piRNA DQ725559通過抑制心肌細胞鐵死亡通路抗心肌缺血再灌注損傷的作用

摘要：

為探究心肌缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion Injury，IRI）與鐵死亡關系，尋找相關Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA），利用小鼠乳鼠原代心肌細胞缺氧/復氧（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）構建心肌細胞IRI模型，通過細胞生存率反映誘導鐵死亡最佳H/R時間點，篩選鐵死亡相關piRNA，檢測鐵死亡相關指標變化。研究結果顯示，缺氧18 h/復氧6 h后，心肌細胞鐵死亡和IRI呈現關聯，抑制DQ725559的表達會加重心肌細胞鐵死亡和IRI，過表達DQ725559會減輕心肌細胞鐵死亡和IRI。研究結果表明，DQ725559可通過調節心肌細胞鐵死亡通路發揮IRI調控作用，過表達DQ725559可成為RNA治療心血管疾病新策略。

關鍵詞：

缺血再灌注損傷；piRNA；心肌細胞；鐵死亡

中圖分類號：R542.2"""""""" 文獻標志碼：A

收稿日期：2023-10-10

基金項目：

國家自然科學基金（批準號：82070313）資助。

通信作者：

王昆，女，博士，教授，主要研究方向為心臟及心血管疾病分子機制。E-mail：wangk696@qdu.edu.cn

針對心肌梗死患者實施及時有效的心肌再灌注，減少急性心肌缺血性損傷和心肌梗死范圍，但再灌注過程本身可誘導心肌細胞死亡，造成心肌缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion Injury，IRI）［1］。缺血期間心肌細胞內琥珀酸大量積累會加劇心肌再灌注損傷，通過減輕琥珀酸積累可以降低再灌注損傷。丙二酸能抑制琥珀酸脫氫酶，減少心肌細胞琥珀酸積累，發揮IRI治療作用。但臨床轉化發現丙二酸難以滲透細胞膜，無法準確靶向受損心肌組織［2］。因此，需要開發不受細胞膜阻礙且能靶向治療IRI的RNA療法。RNA療法除能夠調節基因表達，還可生產治療性蛋白或激發免疫反應的抗原，從而治療包括傳染病、癌癥、免疫疾病和遺傳疾病等疾病。Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）作為長度約24至31個核苷酸小非編碼RNA分子，通常結合Piwi蛋白家族成員以發揮細胞通路調控作用。piRNA在多種人類組織中以組織特異性方式表達，其中心臟組織異常表達的piRNA是心血管疾病診斷和治療的新型生物標志物和靶點［3-6］。鐵死亡本質是谷胱甘肽耗竭導致脂質氧化物不能通過谷胱甘肽過氧化酶4（Recombinant Glutathione Peroxidase 4，GPX4）催化谷胱甘肽還原酶反應正常代謝，接著二價鐵離子催化脂質氧化誘導細胞氧化應激，伴隨細胞內二價鐵離子、環加氧酶2（Recombinant Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2，ptgs2）、乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase，LDH）等指標升高，線粒體損傷，細胞功能出現障礙［7-8］。針對鐵死亡加劇敗血癥引起的心臟炎癥，特異性鐵死亡抑制劑鐵抑制素-1（Ferrostatin-1，Fer-1）可降低心肌細胞ptgs2和炎癥因子，改善敗血癥心臟功能障礙［9］。GPX4是鐵死亡分子機制中樞調節因子，溶質載體家族7成員11（Recombinant Solute Carrier Family 7 Member 11，SLC7A11）掌控胱氨酸和谷氨酸出入細胞。心肌細胞IRI模型造成心肌損傷后，通過增加GPX4或SLC7A11能抑制鐵死亡，減少心肌梗死面積，減輕心肌損傷，維護心臟功能［10-13］。因此，本研究篩選心肌細胞特異piRNA，調控鐵死亡分子通路，探究DQ725559對IRI的調節作用和機制，為臨床RNA治療心肌IRI提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本和主要試劑

心肌細胞樣本源自新生3日內小鼠乳鼠分離培養所得原代心肌細胞（青島大任富城畜牧有限公司），使用含5%胎牛血清DMEM/F12培養（美侖生物）；RNA過表達模擬物和抑制劑（Gene Pharma）；Lipo 8000轉染試劑（Beyotime）；Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ（Accurate Biology）；SYBR qPCR Master Mix（Monad）；鐵死亡相關基因檢測引物（生工生物）；GPX4（ZEN-BIOSCIENCE）；SLC7A11（ZEN-BIOSCIENCE）；β-actin（ZEN-BIOSCIENCE）；辣根過氧化物酶偶聯二抗（愛必信生物）；ECL化學發光試劑（Vazyme）；LDH檢測試劑盒（Solarbio）。

1.2 細胞分離培養

超凈臺內使用無菌眼科剪沿乳鼠前胸劍突偏左方向剪約5 mm小口，完整取出心臟置于冰板。用PBS緩沖液清洗心臟血液和粘連多余組織后，置心臟于PBS中保持細胞活性。均勻剪碎心臟呈漿狀，用無菌吸管吸取漿狀心臟組織置于無菌錐形瓶內，配合胰液素、二型膠原酶和PBS于37 ℃水浴消化。每5 min收集含心肌細胞消化液，移置于含10%預冷胎牛血清50 mL離心管內，再次加入消化液消化剩余沉淀物。待漿狀心臟組織逐漸減少，直至變為白色絮狀物，消化完成。以1 000 rpm離心心肌細胞懸液5 min。棄去不含心肌細胞上清，用DMEM/F12重懸底部細胞沉淀后，重復1次上述離心過程。再次棄去上清，用10 mL 5%血清DMEM/F12培養基重懸沉淀，使用移液槍輕柔吹打混勻細胞懸液，每次吸取1 mL懸液經無菌100目篩網，含心肌細胞懸液篩入10 cm規格細胞培養皿，置于37 ℃含21%O2常氧細胞培養箱差速貼壁。培養1.5 h后，心肌細胞還未貼壁，而成纖維細胞等已貼壁，由此分離心肌細胞，置于常氧細胞培養箱，待后續實驗。

1.3 IRI模型構建

基于心肌細胞H/R操作，構建心肌細胞IRI模型。根據相應缺氧時間，心肌細胞移入含95%N2低氧細胞培養箱，保持37 ℃，置于無血清無糖DMEM/F12培養基，模擬缺血。缺氧結束后，心肌細胞移入含21%O2常氧細胞培養箱，保持37 ℃，置于含5%胎牛血清DMEM/F12培養基，根據所需時間完成復氧操作，模擬再灌注，IRI模型構建完成。

1.4 細胞轉染

分3組完成細胞轉染：陰性對照（Negative control，NC）組、DQ725559過表達（DQ725559 mimics）組和DQ725559抑制劑（DQ725559 inhibitor）組。無菌EP管中先加入125 μL無血清DMEM/F12培養液，再加入1×10-4 μmol的NC或過表達模擬物或抑制劑，最后加入4 μL Lipo8000轉染試劑，用移液槍輕柔吹打混勻。室溫靜置20 min，轉染復合物制備完成。轉染復合物均勻添加至心肌細胞培養基，6 h后，觀察細胞狀態，更換1次培養基，繼續培養24 h～36 h完成轉染。

1.5 鐵死亡相關基因檢測

提取心肌細胞總RNA，使用鐵死亡相關基因檢測引物，配合反轉錄試劑盒，獲得目的RNA的cDNA產物。配合SYBR qPCR Master Mix完成qRT-PCR擴增和檢測（表1）。

1.6 細胞存活率測定

分離培養小鼠乳鼠原代心肌細胞接種入96孔板?？瞻捉M僅含DMEM/F12培養基，37 ℃恒溫常氧培養；對照組和實驗組均含DMEM/F12培養基和心肌細胞，37 ℃恒溫常氧培養。Fer-1組用10 mg/kg Fer-1預處理細胞24 h，無Fer-1組和Fer-1組均按照設置時間完成H/R培養。收取細胞后，依照細胞增殖（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒使用方法配合多功能微孔檢測儀在593 nm波長下檢測吸光度，測定細胞生存率。

1.7 LDH檢測

LDH是一種穩定存在于細胞胞漿內的酶，細胞死亡時，質膜發生破裂，LDH迅速釋放至細胞外，因此可通過檢測LDH水平反映細胞死亡狀況，其水平越高則表示細胞死亡越多。不收取細胞且只收取各組含細胞分泌物培養基作為樣品，配合LDH檢測試劑盒和多功能微孔檢測儀，450 nm波長下檢測吸光度和LDH水平。

1.8 鐵死亡相關蛋白檢測

收取相應細胞樣品提取總蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度確定上樣濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠作為蛋白質印跡實驗蛋白膠，分離不同分子量蛋白（KDa）。電泳至目標蛋白條帶適當分離，制作濾紙、聚偏二氟乙烯膜、蛋白凝膠“三明治”轉膜結構，在轉膜液完成轉膜過程。此時蛋白已經附著于膜，膜浸泡于5%脫脂牛奶封閉非特異性結合位點，選擇所需一抗（GPX4、SLC7A11、β-actin）于4 ℃環境結合膜表面目的蛋白，結合過程需要12 h以上。一抗和蛋白完成結合后，使用TBST洗去非特異性結合，使用二抗室溫結合一抗2 h。結合完成后，再次使用TBST洗去非特異性結合，棄去TBST，換成ECL化學發光試劑充分浸泡膜，顯影和分析目的蛋白條帶。

1.9 碘化丙錠染色實驗

使用PBS配制終濃度為0.5 mg/mL的碘化丙錠（Propidium iodide，PI）工作液，加入培養皿完全浸沒活細胞室溫孵育30 min。孵育結束，PBS沖洗PI工作液。4%多聚甲醛固定細胞和10 μg/mL DAPI染細胞核后封片。PI進入死亡心肌細胞內與DNA結合。熒光顯微鏡488 nm激發光下死亡心肌細胞呈紅色，為PI陽性細胞。應用Image J軟件統計分析染色結果，PI陽性細胞比率（%）=細胞死亡數/總細胞數。

1.10 統計學分析

應用Graphpad Prism軟件分析實驗數據和制作統計圖。兩獨立樣本比較采用t檢驗。多組間比較先采用雙因素方差分析或單因素方差分析，隨后采用Post Hoc檢驗。檢驗結果顯示Plt;0.05表示具有統計學差異（*、**、***、****分別表示Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001、Plt;0.000 1）。

2 結果

2.1 H/R誘導心肌細胞鐵死亡時間點篩選

為確定IRI模型誘導細胞鐵死亡所需最佳缺氧和復氧時間，設置6/6 h，12/6 h，18/6 h，24/6 h 4個H/R時間點，基于CCK-8檢測小鼠乳鼠原代心肌細胞存活率。由圖1可知，經歷H/R后，心肌細胞存活率相較于對照組心肌細胞存活率均下降。Fer-1組使用含10 mg/kg Fer-1 DMEM/F12培養基，抑制心肌細胞鐵死亡。相較于無Fer-1組，Fer-1組H/R（18/6）細胞生存率提高最顯著。因此，缺氧18 h/復氧6 h，心肌細胞存活率受鐵死亡影響最顯著。選擇18/6 h時間點完成H/R處理有利于構建IRI模型誘導心肌細胞鐵死亡，有助于探究心肌細胞IRI和鐵死亡關系，本研究后續均選擇18/6 h完成H/R處理。

2.2 鐵死亡相關piRNA篩選

分別檢測對照組和H/R誘導鐵死亡組相關piRNA表達水平，通過轉錄組測序篩選差異表達的piRNA。選擇差異表達最明顯（差異變化倍數高于2倍）的piRNA，通過qPCR技術確認H/R后的心肌細胞中表達下調的piRNA水平變化。圖2中piRNA篩選結果顯示，心肌細胞H/R后，DQ725559表達最顯著降低，心肌細胞（Cardiomyocytes，CM）中的表達高于心臟成纖維細胞（Cardiac fibroblasts，CF），同時心臟組織中的表達高于其他組織。綜上，DQ725559篩選為目的piRNA，是心肌細胞鐵死亡高度相關piRNA，其缺失有助于IRI誘導心肌細胞發生鐵死亡，可能參與心肌細胞鐵死亡通路調控。

2.3 抑制DQ725559表達加劇IRI和鐵死亡

由圖3可知，DQ725559在心肌細胞H/R后表達降低，表明DQ725559參與IRI誘導心肌細胞鐵死亡。細胞轉染構建心肌細胞NC組、DQ725559 inhibitor組，檢測和分析相關指標。轉染效率驗證結果顯示，抑制劑有效抑制心肌細胞內DQ725559表達，DQ725559 inhibitor組模擬了心肌細胞缺失DQ725559狀態，在此狀態下可以驗證抑制DQ725559表達后功能。抑制DQ725559表達后，心肌細胞鐵死亡標志性基因ptgs2表達增加，說明鐵死亡加劇。抑制DQ725559表達后，心肌細胞LDH水平升高，說明更多心肌細胞發生死亡。上述結果表明，DQ725559缺失有助于IRI誘導心肌細胞鐵死亡發生，導致心肌細胞在缺血再灌注過程更容易受損傷而死亡。

2.4 過表達DQ725559減輕IRI和鐵死亡

由圖4可知，根據細胞轉染，構建心肌細胞NC組、DQ725559 mimics組，檢測和分析相關指標。轉染效率驗證結果顯示，過表達模擬物有效提高了心肌細胞內DQ725559表達，DQ725559 mimics組模擬了心肌細胞過表達DQ725559狀態，在此狀態下可以驗證過表達DQ725559后功能。H/R條件下過表達DQ725559后，心肌細胞鐵死亡標志性基因ptgs2表達減少，說明鐵死亡減輕。蛋白條帶顯示鐵死亡通路相關標志物表達水平，H/R+DQ725559 mimics組鐵死亡標志蛋白GPX4和SLC7A11表達呈現增多，GPX4和SLC7A11增多有利于減輕鐵死亡，說明過表達DQ725559具有抑制心肌細胞鐵死亡作用。H/R+DQ725559 mimics組的LDH水平降低，PI陽性細胞比率下降，說明過表達DQ725559抗心肌細胞死亡。這表明，通過調節鐵死亡通路關鍵因子GPX4和SLC7A11，過表達心肌細胞內DQ725559能有效抑制心肌細胞鐵死亡，有利于心肌細胞在IRI中存活，呈現心肌細胞保護作用。

3 討論

通過細胞不斷更新，能維持人體器官組織正常運作和內環境穩態。心肌細胞作為終末分化細胞無法更新，其過度死亡引發心肌梗死、心肌IRI、動脈粥樣硬化等心血管疾?。?4］。生理條件下鐵離子參與機體代謝，正常鐵代謝維護細胞功能，異常鐵代謝誘發鐵死亡。鐵死亡是心肌IRI誘導心肌細胞死亡的一種形式，屬于調節性細胞死亡，具有鐵依賴性，不同于細胞凋亡和壞死。心肌出血觸發游離鐵釋放，破壞正常鐵代謝，所以通過使用心臟磁共振成像技術預測心肌鐵水平和檢測心肌出血以評估心臟健康狀況，為早期發現和干預鐵死亡和心肌損傷提供參考。但病理環境中鐵死亡的治療技術欠缺，目前只能依賴自由基捕獲抗氧化劑如利普他汀，因此有必要開發新策略用于治療心肌IRI和預防鐵死亡，改善缺血性心臟病患者的臨床預后［15-16］。piRNA最早發現于果蠅生殖細胞，后發現廣泛參與到人類腸、腦、脊髓等器官組織的細胞調控機制中，涉及人類疾病發生發展［17-21］。本研究充實了piRNA在心血管疾病的調控作用，發現DQ725559是心肌細胞特異piRNA且參與IRI誘導心肌細胞鐵死亡，DQ725559可調節鐵死亡通路關鍵因子SLC7A11和GPX4，具有預防和治療心肌IRI潛力。這表明，基于piRNA開發體內RNA療法可作為預防鐵死亡和治療心肌損傷新策略，優勢是可避開細胞膜障礙且靶向受損心肌發揮治療作用，實現臨床心血管疾病良好預后。

4 結論

本研究通過轉錄組測序篩選和qPCR驗證基因表達水平，發現DQ725559是心肌細胞特異piRNA，參與心肌細胞鐵死亡通路調控和心肌細胞IRI調控，DQ725559的缺失加劇心肌細胞死亡。過表達DQ725559通過增加鐵死亡通路蛋白SLC7A11和GPX4抑制心肌細胞鐵死亡，減輕心肌細胞死亡，發揮抗心肌細胞IRI作用。過表達DQ725559具有治療心肌IRI潛力，為開發預防和治療心血管疾病的RNA療法提供參考。

參考文獻

［1］HAUSENLOY D J， YELLON D M. Myocardial ischemia-reperfusion injury： A neglected therapeutic target［J］. Journal of Clinical Investigation， 2013， 123（1）： 92-100.

［2］PRAG H A， AKSENTIJEVIC D， DANNHOM A， et al. Ischemia-selective cardioprotection by malonate for ischemia/reperfusion injury［J］. Circulation Research， 2022， 131（6）： 528-541.

［3］WANG X， RAMAT A， SIMONELIG M， et al. Emerging roles and functional mechanisms of PIWI-interacting RNAs［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2023， 24（2）： 123-141.

［4］BAI X F， NIU R Z， LIU J， et al. Roles of noncoding RNAs in the initiation and progression of myocardial ischemia-reperfusion injury［J］. Epigenomics， 2021， 13（9）： 715-743.

［5］GAO X Q， ZHANG Y H， LIU F， et al. The piRNA CHAPIR regulates cardiac hypertrophy by controlling METTL3-dependent N6-methyladenosine methylation of Parp10 mRNA［J］. Nature Cell Biology， 2020， 22（11）： 1319-1331.

［6］WANG K， ZHOU L Y， LIU F， et al. PIWI-Interacting RNA HAAPIR regulates cardiomyocyte death after myocardial infarction by promoting NAT10-mediated ac4C acetylation of Tfec mRNA［J］. Advanced Science， 2022， 9（8）： e2106058.

［7］DIXON S J， LEMBERG K M， LAMPRECHT M R， et al. Ferroptosis： An iron-dependent form of nonapoptotic cell death［J］. Cell， 2012， 149（5）： 1060-1072.

［8］STOCKWELL B R. Ferroptosis turns 10： Emerging mechanisms， physiological functions， and therapeutic applications［J］. Cell， 2022， 185（14）： 2401-2421.

［9］XIAO Z， KONG B， FANG J， et al. Ferrostatin-1 alleviates lipopolysaccharide-induced cardiac dysfunction［J］. Bioengineered， 2021， 12（2）： 9367-9376.

［10］ TANG L J， ZHOU Y J， XIONG X M， et al. Ubiquitin-specific protease 7 promotes ferroptosis via activation of the p53/TfR1 pathway in the rat hearts after ischemia/reperfusion［J］. Free Radical Biology and Medicine， 2021， 162： 339-352.

［11］ FANG X X， CAI Z X， WANG H， et al. Loss of cardiac Ferritin H facilitates cardiomyopathy via Slc7a11-mediated ferroptosis［J］. Circulation Research， 2020， 127（4）： 486-501.

［12］ MA S X， SUN L Y， WU W H， et al. USP22 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury via the SIRT1-p53/SLC7A11-dependent Inhibition of ferroptosis-induced cardiomyocyte death［J］. Frontiers in Physiology， 2020， 11： 551318.

［13］ SEIBT T M， PRONETH B， CONRAD M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication［J］. Free Radical Biology and Medicine， 2019， 133： 144-152.

［14］ DEL RE D P， AMGALAN D， LINKERMANN A， et al. Fundamental mechanisms of regulated cell death and implications for heart disease［J］. Physiological Reviews， 2019， 99（4）： 1765-1817.

［15］ KOBAYASHI M， SUHARA T， BABA Y， et al. Pathological roles of iron in cardiovascular disease［J］. Current Drug Targets， 2018， 19（9）： 1068-1076.

［16］ LILLO-MOYA J， ROJAS-SOL C， MUOZ-SALAMANCA D， et al. Targeting ferroptosis against ischemia/reperfusion cardiac injury［J］. Antioxidants， 2021， 10（5）： 667.

［17］ ZHANG T J， CHEN L， LI R Z， et al. PIWI-interacting RNAs in human diseases： Databases and computational models［J］. Briefings in Bioinformatics， 2022， 23（4）： bbac217.

［18］ FANG X X， ARDEHALI H， MIN J X， et al. The molecular and metabolic landscape of iron and ferroptosis in cardiovascular disease［J］. Nature Reviews Cardiology， 2023， 20： 7-23.

［19］ LI Y， FENG D C， WANG Z Y， et al. Ischemia-induced ACSL4 activation contributes to ferroptosis-mediated tissue injury in intestinal ischemia/reperfusion［J］. Cell Death and Differentiation， 2019， 26： 2284-2299.

［20］ RONG Y L， FAN J， JI C Y， et al. USP11 regulates autophagy-dependent ferroptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury by deubiquitinating Beclin 1［J］. Cell Death and Differentiation， 2022， 29： 1164-1175.

［21］ TUO Q Z， LIU Y， XIANG Z， et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion［J］. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7： 59.

piRNA DQ725559 Resists Myocardial Ischemia-reperfusion Injury by Inhibiting the Ferroptosis Pathway of Cardiomyocytes

WANG Rui-quan， CHEN Xin-zhe， WANG Tao， WANG Kun

（Institute for Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

Abstract：

To explore the relationship between myocardial ischemia-reperfusion injury （IRI） and ferroptosis， and to find related Piwi-interacting RNA （piRNA）， myocardial cell IRI model was constructed by Hypoxia/Reoxygenation （H/R） of primary cardiomyocytes from neonatal mice. The optimal H/R time point for inducing ferroptosis was reflected by cell survival rate. piRNA associated with ferroptosis was screened and changes of ferroptosis related indexes were detected. The results show that ferroptosis is associated with myocardial IRI after hypoxia for 18 h and reoxygenation for 6 h. Inhibition of DQ725559 expression aggravates ferroptosis and myocardial IRI， while overexpression of DQ725559 alleviates ferroptosis and myocardial IRI. This suggests that DQ725559 can play a role in the regulation of myocardial IRI by regulating the ferroptosis pathway of cardiomyocytes， and overexpression of DQ725559 could be a new strategy for RNA therapy of cardiovascular diseases.

Keywords：

ischemia-reperfusion injury; piRNA; cardiomyocytes; ferroptosis