水蛭抗凝活性檢測兩種滴定方法比較

王文祎 趙衛濤 孫 希 楊金申 楊瑤珺*

1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.華治醫藥(云南)有限公司，云南 昆明 650199

中藥水蛭為水蛭科動物螞蟥(寬體金線蛭，WhitmaniapigraWhitman.)、水蛭(日本醫蛭，HirudonipponicaWhitman.)或柳葉螞蟥(尖細金線蛭，WhitmaniaacranulataWhitman.)的干燥全體[1-2]；菲牛蛭為醫蛭科動物菲牛蛭(馬尼擬醫蛭，PoecilobdellaManillensisLesson.)的干燥全體[2-3]，被《云南省中藥材標準》(云YNZYC-0357-2013)和《廣西壯族自治區瑤藥材質量標準》[4](DYB45-GXYYC0106-2021)收錄，其凍干粉炮制品又被《云南省中藥飲片標準》(云YBPZ-0199-2013)[5]收錄。以上4種水蛭均有破血痛經、逐瘀消癥等功效，是我國目前使用較為普遍的活血化瘀中藥品種。

為評價水蛭活血化瘀能力，中國藥典和地方標準均以抗凝血酶活性作為評價指標，其含量測定方法均參照1970年Markwardt報道的凝血酶測定法[6]制定，其原理是根據1個單位水蛭素抗凝血酶活力中和1個單位凝血酶測得樣品中所含水蛭素量。該方法簡單經濟、反應迅速、終點敏銳。但對于終點判斷的主觀性較強，導致其準確度和重復性不夠理想。萬明等[7]提出以白瓷板作為滴定載體，其終點結果更易觀察；劉義梅等[8]通過兩種方法的對比實驗，認為白瓷板滴定法結果更為準確，且樣品濃度、凝血酶濃度、滴定間隔時間等因素對于檢測結果均有影響。張利等[9-10]考察了待測樣品提取方式、提取溫度、供試液pH值等因素對結果的影響，且通過限定反應時間。滴定后攪動次數更精細化了滴定操作過程細節以提升實驗結果的準確性和客觀性。而云南省食品藥品監督管理局在2022年10月發布的《菲牛蛭凍干粉中藥飲片炮制規范征求意見稿》中，關于菲牛蛭凍干粉抗凝活性物質的滴定載體也由藥典的試管修改為白瓷板。以上一系列的研究與改進均說明藥典標準滴定方法，影響其結果的因素較多，改進的空間較大。

本實驗以寬體金線蛭藥材和菲牛蛭凍干粉為樣品，參照《中國藥典》和云南地標的滴定法，以及云南2022年發布的“征求意見稿”改進后的白瓷板法，對兩種滴定方法進行考察，并對其反應現象進行分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 數顯恒溫水浴鍋(HH-4，上海力辰邦西儀器科技有限公司)；電子天平(FA2004 d=0.0001 g，上海浦春計量儀器有限公司)；pH值測量儀(PH-100，浙江力辰儀器科技有限公司)；超聲儀(DK-80 上海致高精密儀器有限公司)；移液器(100～1000 μL，0.5～10 μL，艾本德公司)。

1.2 材料 菲牛蛭凍干粉[樣品1，華治醫藥(元江)有限公司提供；樣品2，云南玉藥生物制藥有限公司提供]；螞蟥(寬體金線蛭)藥材(樣品3，安國藥材市場購買，北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定)；纖維蛋白原(批號：140626-202012，中國食品藥品檢定研究院)；凝血酶(批號：140625-202013，每瓶含凝血酶1070 U，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸(西隴化工股份有限公司)；三羥甲基甲烷(上海韶遠試劑有限公司)；氯化鈉(上海易恩化學技術有限公司)；純化水。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取供試品粉末(過三號篩)，寬體金線蛭取樣約1 g(本實驗實際取樣量為1.0000 g)，菲牛蛭凍干粉取樣約0.25 g(本實驗實際取樣量為樣品1取樣0.2496 g，樣品2取樣0.2495 g)，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液，寬體金線蛭加入5 mL，菲牛蛭加入15 mL，超聲提取30 min，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2 測定法

2.2.1 藥典標準測定法 精密量取續濾液 100 μL，置試管中，加入含0.5%纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基鹽酸緩沖液[注1](臨用配制)200 μL，搖勻，置水浴中(37 ±0.5)℃溫浸5 min，滴加凝血酶溶液[注2](臨用配制，寬體金線蛭滴加濃度為每1 mL中含10單位的凝血酶溶液，每4 min滴加2 μL；菲牛蛭滴加濃度為每 1 mL 中含40單位的凝血酶溶液，每1 min固定滴加2～5 μL)，邊滴加邊輕輕搖勻至凝固(或有凝固物出現)，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按公式[注3]計算。

2.2.2 白瓷板滴定法 將白瓷點滴板浸于37 ℃水浴中，精密加入供試品溶液100 μL與含0.5%纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液[注1](臨用配制)200 μL，用攪拌針輕輕攪動搖勻，滴加每凝血酶溶液[注2](臨用配制，寬體金線蛭滴加濃度為每1 mL中含10單位的凝血酶溶液，每4 min滴加2 μL；菲牛蛭滴加濃度為每1 mL中含40單位的凝血酶溶液，每1 min固定滴加2～5 μL)，并用攪拌針輕輕攪動搖勻，以最后加入凝血酶溶液混勻反應1 min后，用攪拌針能挑到絲狀或塊狀凝固物為滴定終點(凝血酶溶液滴定體積控制在10～30 μL內，反應時間控制在10 min以內，如不在此范圍內應重新稀釋樣品或換管重滴)，記錄消耗凝血酶溶液的體積。按公式[注3]計算。

[注1]三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液的配制：取0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL，與0.1 mol/L鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調節pH值至7.4。

[注2]凝血酶溶液的配制：取凝血酶試劑適量，加生理鹽水配制成每1 mL含凝血酶10個(滴定寬體金線蛭)或40個(滴定菲牛蛭)單位的溶液。

[注3]水蛭抗凝活性計算公式如下：

U=C1V1/C2V2

U為每1 g樣品含抗凝血酶活性單位，U/g；C1為凝血酶溶液的濃度，μ/mL；C2為供試品溶液的濃度，g/mL；V1為消耗凝血酶溶液的體積，μL；V2為供試品溶液的加入量，μL；中和1個單位的凝血酶的量，為1個抗凝血酶活性單位(U)。

3 結果與討論

本實驗對菲牛蛭樣品在滴定過程中均進行了進樣量分別為5 μL、4 μL、3 μL、2 μL的嘗試，兩種滴定法對水蛭抗凝活性檢測結果詳見下表1。

表1 兩種滴定法檢測抗凝活性結果

3.1 菲牛蛭標準滴定法實驗分析 從兩個菲牛蛭凍干粉樣品的滴定結果來看，在同一人的操作前提下，藥典標準滴定法的結果重復性較好。本實驗除樣品2單次進樣量為5 μL只做了2次平行外，2個凍干粉樣品其余單次進樣量均做了6次平行，且每種進樣量的平行結果相同，說明同一人操作時，每次實驗其對于反應終點判斷標準基本趨同。且本實驗法待測樣品反應時的結果呈現比較典型穩定，因此每個樣品相同進樣量的不同次實驗其結果均一致，但縱向比較同一樣品不同進樣量的檢測結果又發現，樣品最終抗凝活性結果差異很大，樣品1的最大最小值差可達約96個活性單位；樣品2則達到約120個活性單位。筆者認為，菲牛蛭這個品種的抗凝血活性本身很高，根據中國藥典的規定，不吸血的寬體金線蛭(螞蟥)和尖細金線蛭(柳葉螞蟥)的抗凝活性不得低于3 U/g，日本醫蛭(水蛭)不得低于16 U/g，而現行云南標準對與菲牛蛭藥材活性要求則是不低于60 U/g，對于菲牛蛭凍干粉則不低于200 U/g。新規征求意見稿更是將標準提高到不低于240 U/g，并將 700 U/g 作為活性上限。為在較短時間內盡快得出結果，在實驗中用來滴定反應的凝血酶溶液濃度較高，且制備供試液時樣品提取液較為稀釋。以云南現行標準單次進樣量為5 μL為例，每滴定1次，即需要中和120U的凝血酶，這個數值的浮動空間是很大的。本實驗在5 μL滴定2次，即中和掉240 U的凝血酶溶液后，尚未達到終點，滴定3次后才出現凝固，說明樣品待測液活性在240～360 U/g之間，同理，在進樣量為4 μL、3 μL、2 μL時，樣品1的活性結果誤差區間分別在約288～384 U/g、216～288 U/g、240～288 U/g。隨著單次進樣量的減少，結果浮動范圍越小，結果相對穩定，但滴定次數和實驗時間會相應延長，根據之前的研究結論來看，又會對實驗結果產生一定影響，這或許解釋了本實驗中樣品1在單次進樣量為4 μL時，滴定3次并未出現凝固，而進樣量為3 μL、2 μL時，隨著反應時間延長，終點也發生變化的現象。同理樣品2在進樣量為 4 μL 和3 μL與2 μL時的終點差異也是因反應時間的延長而產生的影響。

3.2 菲牛蛭白瓷板滴定法實驗分析 從本實驗的結果來看，每個進樣的平行實驗中，均有判定終點到來時滴定次數不一致，即消耗凝血酶單位數量不相同的情況發生，且單次進樣量越多，平行結果的標準差越大，實驗結果越不穩定。同時橫向對比藥典標準中滴定法來看，單次進樣量越多，兩種方法的滴定結果差異越大。

分析其差異原因，筆者認為，藥典標準方法是在試管中進行反應，液面表面積較小，滴定動作后通過振搖的方式能迅速且均勻地將濃度較大的凝血酶溶液稀釋分散到供試液中，客觀因素也提升了本法在平行檢測過程中的穩定重現性；而白瓷板本身較淺，供試液在白瓷板中表面積較大，滴定后又需要較尖細的攪拌針來輔助分散，從單人操作的層面就已經增加了難度。用細針分散混勻的效率本不及振搖，且筆者在實驗操作中發現，濃度較高的凝血酶溶液在滴入白瓷板供試液時，會出現供試液于凝血酶注入區域迅速產生結塊或絲狀物，從而導致實驗終點因“假陽性”現象而提前出現，而根本原因可能僅僅是攪拌不夠及時與均勻，或滴定瞬時局部濃度太高未來得及分散形成的凝結。而兩個菲牛蛭樣品白瓷板實驗數值隨著單次進樣量的減少，其標準差也隨之減小，平行結果趨于穩定的結果也同樣可用上述分析進行解釋。

另一方面，纖維蛋白原結構也有其特殊性，在藥典滴定方法中，若對供試液進行劇烈搖晃，則可能會破壞其原有內部結構，提前出現液體渾濁或不再隨著凝血酶溶液的添加而凝固，因此不論是纖維蛋白原溶液在配制過程中，還是與凝血酶溶液解除后的振搖混勻，都要求實驗人員要動作緩慢，幅度小，力道輕，以避免實驗結果失真。而白瓷板滴定法則需要工具介入到反應液內進行攪拌，這個過程是否會對供試液原有結構進行破壞，進而導致實驗結果不穩定或不準確，也有待進一步驗證。

3.3 寬體金線蛭兩種滴定方法的實驗結果對比 通過實驗結果不難看出，兩種滴定方法對于抗凝活性較低的寬體金線蛭幾乎沒有影響，分析原因如下。

首先，寬體金線蛭的供試液濃度高。通過前文，寬體金線蛭和菲牛蛭供試液提取條件可看出，寬體金線蛭的取樣量為1 g，是菲牛蛭的4倍；提取溶劑添加量為5 mL，為菲牛蛭的1/3，供試液的濃度已相差12倍。此外，滴定時藥典規定寬體金線蛭對供試液滴加的凝血酶溶液濃度為10 U/mL，是菲牛蛭的1/4，且單次規定進樣量為2 μL，是菲牛蛭現行標準的2/5，在反應環節每滴定一次中和凝血酶的量又與菲牛蛭相差10倍，綜合整個實驗流程，兩個品種的實驗濃度相差120倍。供試液與凝血酶溶液的濃度反差也使兩種方法下的實驗結果產生不穩定性的概率增加，因此相比之下，寬體金線蛭的藥典標準滴定法和白瓷板滴定法結果均較穩定且一致。

3.4 白瓷板滴定法的發展 一般說到中藥水蛭白瓷板滴定法，大多會追溯到萬明等[7]2012年發表的文獻，其本身是為比較幾種對中藥水蛭不同提取方式對其抗凝活性的影響，并輔以APTT(活化部分凝血活酶時間)試劑盒法進行驗證；2014年劉義梅等[8]將白瓷板法與藥典操作進行對比，還進一步考察可能影響檢測結果的因素，如滴定間隔時間、凝血酶濃度等，完善了滴定體系。以上研究成果為白瓷板法運用到水蛭抗凝活性效價的檢測奠定了基礎，但文獻均是以供試液凝固的時長作為比較指標，并未體現出藥典法對抗凝活性單位的直接判斷，且供試液制備過程時間長、步驟多，并不能較快速地對一批樣品進行處理并得出結果。2017年張利等[9-10]學者的研究將藥典中供試液的制備方法和抗凝活性評價指標引入白瓷板法，并通過對影響因素的考察較為直觀地便顯出兩種滴定方法在檢測結果上的差異，提出操作改進建議。2022年云南省“征求意見稿”也將藥典凝血酶滴定法改為白瓷板法，并通過調整凝血酶溶液進樣量、限定實驗反應時間等方式力求檢測結果的準確性。

3.5 關于水蛭抗凝活性檢測的建議 本實驗對同一樣品的兩種滴定方法進行了較多重復次數的實驗，從結果看，針對抗凝活性較高且實驗中凝血酶溶液濃度較大的菲牛蛭來說，白瓷板滴定法的穩定性相比于藥典標準中滴定法較低。

一些研究認為原藥典方法的反應終點難以判斷，筆者經過較多次實驗對比發現，造成這個問題的原因主要在于實驗反應的載體和操作中的一些細節。原法在試管中進行反應，而試管也有材質之分。筆者通過實驗觀察到，塑料材質試管，因試管壁較厚，且內徑較窄，供試液在管內張力較大，會影響對其流動性的判斷，再加之所料材質的透明度較差，會綜合影響筆者從試管壁外觀察供試液是否有凝固的效果。相較于塑料材質，管壁較薄且透明度好的玻璃試管觀察效果更佳，但同樣因為內徑較細，從直立到傾斜判斷其流動性的觀察過程也會受到張力的影響而失真。

研究認為，將反應容器替換成平底的2 mL左右大小的玻璃液相進樣瓶為宜。相較于圓底的試管，在液相進樣瓶中反應會增加液體在底部的平展空間，一定程度還原了供試液的流動性，同時在滴入凝血酶溶液并搖勻后，建議將反應容器呈一定角度傾斜放置，下次滴定前先將容器直立判斷是否有凝固，這樣凝固初期的一些“掛壁”現象或供試液流動性顯著降低的狀態就會相對敏銳地被實驗人員捕捉到，也一定程度簡化了判斷標準，提高了實驗準確性與效率。

3.6 小結 綜合以上實驗結果和分析，筆者認為當凝血酶溶液濃度較高時，白瓷板滴定法會因滴入凝血酶溶液瞬間使供試液局部濃度過高而導致“假陽性”凝固出現而影響檢測結果，故建議在檢測吸血品種菲牛蛭和日本醫蛭時，仍保留現行藥典標準滴定法為主要測定方法，并結合前文操作改進方法，提升結果準確度與穩定性。若采取白瓷板法，則減少單次進樣量或降低凝血酶溶液濃度，且通過多次平行實驗得到相對穩定的結果。而不吸血的寬體金線蛭和尖細金線蛭本身抗凝活性較低，且滴定溶液凝血酶含量較低，故兩種方法均適用。為提升檢測結果準確度，也可通過同一份樣品的兩種滴定方法互為驗證。