控卵泡的功能。由于卵巢是承擔哺乳動物繁殖的重要生殖器官，表明DCN基因可能是影響豬繁殖性狀的候選基因，但目前尚未見該基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）對大白母豬繁殖性狀影響的相關報道。鑒于此，本研究將DCN基因多態性與大白母豬繁殖性狀進行關聯分析，旨在為大白母豬的繁殖性能的分子標記輔助選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取新疆某豬場同一批次，生長表現良好、飼養條件一致且表型記錄完整的大白母豬316頭，用剪刀剪取約1cm2大小耳組織樣，放入含75%乙醇的離心管中，于冰盒中帶回實驗室-20℃冰箱保存。

1.2 主要儀器、試劑

1.2.1 主要儀器

PCR儀（德國，SensoQuest）、恒溫水浴鍋（中國，上海精宏實驗設備有限公司）、臺式高速離心機（美國，ThermoFisher Scientific）、GelDoc XR+蛋白凝膠成像分析儀（美國，Bio-Rad）等。

1.2.2 主要試劑

血液、細胞和組織DNA提取試劑盒（中國，天根生化科技有限公司）、核酸染料（中國，北京索萊寶科技有限公司）、TAE緩沖液（中國，生工生物工程股份有限公司）、2×Rapid Taq Master Mix（中國，諾唯贊生物科技股份有限公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

取200 mg豬耳組織樣于離心管中剪碎，參照血液、細胞和組織DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。

1.3.2 引物設計

根據Ensembl數據庫提供的豬DCN基因序列（Ensembl號：ENSSSCG00000000915），采用Primier 5.0軟件進行引物設計，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.3 PCR擴增

隨機選取檢測合格的DNA樣品10個，每個樣品取7 μL構建DNA混池并進行PCR擴增。PCR反應體系：上、下游引物濃度為10 μmol·L-1，0.8 μL；2x Taq Master Mix 15 μL；ddH2O 12.4 μL；DNA體積為1.0 μL，PCR總體積為30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產物凝膠電泳及測序

利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行驗證，將與預期長度一致的PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結果通過chromas軟件進行分析，將正反向測序序列與Ensembl所得序列通過chromas軟件進行比對，檢測基因的SNPs位點。

1.3.5 多態位點分型

DNA樣本委托石家莊博瑞迪公司利用基于多重PCR的靶向基因捕獲技術Geno Plexs對目標SNPs進行基因分型。

1.3.6 數據統計與分析

使用Excel 2021對1-3胎次的產仔數據進行整理，參照張琰芳等［10］的方法分析各SNPs位點的基因頻率、基因型頻率、遺傳雜合度（expected heterozygosity，He）、遺傳純合度（heterozygosity observed，Ho）等，并進行卡方適合性檢驗。根據SNPs在參考基因組的位置信息，通過Ensembl數據庫查找突變的rs號。

利用在線軟件（RNA fold web server http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對外顯子區突變前后的mRNA二級結構進行預測。

采用SPSS 26.0的一般線性模型（General Linear Model， GLM）分析各繁殖性狀在不同基因型之間的差異（公式1），不同基因型對應的性狀用“平均值±標準差”的形式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

Yij=μ+Gi+Pj+eij.（1）

在式中Yij為產仔數性狀表型值，μ為群體均值，Gi表示基因型效應，Pj表示胎次效應，eij表示隨機殘差效應。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物

對DCN基因兩個多態位點進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），擴增產物條帶長度為651 bp和359 bp，符合預期。

2.2 DCN基因SNPs位點篩選

利用chromas軟件對基因測序峰圖進行分析?? 發現2個SNPs位點（圖2，表2），經Ensembl數據庫查找比對，發現2個突變位點分別為：rs346372784（C/T）、rs55618082（C/A），均為已知突變位點，其中rs55618082（C/A）為同義突變，rs346372784（C/T）為內含子突變。

2.3 DCN基因型頻率、等位基因頻率分布及遺傳多樣性分析

由表3可知，316個DNA樣品中有2個樣品因分型失敗。2個SNP位點中，rs346372784（C/T）位點的優勢基因型為TT型；rs55618082（C/A）位點的優勢基因型為AC型。基因遺傳多樣性分析結果見表3，2個SNPs位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態（P>0.05），其中，rs55618082（C/A）位點多態信息含量（PIC）為0.35屬于中度多態（0.25

2.4 DCN基因CDS區突變前后二級結構預測

由圖3可知，DCN基因rs55618082（C/A）發生A>C突變后導致DCN基因mRNA二級結構發生了變化，突變后的最小自由能為-381.10 kcal·mol-1，高于突變前的-381.70 kcal·mol-1，提示DCN基因rs55618082（C/A）發生A>C突變可能會影響其mRNA穩定性。

2.5 DCN基因多態位點對大白母豬妊娠期和乳頭數的影響

rs346372784（C/T）位點TT型、CC型個體總乳頭數顯著高于CT型個體（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點AA型個體和AC型個體總乳頭數分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）高于CC型個體；CC型個體妊娠期分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）高于AC型個體和AA型個體。其他性能在各基因型個體間均無顯著差異（P>0.05，表4）。

2.6 DCN基因多態位點對大白豬產仔性狀的影響

rs346372784（C/T）位點CT型個體死胎數顯著高于TT型個體（P<0.05），CC型個體活仔數顯著高于CT、TT型個體（P<0.05），CC型個體初生重極顯著高于CT型個體（P<0.01）、顯著高于TT型個體（P<0.05），CT型個體初生重顯著低于TT型個體（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點CC型個體初生重極顯著高于AA和AC型個體（P<0.01）。其他性能在各基因型個體間均無顯著差異（P>0.05，表5）。

2.7 DCN基因多態位點對大白豬繁殖性狀EBV的影響

rs346372784（C/T）位點CC型母系指數、活仔數EBV、繁殖指數極顯著高于CT型和TT型個體（P<0.01），CC型個體的總仔數EBV顯著高于CT型個體（P<0.05）、極顯著高于TT型個體（P<0.01）。rs55618082（C/A）位點AA型個體總仔數EBV、活仔數EBV、母系指數顯著高于CC型個體（P<0.05），AC型個體總仔數EBV、活仔數EBV、母系指數極顯著高于CC型個體（P<0.01），CC型個體繁殖指數極顯著低于AA和AC型個體（P<0.01）。其他性能在各基因型個體間均無顯著差異（P>0.05，表6）。

3 討論

3.1 DCN基因的遺傳多樣性分析

為深入探究DCN基因與大白母豬繁殖性狀的相關性，本研究通過DNA混池測序技術，在DCN基因中篩查到2個已知的SNPs位點，分別為rs55618082（C/A）、rs346372784（C/T）。通過基因分型技術在大白母豬群中對這兩個SNPs進行基因分型。結果發現，2個SNPs位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態，說明該群體未受人工干預選育。rs55618082（C/A）、rs346372784（C/T）位點純合度均高于雜合度。rs55618082（C/A）位點屬于中度多態，rs346372784（C/T）位點屬于低度多態。研究報道與微衛星標記相比，SNP的多態性較低，但因為SNP標記豐富且在整個基因組中分布廣泛［11］，可在一定程度上彌補其相較于微衛星等其他分子標記方法中多態性較低的問題，所以與性狀聯系密切的SNP可作為重要性狀標記輔助選擇的標記。

3.2 rs55618082（C/A）位點對大白母豬繁殖性能的影響

研究表明同義突變可以通過改變剪切位點以及mRNA的二級結構等多種機制影響基因的轉錄和翻譯，進而影響其蛋白質的功能，最終引起個體表型發生變化［12-13］。如王思霽［14］發現MYO15A基因c.9861C>T同義突變會導致其mRNA的剪接異常進而引起人耳聾。小鼠IGF-1基因發生c.258A>G同義突變導致其血清中IGF-1分泌水平顯著降低［15］。此外，研究發現同義突變可影響RNA二級結構并發生等位基因特異的RNA編輯，從而引起表型的變化［16］。如Sharma［17］發現KRAS基因發生c.30A>C同義突變后KRAS基因mRNA的二級結構從野生型的“Y”狀變為突變型的“l”狀并增強其mRNA的表達。對此，本研究對DCN基因rs55618082（C/A）位點同義突變前后的mRNA二級結構進行預測，發現突變前后基因mRNA二級結構和自由能均發生改變。通過與大白母豬繁殖性能的進一步關聯分析發現rs55618082（C/A）位點對大白母豬的母系指數、繁殖指數、乳頭數、妊娠期長、初生重、總仔數EBV、活仔數EBV呈極顯著相關（P<0.01）。提示DCN基因rs55618082（C/A）位點對大白母豬繁殖性能相關的影響可能與DCN基因發生同義突變后影響其mRNA穩定性或蛋白翻譯效率等相關，但具體的機制有待進一步研究。

3.3 rs346372784（C/T）位點對大白母豬繁殖性能的影響

在人類基因組中，有98%為非編碼序列，其中一部分以內含子形式存在［18］。前期研究者認為基因內含子區的序列不編碼蛋白質，因此不具備生物學功能，并且不會對生物體造成影響［19］。隨著研究的深入，研究工作者逐漸發現基因內含子區域的部分序列也會參與一些生物學進程的調控，使得位于其中的突變會對生物體表型產生影響。如陳君霖［20］發現SLC25A13基因IVS6-11A> G內含子突變可以通過改變剪接方式導致Citrin缺陷病致病突變。王玲芳等［21］發現大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點的內含子突變可以影響母豬的總產仔數。徐夢思等［22］研究表明TGFβRI基因內含子多態性與豬產活仔數顯著相關。本研究中發現的rs346372784（C/T）位點位于DCN基因第4內含子區，通過與大白豬群體的繁殖性能的關聯分析發現，rs346372784（C/T）位點CC型個體活仔數、繁殖指數、總仔數EBV、活仔數EBV、母系指數與CT型個體或TT型個體呈現顯著或極顯著相關。合適的樣本數量有利于增加獲取的遺傳標記的可靠性［23］，本研究發現大白豬群體中rs346372784（C/T）位點CC基因型頻率較小，僅有11頭，這可能導致結果存在一定的差異，需要在后期擴大樣本容量進行研究。

4 結論

本研究在大白母豬DCN基因中篩查到的2個SNPs（rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A））均對大白母豬繁殖性能有顯著或極顯著影響，有望作為大白母豬繁殖性能的潛在分子遺傳標記，為大白母豬分子輔助育種提供參考依據。

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