姜黃素衍生碳點緩解甘薯鎘毒害的作用機制

高佳 潘志遠 夏楠 李宗蕓 孫健 李艷娟

高 佳，潘志遠，夏 楠，等. 姜黃素衍生碳點緩解甘薯鎘毒害的作用機制［J］. 江蘇農業科學，2024，52（7）：65-71.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.009

（江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州 221116）

摘要：為研究碳點緩解植物鎘脅迫的作用機制，為植物非生物脅迫下外源施用生物質碳點提供科學依據，以生物質姜黃素為碳源，通過簡單的一步水熱法制備水溶性碳點（CDs）。以甘薯為植物模型，設置如下4個試驗處理：霍格蘭營養液（CK）；含0.7 mg/mL CDs的霍格蘭營養液（CDs）；含100 μmol/L CdCl2的霍格蘭營養液（Cd）；同時含有 0.7 mg/mL CDs、100 μmol/L CdCl2的霍格蘭營養液（Cd+CDs），研究不同處理對甘薯葉片光合特性、根系抗氧化系統及NO積累量、鎘離子吸收情況的影響。結果表明，合成的CDs平均尺寸為2.29 nm，表面富含酚羥基、甲氧基，保留了姜黃素的藥理學特性；與受到鎘脅迫的甘薯幼苗相比，添加CDs后，受到鎘脅迫的甘薯幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量分別增加了55.0%、41.3%、51.6%，凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率分別提高了168.9%、33.8%、295%，胞間二氧化碳濃度顯著降低了41.9%，MDA、脯氨酸含量、硝酸還原酶活性、NO積累水平顯著降低，根尖鎘離子內流顯著減少。綜上所述，CDs通過降低鎘脅迫下甘薯幼苗體內的硝酸還原酶活性來減少甘薯體內鎘誘導的NO積累，從而減少鎘離子內流，緩解甘薯幼苗受到的鎘脅迫，提高甘薯葉綠素含量和光合速率。

關鍵詞：鎘脅迫；甘薯；碳點；光合作用；一氧化氮

中圖分類號：S181；S531.01? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0065-06

隨著經濟的快速發展，各種工業用水被大量排放在環境中，造成環境重金屬污染日益嚴重，其中鎘污染最為突出。鎘是植物非必需的礦質元素，但是由于其具有溶解性高、遷移性強等特點，使其在土壤中極易被植物吸收并通過作物的富集進入食物鏈，威脅人類健康［1-2］。有研究發現，即便是低劑量的鎘也會對植物造成較強的毒性，植物遭受鎘毒害后，常常會表現出葉片失綠發黃卷曲、根系生長受到抑制、光合速率降低、根系對礦質元素和水分的吸收受到抑制等癥狀，使得作物產量和品質降低［3］。甘薯屬于旋花科植物，在我國有數百年的種植歷史，是我國主要的糧食作物之一，具有豐富的營養價值，深受人們的喜愛［4］。然而，甘薯塊根對鎘具有一定的吸收和積累能力，使得甘薯的生長發育受到抑制。重要的是，人們食用過量積累鎘元素的甘薯后有一定的健康風險。因此，通過研究鎘脅迫下甘薯幼苗的生理及分子機制，從而提高甘薯對鎘的耐受性，對實際生產具有重要的指導意義。

近年來，納米技術得到快速發展，納米材料由于自身優越的物理、化學、光學和生物學特性，使其在不同領域都具有重要的研究價值，因此眾多研究者認為納米材料是21世紀最具有應用前景的材料。碳點（CDs）是一種新型的納米材料，其直徑小于 10 nm，具有良好的生物相容性、低毒性、較好的水溶性和較大的比表面積等優點，被廣泛應用于生物醫學、農業生產和植物保護等領域［5］。生物質作為合成生物質CDs的原材料，與其他碳源相比具有眾多優勢，如價格低廉、來源廣泛、綠色環保等。近年來，各種各樣的生物質被用來制備CDs，并被廣泛應用在農業生產中，以促進農業高效安全和可持續發展［6-7］。例如，Li等合成了丹參衍生CDs以顯著緩解甘薯鹽脅迫、低鉀脅迫和低鐵脅迫［8］。Lei所在課題組以黃柏粉為碳源制備出雙發射CDs，顯著提高了植物的光合作用及農作物產量［9］。由此可見，將納米技術與生物技術交叉融合進行研究，能夠有效解決農業上的難題，促進農業的可持續發展。

姜黃素來源于姜黃屬植物的根狀莖，是一種天然的多酚類化合物，其安全性較高，是食品中使用的9種天然色素之一。有研究發現，姜黃素具有眾多藥理活性，如抗氧化、抗炎和抗菌等，因此姜黃素被廣泛應用在生物學領域［10］。然而，由于姜黃素水溶性極低、結構不穩定性，并且對光、熱和pH值較為敏感，使其在生物中的應用受到嚴重限制。近年來，納米技術為姜黃素在生物中的遞送提供了新途徑，如利用納米材料作為載體將姜黃素遞送到生物體內以提高其生物利用度，或將姜黃素制成納米制劑以提升其穩定性［11-13］。然而，上述方法雖然提高了姜黃素的水溶性和生物利用度，但是仍然存在工藝復雜、載藥量較低等問題。本研究以姜黃素為碳源，利用簡單的水熱法一步合成小尺寸的水溶性CDs，其表面含有豐富的酚羥基和甲氧基等功能官能團，因此制備的CDs不但具有良好的水溶性，而且保留了姜黃素的生物學屬性。進一步通過水培法探究制備的CDs對鎘脅迫下甘薯幼苗生理生長的影響及其作用機制，以期為CDs在農業上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

本研究于2023年在江蘇師范大學生命科學學院甘薯性狀改良關鍵理論與技術實驗室進行。供試植物材料為徐紫薯8號，由江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所提供。

1.1 碳點的制備

通過一步水熱法制備CDs，首先稱取300 mg姜黃素粉末溶于30 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為12）中，攪拌均勻后倒入高壓反應釜內，180 ℃反應8 h，反應結束后冷卻到室溫，所得溶液即為CDs溶液。為了除去CDs溶液中的雜質，混合溶液用022 μm過濾膜除去大分子雜質，隨后將過濾液用1 000 u的透析袋透析8 h以除去未反應的小分子物質。將獲得的CDs溶液保存在4 ℃冰箱中備用。

1.2 碳點的表征

CDs形態特征的表征采用透射電鏡（TEM）和高分辨透射電鏡（HRTEM），化學組成和表面官能團分析分別用射線光電子能譜儀（XPS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分光光度計。

1.3 植物材料的培養與處理

剪取15 cm形態良好、莖部粗細一致、無病害的甘薯莖蔓，[JP2]用清水沖洗干凈后插入1/2霍格蘭營養液中進行水培生根培養，于晝—夜溫度25 ℃—20 ℃、[JP]光—暗周期16 h—8 h、光照度300 μmol/（m2·s）的溫室中培養1周后，挑選大小一致的甘薯幼苗，分別置于霍格蘭營養液（CK）、含0.7 mg/mL CDs的霍格蘭營養液（CDs）、含100 μmol/L CdCl2的霍格蘭營養液（Cd）及同時含有0.7 mg/mL CDs和 100 μmol/L CdCl2的霍格蘭營養液（Cd+CDs）中進行培養。每個處理設置6次重復，添加通氣泵，每 5 d 置換1次處理液，培養15 d后收獲，并測定相應生理指標。

]1.4 光合色素含量的測定

在每組處理中分別取相同部位的成熟葉片測定光合色素含量，去除葉片兩端及葉脈后，稱取 0.2 g 甘薯葉片放入含有15 mL無水乙醇的離心管中，分散均勻后置于黑暗環境中。24 h后取200 μL上述浸提液加入96孔酶標板中，以乙醇作為空白對照，用酶標儀分別測量提取液在649、665 nm 2個波長下的吸光度，相關公式如下：

Ca=13.95D665 nm-6.88D649nm；（1）

Cb=24.96D649 nm-7.32D665 nm；（2）

CT=Ca+Cb；（3）

色素含量（μg/mL）=（CVN）/（W/1 000）。（4）

式中：C為光合色素濃度，μg/mL；V為提取液總體積，mL；N為稀釋的倍數；W為樣品鮮重，g。

1.5 光合指標的測定

利用美國Li-cor公司生產的Li-6400便攜式光合儀測定不同處理下甘薯幼苗的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度，測定時間統一為09：00—10：00，分別選取植株第3、4張葉片進行測定，參比室CO2濃度為400 μmol/mol，光子通量為1 000 μmol/（m2·s），平均10 s記錄1個讀數，共記錄2 min后，計算平均數后記錄。

1.6 MDA含量的測定

取植物根系，用流水沖洗干凈后擦干，并將其剪碎，稱取0.2 g樣品，放入提前預冷的研缽中，向研缽中加入1.8 mL含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH值為7.8），充分研磨成勻漿，倒入離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心 10 min。取上清液，用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行MDA含量的測定。

1.7 脯氨酸含量的測定

取植物根系，用流水沖洗干凈后擦干，稱取 0.2 g 樣品，加入2 mL含1% PVP的磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH值為7.8），剪碎植物根系并將其研磨成勻漿，制備成10%的勻漿液，3 500 r/min 離心10 min。取上清液，用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。

1.8 硝酸還原酶活性的測定

硝酸還原酶活性的測定采用磺胺比色法，取植物根系用流水沖洗干凈后擦干，按照組織質量 ∶提取液體積=1 g ∶10 mL的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行組配，在冰浴中研磨成勻漿，8 000 r/min、4 ℃離心10 min。取上清液，用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定［14］。

1.9 根細胞NO含量的測定

用具有NO特異性的熒光染料（DAF FM diacetate）監測根細胞中NO的積累水平［15］。取4種不同處理24 h后的甘薯根尖（3 cm左右），置于含有20 μmol/L熒光染料（DAF FM diacetate）的二甲基亞砜（DMSO）溶液中孵育。2 h后用蒸餾水反復沖洗根尖組織，隨后用Leica DM5000 B熒光顯微鏡觀察根細胞中NO的積累量。

1.10 根尖Cd2+離子流的測定

利用非損傷微測系統（NMT-100-SIM-YG）測定不同處理下徐紫薯8號根細胞Cd2+離子流的變化。試驗步驟如下：分別采集不同處理下甘薯幼苗的根尖（3 cm），用測試液沖洗后，在測試液中平衡10 min，然后將根尖置于塑料培養皿中，用雙層濾紙、樹脂塊固定，進行Cd2+離子流的測試。測試位點分別為根尖分生區（距尖端0～1.0 mm）、根尖伸長區（距尖端1.5～2.0 mm）和成熟區（距尖端 10～12 mm），每個點進行5 min連續測量記錄。

1.11 數據處理

所有數據使用Excel進行整理，用SPSS Statistics 20.0軟件對數據進行單因素方差分析，采用的方法為最小顯著性差異法（LSD），用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 CDs的表征

本試驗以姜黃素作為原材料，通過一步水熱法合成水溶性CDs。由高分辨透射電鏡（HRTEM）結果（圖1-a）可知，合成的CDs具有較好的單分散性，呈球形顆粒，尺寸均勻。由圖1-b可知，合成的CDs具有明顯可分辨的晶格條紋，間距為0.21 nm，說明合成的CDs具有石墨烯的（010）衍射面。通過測量150個納米顆粒的直徑可知，合成的CDs粒徑范圍在1.2～3.6 nm之間，平均粒徑約為2.29 nm（圖1-c）。

為了確定CDs的化學成分和表面官能團，進行如下表征分析：由傅里葉變換紅外光譜（FTIR）（圖1-d）可知，合成的CDs在3 050～3 700 cm-1寬吸收峰屬于酚羥基（—OH）的拉伸振動，2 959、2 462 cm-1 處的特征峰分別屬于甲氧基（—OCH3）中C—H的不對稱振動峰、C—C健的伸縮振動，1 462 cm-1 處的吸收峰屬于C[FY=，1]O雙鍵或C[FY=，1]C雙鍵的振動，1 000～1 300 cm-1處的吸收峰屬于CDs的C—O—C的伸縮振動［16-17］。FTIR結果表明，合成的CDs表面保留了姜黃素中的酚羥基和甲氧基。眾多研究發現，酚羥基、甲氧基是姜黃素發揮多種生物活性和藥理作用的活性位點，因此推測，合成的CDs保留了姜黃素的藥理作用和生物學特性，具有較強的抗氧化能力［18］。XPS能譜圖結果表明，CDs中主要含有C、O這2種元素（圖1-e）。

2.2 CDs對鎘脅迫下甘薯葉綠素含量的影響

光合色素是植物進行光合作用的基礎，重金屬Cd可以通過抑制葉綠素的合成來降低植物的光合作用［19］。為了探究合成的CDs對鎘脅迫下甘薯葉片光合色素的影響，本研究測定了不同處理下甘薯葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量。由圖2可見，與CK相比，單獨的CDs處理能夠提高甘薯幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量，但是影響不顯著。鎘脅迫能夠顯著抑制甘薯葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的生成。與單獨鎘脅迫的甘薯幼苗相比，添加CDs后，鎘脅迫下甘薯幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量顯著提高，分別增加了55.0%、41.3%、51.6%。上述結果表明，CDs能夠緩解鎘毒害，促進植物對光合色素的合成。

2.3 CDs對甘薯光合作用的影響

光合作用是植物生命活動的基礎，受到鎘脅迫后，植物的光合作用會受到顯著抑制。由圖3可知，與CK相比，CDs處理下甘薯幼苗的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率和胞間二氧化碳濃度的變化沒有顯著差異，鎘脅迫會顯著降低甘薯幼苗的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，而胞間二氧化碳濃度略微升高，表明鎘對甘薯幼苗光合作用的抑制并不是受到氣孔因素的影響。與鎘脅迫下的甘薯幼苗相比，添加CDs處理后，甘薯幼苗的鎘毒害作用得到了顯著緩解，其中凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率分別顯著提高了168.9%、 33.8%、29.5%， 胞間二氧化碳濃度顯著降低了41.9%。表明CDs能夠顯著緩解鎘毒害，提高植物的光合作用速率。

2.4 CDs對甘薯幼苗體內MDA含量和脯氨酸含量的影響

鎘脅迫會誘導植物體內產生大量活性氧，從而導致細胞膜脂受損，使得植物體內MDA含量升高，因此MDA含量的高低可以用來評價過氧化傷害的強弱。由圖4-a可見，與CK相比，鎘脅迫顯著增加了甘薯幼苗體內MDA的含量，表明鎘脅迫后植物受到嚴重的氧化損傷。然而與單獨鎘脅迫處理的甘薯幼苗相比，添加CDs后，受到鎘脅迫的甘薯幼苗根中MDA含量降低，表明CDs處理降低了甘薯幼苗的膜脂過氧化程度。脯氨酸是植物體內的一種游離氨基酸，當植物受到脅迫時，通過增加脯氨酸含量來調節細胞滲透壓以維持細胞膜結構的穩定性。因此，植物體內脯氨酸的含量積累可能是植物適應外界環境的表現，也可能是植物細胞受損的表現［20］。由圖4可知，與CK相比，鎘脅迫能夠顯著增加甘薯幼苗體內脯氨酸含量，說明鎘脅迫使得甘薯細胞嚴重受損，而添加CDs后，受到鎘脅迫的甘薯幼苗體內脯氨酸含量顯著降低。表明CDs能夠顯著降低鎘脅迫對甘薯幼苗造成的氧化損傷。

2.5 CDs對甘薯根尖離子流的影響

NO作為信號分子廣泛參與植物生長發育及逆境脅迫應答，植物體內NO含量受體內合成和清除的影響。大量研究表明NO可以從多方面調控植物的鎘脅迫應答。硝酸還原酶是植物體內NO形成的主要酶，為了探究CDs緩解甘薯鎘毒害的作用機制，本研究進一步測定甘薯幼苗中硝酸還原酶含量。由圖5可見，與CK相比，在鎘脅迫下，甘薯幼苗體內的硝酸還原酶活性顯著提高，而添加CDs處理后，會顯著降低甘薯體內鎘脅迫誘導的硝酸還原酶活性。利用NO特異性熒光探針（DAF FM diacetate）監測NO在甘薯根細胞內的分布情況。由圖5-b可知，鎘處理的甘薯幼苗根中熒光信號較強，表明鎘脅迫誘導甘薯根中積累大量NO，而添加CDs后甘薯根的熒光信號顯著降低。由于鎘脅迫下植物體內NO含量上升，誘導根系[WTBX][STBX]IRT1[WTBZ][STBZ]基因上調表達，促進根系吸收鎘離子。因此，猜測CDs處理后，甘薯幼苗的鎘離子內流減少。進一步利用非損傷微測技術技術測定甘薯根系鎘離子的吸收情況。由圖5-b可見，鎘處理后，甘薯幼苗根系分生區、伸長區和成熟區Cd2+流顯著內流，而Cd+CDs處理組甘薯幼苗根系的Cd2+流內流顯著降低。上述結果表明，合成的CDs通過抑制硝酸還原酶的形成，減少甘薯幼苗體內NO的積累，從而減少鎘離子內流，減少鎘毒害。

3 結論

本研究以姜黃素作為碳源，通過一步水熱法合成CDs，通過CDs表征發現，合成的CDs表面含有豐富的酚羥基、甲氧基，表明制備的CDs不但具有較好的水溶性，而且保留了姜黃素的生物學活性。進一步以甘薯作為植物模型，探究合成的CDs對鎘脅迫下植物的生理響應。結果表明，CDs顯著提高了甘薯幼苗的鎘耐受性。與鎘脅迫的甘薯幼苗相比，添加CDs后鎘脅迫的甘薯幼苗葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量分別增加了55.0%、41.3%、516%，凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率分別提高了168.9%、33.8%、29.5%，胞間二氧化碳濃度顯著降低了41.9%，MDA和脯氨酸含量顯著降低。探究其作用機制發現，CDs主要通過抑制硝酸還原酶的活性來減少植物體內鎘脅迫誘導的NO積累量，從而緩解鎘毒害。本研究為植物生理學和納米材料學科的交叉研究，可為提高植物耐鎘性提供新的思路，有望在農業生產中推廣應用。

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基金項目：江蘇省高等學校自然科學研究面上項目（編號：21KJB210005）；江蘇省研究生科研與實踐創新計劃（編號：KYCX22_2795）。

作者簡介：高 佳（1998—），女，江蘇宜興人，碩士研究生，主要從事納米材料對植物生理生化影響方面的研究。E-mail：1162939456@qq.com。

通信作者：李艷娟，博士，講師，主要從事納米材料對植物生理生化影響方面的研究。E-mail：liyj@jsnu.edu.cn。