常見肝癌細胞系的轉鐵蛋白受體表達差異分析及主動靶向載體效率比較

張效瑋, 王興芝, 王永安, 全東琴, 申遼

(軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所, 北京 100850)

肝癌病程發展快,死亡率高,是中國最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于肝癌發病隱匿,多數患者確診即處于中晚期,無法進行手術切除,因此僅能接受射頻消融、介入栓塞或系統性化學藥物等治療[2-3]。然而,在臨床實踐中,化療藥物治療效果不甚理想,存在耐藥、副作用大等問題,且治療后腫瘤復發及轉移率高,五年生存期不足15%[4]。因此,肝癌的臨床治療仍是頗具挑戰性的難題。

納米藥物遞送系統的發展有望解決上述問題。通過特定材料對藥物所包載形成的納米結構,能夠改善原有藥物的不足,達到如延長體內半衰期,增加生物利用度,靶向腫瘤組織等目的[5-6]。其中,表面修飾主動靶向型納米載體備因可設計性強、發展潛力大而備受關注[7]。主動靶向納米遞藥系統常被比喻為“精確制導導彈”,該系統根據腫瘤部位進行針對性設計,將可與腫瘤細胞相互作用的分子通過共價鍵等方式修飾于納米顆粒的表面,使載體與腫瘤細胞表面特異性結合,經過細胞轉運等過程將藥物遞送至腫瘤內部,達到增效減毒的目的[7-8]。

目標靶點的選擇是主動靶向載體設計的關鍵環節。據報道,肝癌細胞表面存在轉鐵蛋白受體、葉酸受體、表皮生長因子受體等特異性表達或過表達的現象[9-11]。其中轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)由于能夠介導細胞內吞作用,有利于癌細胞高效攝取納米粒,是最為常用的納米載體遞送靶點之一[10, 12]。在科學研究中,研究人員通常使用肝癌細胞系建立體外及動物水平模型,評價轉鐵蛋白受體靶向載體的遞送效率及抗腫瘤作用[13-14]。然而目前肝癌細胞系種類繁多,來源差異導致細胞表面轉鐵蛋白受體表達情況也存在一定差距[15-16]。但目前尚未有研究報道比較不同肝癌細胞系的轉鐵蛋白表達情況,不利于準確評價納米載體的靶向性以及腫瘤治療效果。

現選取4種常見的肝癌細胞系,從基因表達層面、蛋白質表達層面對不同細胞系的轉鐵蛋白表達情況進行對比研究。同時,分別選擇重組人轉鐵蛋白(transferrin,Tf)以及轉鐵蛋白核酸適配體(transferrin nucleic acid aptamer,Tf-APT)作為靶向分子,考察其在不同細胞系中的靶向結合效率。研究結果可為針對肝癌的納米藥物載體研究提供相關研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人肝癌細胞HepG2、Hep3B、MHCC97-H、Huh-1,浙江美森細胞科技有限公司;Cy3標記轉鐵蛋白(Cy3-transferrin,Cy3-Tf),西安昊然生物科技有限公司;Cy5標記轉鐵蛋白核酸適配體(Cy5-transferrin nucleic acid aptamer,Cy5-Tf-APT,序列Cy5-TTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGTACCACGC-inverted dT),蘇州貝信生物技術有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),DMEM培養基,美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),武漢賽維爾生物科技有限公司;Transfer Buffer(25 mmol/L Tris base, 0.2 mol/L glycine, 20% methanol pH 8.5),北京希諾因子科技有限公司;SDS Sample Buffer (1×)(62.5 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8 at 25 ℃), 2% SDS, 10% glycine, 50 mmol/L DTT, 0.1% bromophenol blue)北京康潤誠業生物科技有限公司;Blocking Buffer(1×TBS, 0.1% Tween-20, 5% nonfat dry milk)上海碧云天生物技術有限公司;10×TBS( Tris-buffered saline)北京希諾因子科技有限公司;Wash Buffer (TBST)北京希諾因子科技有限公司;5×TGS(SDS-PAGE Electrode Buffer),北京博泰斯生物技術有限公司;SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates,北京安諾倫生物科技有限公司;M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent,北京安諾倫生物科技有限公司;PVDF Transfer Membrane,美國Millipore公司;Anti-Transferrin Receptor antibody(EPR20584), 艾博抗(上海)貿易有限公司; 小鼠抗β-actin單克隆抗體(30101ES50), Preoxidase-conjugated goat anti-Rabbit IgG(P16726), Preoxidase-conjugated goat anti-Mouse IgG(P07141), 上海翌圣生物科技股份有限公司;PowerPacTMHC電泳儀,美國bio-rad公司;VE-180垂直電泳槽,上海天能科技有限公司;VE-386半干轉膜儀,上海天能科技有限公司;DY-B1脫色搖床,上海滬西儀器廠有限公司;KODAK X-Omat BT Film,伊士曼柯達公司;濾紙 (3MM),英國whatman公司。

1.2 細胞培養

細胞均使用含10% FBS的DMEM高糖培養基 (含100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin)進行培養,在二氧化碳培養箱內( 37 ℃、5% CO2、飽和濕度) 中進行連續培養、傳代。

1.3 實時熒光定量檢測(RT-PCR)細胞中TfR1表達

培養HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細胞,待其生長至對數生長期后,將各細胞樣本收集,使用TRLzol法進行總RNA提取,并逆轉錄為cDNA。通過RT-PCR方法檢測細胞中TfR1的mRNA表達水平,使用GAPDH作為內參照。反應體系20 μL,反應條件為95 ℃, 3 min,變性;95 ℃, 12 s, 62 ℃, 40 s,40個循環,在每個循環延伸末端點收集熒光信號,繪制擴增曲線并計算。引物設計見表1。

表1 引物合成Table 1 Primer synthesis

1.4 蛋白免疫印跡法檢測TfR1細胞中表達

培養HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細胞,待其生長至對數生長期后,細胞中TfR1表達情況,以β-actin蛋白作為內參照蛋白。實驗操作:使用 PBS 洗滌細胞3 次至除去培養基,加入RIPA裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1,體積比),冰上裂解10 min后收集至離心管中。將樣品在12 000 g、4 ℃條件下離心5 min,小心收集上清液。樣品通過10% SDS-PAGE分離后,使用半干法進行轉印將蛋白轉移至PVDF膜(100 mA,時間40 min)。使用封閉液處理60 min,加入一抗并置于4 ℃過夜后,加入二抗并置于室溫孵育120 min。使用ECL試劑盒進行條帶顯影,并進行圖像分析。

1.5 轉鐵蛋白靶向結合效率測定

將處于對數生長期的HepG2等肝癌細胞接種至6孔板中,細胞接種密度為3×105個/孔。繼續培養24 h使細胞貼壁后,將培養基更換為含有Cy3-Tf的PBS溶液(Cy3-Tf終濃度為100 μg/mL)。37 ℃,5% CO2恒溫培養箱中孵育2 h后,使用新鮮PBS沖洗,除去未結合的Cy3-Tf,并通過高內涵細胞成像分析系統測定細胞熒光強度值。

1.6 轉鐵蛋白核酸適配體靶向結合效率測定

培養HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細胞,待其增殖至對數生長期后分別接種至6孔板中,接種密度3 × 105個/孔。繼續培養24 h使細胞貼壁后,將培養基更換為2 mL含有Cy5-Tf-APT的PBS溶液(Cy5-Tf-APT終濃度為0.3 OD/mL)并混合均勻,于37 ℃,5% CO2恒溫培養箱中繼續培養2 h后,使用新鮮PBS沖洗,除去未結合的Cy5-Tf-APT,并使用高內涵細胞成像分析系統測定細胞熒光強度值。

1.7 CCK-8法測定Cy3-Tf、Cy5-Tf-APT細胞毒性

培養HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細胞,待其增殖至對數生長期后分別接種至96孔板中,接種密度5 × 103個/孔。繼續培養24 h使細胞貼壁后,將Cy3-Tf或Cy5-Tf-APT添加至各孔中并混合均勻。孵育2 h后,各孔更換新鮮完全培養基,于37 ℃,5% CO2恒溫培養箱中繼續培養24、48 h,使用CCK-8試劑檢測細胞生長抑制率。

1.8 載紫杉醇轉鐵蛋白受體靶向脂質體的制備

使用乙醇注入-薄膜擠出法制備空白脂質體(LP)、包載紫衫醇的普通脂質體(PTX-LP)以及表面修飾轉鐵蛋白的靶向脂質體(Tf-PTX-LP)。制備方法:定量稱量蛋黃卵磷脂、DSPE-PEG2000-Tf(LP、PTX-LP組不添加)及紫杉醇(LP組不添加),完全溶解于乙醇后,緩慢滴入純化水中并充分渦旋混勻,進一步稀釋后得到初步貯備液;使用薄膜擠出儀處理貯備液,得到紫杉醇脂質體。使用激光粒徑粒度分析儀測定其平均粒徑以及Zeta電位;通過高效液相色譜法測定脂質體中紫杉醇含量。

1.9 載紫杉醇轉鐵蛋白受體靶向脂質體的體外抗腫瘤作用

培養HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細胞,待其增殖至對數生長期后分別接種至96孔板中,接種密度5 × 103個/孔。繼續培養24 h使細胞貼壁后,各孔更換新鮮培養基并分別添加PBS、LP、PTX-LP以及Tf-PTX-LP。除PBS組外,LP、PTX-LP以及Tf-PTX-LP組添加總脂質量相同,均為1.0 mg/mL; PTX終濃度均為2.0 μg/mL。于37 ℃,5% CO2恒溫培養箱中繼續培養4 h后更換新鮮培養基,繼續培養至24 h。使用CCK-8試劑盒測定各組細胞存活率,計算Tf-PTX-LP組的細胞相對靶向存活率,計算公式為

1.10 統計分析

數據應用GraphPad Prism9進行分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示,多個不同處理組組內、組間計量資料的比較應用單因素方差分析。取雙側為檢驗標準,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝癌細胞中TfR1表達水平差異

RT-PCR測定結果結果見圖1(以HepG2為參比)。從mRNA表達水平來看,不同肝癌細胞系TfR1的表達存在顯著性差異,其中Huh-1細胞及Hep3B細胞表達水平較高,HepG2及MHCC97-H細胞表達水平較低。TfR1蛋白表達量測定結果見圖2(參比蛋白β-actin)。TfR1蛋白在細胞中的實際表達情況趨勢與其對應mRNA表達水平具有相似性,但也存在一定的差異。其中,Huh-1細胞中TfR1蛋白表達量最高,與RT-PCR定量結果一致;但是HepG2及Hep3B細胞中TfR1蛋白表達量偏低。

樣本數n=3,*表示P <0.05圖1 不同肝癌細胞系TfR1 mRNA表達水平Fig.1 TfR1 mRNA expression in different hepatoma cell lines

2.2 Tf以及Tf-APT的靶向結合效率及細胞毒性

本節分別測定了Tf以及Tf-APT對不同肝癌細胞的靶向結合效率。Tf以及Tf-APT與各細胞系的靶向結合效率與其轉鐵蛋白受體的表達水平存在相關性,測定結果見圖3。其中Huh-1的平均熒光強度最強,靶向結合效率最高;HepG2、MHCC97-H、Hep3B次之,靶向結合效率相較更弱。細胞生長抑制實驗結果表明,實驗周期內Tf及Tf-APT未產生明顯的細胞毒性,不會影響細胞的活力[圖4(a)、圖4(b)]。

樣本數n=6, *表示P <0.05圖4 體外細胞毒性實驗結果Fig.4 The results of in vitro cytotoxicity

2.3 紫杉醇脂質體的制備體外表征

從表2可知,LP以及PTX-LP粒徑約為40 nm,聚合物分散性指數(polymer dispersity index,PDI)為0.220,粒徑分布較均為均一且Zeta電位為-8.42±1.20, 說明脂質體表面攜帶負電荷;Tf-PTX-LP表面通過共價鍵修飾了Tf蛋白,因此粒徑有所增大,平均粒徑約為50 nm,Zeta電位為-15.37 ± 0.96,表面所攜帶負電荷較PTX-LP更多。HPLC含量測定結果表明,PTX-LP和Tf-PTX-LP的藥物含量一致,均為20 μg/mL左右。

表2 紫杉醇脂質體體外表征結果(n=3)Table 2 Results of in vitro characterization of paclitaxel liposomes(n=3)

2.4 體外細胞生長抑制評價

由于不同細胞系對于抗腫瘤藥物的敏感性存在差異,因此以靶向組(Tf-PTX-LP)與非靶向組(PTX-LP)的細胞增值率比值計算相對細胞增殖率,用于分析比較靶向基團的引入對不同肝癌細胞抑制能力差異。圖4(c)、圖4(d)顯示,Huh-1細胞系對于Tf靶向納米粒的敏感性較高,細胞增殖率最低;HepG2、Hep3B、MHCC97-H細胞次之,對于Tf靶向納米粒的敏感性相對較弱。PBS組及LP組未顯示出生長抑制作用,表明納米材料對細胞無細胞毒性。

3 討論

TfR1可通過受體介導的機制促進細胞對靶向結合的納米粒子進行攝取,此過程已在多年的研究中得到確證。因此,基于TfR1靶向的納米載體成為了研究最為廣泛且最具希望的主動靶向型納米藥物遞送系統之一。其中,由于肝癌細胞表面存在TfR1高表達的現象,許多研究者的目光投向了這一靶點,以期通過主動靶向作用,增加腫瘤部位的藥物分布,強化抗腫瘤治療效果的同時減輕藥物的不良反應。然而,肝癌患者個體情況差異較大,同時癌癥成因也較為復雜,如感染慢性病毒性肝炎(尤其是慢性乙型病毒性肝炎)或攝入黃曲霉毒素等。因此,肝癌在基因層面差異顯然不容忽視。而這一差異很可能會導致蛋白表達水平的不同,因此TfR1在肝癌細胞中的實際表達情況仍值得探討。

體外抗腫瘤作用是基于TfR1靶點納米載體的重要研究部分,如靶向結合能力評價等。因此,有必要對常用的細胞系TfR1表達情況進行探討。本研究選取了4種研究中常用的肝癌細胞系,其詳細信息見表3,實驗流程示意圖如圖5所示。通過對各個細胞系mRNA水平以及蛋白表達水平的分析,各細胞系之間的TfR1表達存在一定的差異。從mRNA表達水平表達來看,各組均存在TfR1表達,且Huh-1及Hep3B細胞系表達較其他細胞系高;TfR1蛋白表達WB實驗結果雖然總體趨勢與mRNA表達水平相近,僅Huh-1細胞系表達水平較高,但實際分析結果存在一定程度的差異,這可能是由于細胞內存在其他調節機制所導致的。因此,僅憑借RT-PCR實驗測定mRNA表達水平進而推定實際TfR1蛋白表達情況,仍存在一定偏差。

圖5 實驗流程示意圖Fig.5 Schematic diagram of the experiments

表3 肝癌細胞系的詳細信息Table 3 Details of the five hepatoma cell lines

本研究分別考察了轉鐵蛋白(Tf)以及轉鐵蛋白核酸適配體(Tf-APT)對上述幾種肝癌細胞的靶向親和能力。Tf和Tf-APT是TfR1的親和配體,將其通過共價鍵修飾于納米載體表面,是制備轉鐵蛋白受體靶向藥物遞送系統的常見手段。實驗結果表明,Tf和Tf-APT的靶向親和程度與細胞系所表達的TfR1水平呈現正相關性,因此理論上不同的細胞系對TfR1靶向納米載體的敏感性也存在一定區別。因此,本研究制備了表面修飾轉鐵蛋白脂質體,并包載抗腫瘤化療藥物紫衫醇作為模型藥物,進一步考察其對不同細胞系間細胞毒性的差異。實驗結果與Tf的靶向親和性趨勢一致,即Tf-PTX-LP對于親和程度較高的Huh-1細胞系相對靶向存活率更低,細胞生長抑制作用更為明顯。

4 結論

研究結果表明,不同肝癌細胞的轉鐵蛋白受體1表達水平存在明顯的差異,并且這一差異直接影響了針對該靶點設計的主動靶向載體的結合、遞送效率。目前,多數研究僅選擇一種體外細胞模型對靶向納米載體進行評價。建議在相關實驗研究中,應對細胞模型進行充分的研究,從mRNA及蛋白表達水平初步判斷體外模型合理性,并適當選擇兩種或以上的細胞系作為評價模型,以便更為充分地探究納米載體的靶向性能,獲得更多有益于研究及產品研發的信息。