基于經(jīng)筋理論探討針刀髕周松解法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響*

連曉文 曾維銓 陳廷輝 莊雅馨 郭澤興 劉 晶 黃丙勇

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種漸進(jìn)性的退行性疾病,隨著疾病進(jìn)展常常累及軟骨、軟骨下骨及周圍滑膜的病變[1],臨床主要表現(xiàn)包括膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)不利,甚者出現(xiàn)活動(dòng)功能障礙。最新流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,預(yù)計(jì)到2050年,全球的KOA人數(shù)將比2020年增加74.9%[2]。因此,積極探尋能夠改善膝關(guān)節(jié)功能、延緩疾病進(jìn)展且作用機(jī)制明確的干預(yù)手段具有重要意義。中醫(yī)提出“膝者,筋之府”“筋骨同源”的經(jīng)筋理論,“從筋施治”,松解膝關(guān)節(jié)“筋”與“骨”結(jié)合部的“筋結(jié)”可作為治療KOA的切入點(diǎn)[3]。針刀治療可以通過松解膝關(guān)節(jié)周圍的高張力點(diǎn),進(jìn)而緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能[4],近年來被多個(gè)臨床指南推薦[5,6]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究應(yīng)用針刀髕周松解法治療早期膝骨性關(guān)節(jié)炎取得了較好療效[7]。本研究通過觀察針刀髕周松解法對(duì)KOA兔膝關(guān)節(jié)行為學(xué)、軟骨形態(tài)學(xué)及軟骨細(xì)胞凋亡率的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6個(gè)月齡健康雄性新西蘭兔18只,體質(zhì)量2.0～2.25 kg,由杭州富陽紅鳳養(yǎng)兔場提供[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2020-0004)],委托福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào):SYXK(閩)2020-0003]訂購、喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室自然光照,保持溫度22～25 ℃、濕度35%～65%。單籠喂養(yǎng)、自由進(jìn)水、攝食。此實(shí)驗(yàn)已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件文號(hào):FJTCMIACUC2022202)并全程遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑HE染色試劑盒、番紅O固綠染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)、10%EDTA(天津聚恒達(dá)化工有限公司)、4%多聚甲醛(北京蘭捷科技有限公司)、0.9% NaCl 注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)、3%戊巴比妥鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器一次性0.4 mm×40 mm 無菌針刀(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司);高分子石膏(河北邦恩斯醫(yī)療器械有限公司);手術(shù)刀片及相關(guān)器械(蘇州市開元醫(yī)療器械有限公司);一次性包埋模具(海門市寧創(chuàng)實(shí)驗(yàn)器材有限公司);脫水機(jī)、包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);石蠟切片機(jī)(LEICA);正置光學(xué)顯微鏡(MSHOT)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與造模適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)兔分為空白組、模型組和針刀組,每組6只。模型組和針刀組均使用改良的Videman法造模[8],使實(shí)驗(yàn)兔的左后肢保持伸膝 0°位,并在其髕骨前方放置石膏托,然后用高分子石膏單層纏繞左后肢,將踝關(guān)節(jié)固定至背屈 60°位,最后在最外層纏繞防咬繃帶。實(shí)驗(yàn)兔連續(xù)固定6周,拆除石膏后,應(yīng)用Lequesne MG法進(jìn)行評(píng)價(jià),以總分≥4分作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[9]?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)6周,無干預(yù)。造模實(shí)驗(yàn)期間各組兔飲水、進(jìn)食量基本一致,體質(zhì)量無明顯差異,精神良好,無死亡。

1.4.2 干預(yù)方法造模成功后對(duì)針刀組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行針刀干預(yù),參考《中國經(jīng)筋學(xué)》[10]選取股內(nèi)側(cè)肌、股外側(cè)肌、髕內(nèi)側(cè)支持帶、髕外側(cè)支持帶、髕韌帶在髕骨上的附著點(diǎn)以及鵝足腱脛骨內(nèi)髁附著點(diǎn)。常規(guī)消毒后,使用一次性無菌針刀于治療點(diǎn)進(jìn)行針刀松解治療,結(jié)束后無菌棉球按壓。每隔7 d干預(yù)1次,共4次。其余2組常規(guī)飼養(yǎng)4周,無干預(yù)。

1.4.3 取材干預(yù)結(jié)束后1周,使用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,耳緣靜脈空氣栓塞處死。將兔放于冰上,迅速解剖左膝關(guān)節(jié),觀察并記錄軟骨、滑膜表面的大體變化。隨后切取股骨髁軟骨組織投入4%多聚甲醛中固定。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法①行為學(xué)觀察:干預(yù)結(jié)束后1周對(duì)3組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行Lequesne MG行為學(xué)評(píng)分[11],包括局部疼痛反應(yīng)、步態(tài)改變、患肢關(guān)節(jié)活動(dòng)度和腫脹情況4個(gè)維度評(píng)價(jià)。總分為0～11分,得分越高,表明關(guān)節(jié)功能障礙程度越重。②蘇木精-伊紅(HE)染色:股骨髁軟骨組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后行脫鈣處理。再進(jìn)行脫水、石蠟包埋并制備切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水。蘇木精染色,流水沖洗;1%鹽酸乙醇分色,流水沖洗;PBS返藍(lán),流水沖洗;伊紅染色,封片,鏡下觀察。③番紅O固綠染色:切片經(jīng)脫蠟至水后,用鐵蘇木素染色液3～5 min;再以1%鹽酸酒精分化;而后加入固綠染色液5 min,經(jīng)1%乙酸酸化后,再加入番紅染色液5 min。最后脫水透明,封片,鏡下觀察。④ TUNEL染色觀察:取各組實(shí)驗(yàn)兔石蠟組織標(biāo)本切片,脫蠟、脫水后,應(yīng)用蛋白酶K、TdT酶、Streptavidin-HRP反應(yīng),DAB顯色;蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片。鏡下觀察,棕黃色細(xì)胞為陽性。在軟骨層隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用FIJI細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算凋亡率,計(jì)算公式:凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/軟骨細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 Lequesne評(píng)分與空白組相比,模型組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,針刀組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)Lequesne評(píng)分比較 (分,

2.2 關(guān)節(jié)軟骨 滑膜與空白組相比,模型組關(guān)節(jié)面較粗糙,部分不完整,軟骨面無光澤,髕前滑膜增厚,色澤發(fā)黃;與模型組相比,針刀組關(guān)節(jié)面較為光滑、軟骨面光澤感增加,病變情況得以改善。

2.3 HE染色空白組軟骨面平滑,厚度正常,軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、排列有序;模型組軟骨面不平整,存在部分缺損,軟骨厚度變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,排列松散,可見空泡細(xì)胞;針刀組軟骨面比模型組平滑、厚度增加,細(xì)胞數(shù)量增加,排列較為有序。見圖1。

注:①軟骨面平滑;②正常軟骨細(xì)胞;③潮線;④軟骨面存在缺損;⑤空泡細(xì)胞;⑥軟骨面恢復(fù)平滑。圖1 軟骨組織HE染色圖

2.4 番紅O固綠染色空白組軟骨面平整,軟骨和軟骨下骨厚度正常,軟骨細(xì)胞排列規(guī)整;模型組軟骨面存在缺損,軟骨層厚度變薄,軟骨下骨增厚,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,排列紊亂;針刀組軟骨面比模型組平整、軟骨厚度增加、軟骨細(xì)胞數(shù)量增多、排列較為整齊。見圖2。

注:①軟骨面平整;②潮線;③軟骨面缺損;④軟骨面恢復(fù)平整。圖2 軟骨組織番紅O固綠染色圖

2.5 TUNEL染色與空白組相比,模型組可見較多的軟骨細(xì)胞凋亡(P<0.05);與模型組相比,針刀組的軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見圖3,表2。

注:箭頭所示為凋亡的軟骨細(xì)胞。圖3 軟骨組織TUNEL染色圖

表2 3組實(shí)驗(yàn)兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較 (只,

3 討論

2021—2030年是全球進(jìn)入健康老齡化的10年,骨關(guān)節(jié)炎往往與其他慢性疾病共存于老年患者身上,影響其生活質(zhì)量和整體功能。與其他類型的關(guān)節(jié)炎相比,KOA的患病率更高,世界衛(wèi)生組織指出這10年需要重點(diǎn)關(guān)注解決骨關(guān)節(jié)炎等嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和活動(dòng)功能的疾病[12]。因此,尋找高效易行的治療KOA方法十分重要。

針刀療法是通過針刀縱疏、橫撥KOA病變的軟組織,減輕局部異常高張力,進(jìn)而調(diào)整膝關(guān)節(jié)的應(yīng)力分布,改善局部組織代謝,從而達(dá)到緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動(dòng)的效果[4]。近年來,隨著針刀療法在臨床上的不斷應(yīng)用和驗(yàn)證,已被多個(gè)臨床指南推薦用于KOA治療[5,6]。

KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇,“筋傷”和“骨病”是其重要病機(jī),兩者相互影響,互為因果,在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。“筋”強(qiáng)方可束“骨”,“骨”堅(jiān)而“筋”有所附,兩者相互依存。KOA是隨著年齡增加而逐漸進(jìn)展的疾病,KOA早期、中期往往以“筋傷”表現(xiàn)為主,“筋”損傷之后多表現(xiàn)為局部疼痛、軟組織長度短縮、雙側(cè)軟組織牽拉力不同。在站立和行走的過程中,骨與骨之間的壓力不均,關(guān)節(jié)面出現(xiàn)應(yīng)力集中,促使“骨病”發(fā)生發(fā)展。“筋傷”和“骨病”兩者在疾病進(jìn)展方面互相促進(jìn),后期逐漸發(fā)展到“筋骨同病”的狀態(tài),出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)周圍大量骨贅形成、軟組織短縮、關(guān)節(jié)畸形的嚴(yán)重表現(xiàn)[13]。經(jīng)筋理論指導(dǎo)下的針刀療法,是醫(yī)者根據(jù)膝關(guān)節(jié)周圍的經(jīng)筋循行路徑,通過拇指尋按查找筋結(jié)點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行松解,近年來在KOA的臨床治療中廣泛應(yīng)用。研究表明,在各種經(jīng)筋針刺療法中,針刀療法在治療KOA中具有較佳優(yōu)勢(shì)[14]。

本研究運(yùn)用了改良Videman法建立了KOA兔模型,造模過程模擬了KOA的自然發(fā)病過程,避免了創(chuàng)傷造模方式帶來的炎性物質(zhì)釋放,可以較好地模擬臨床上針刀療法對(duì)KOA的治療效應(yīng)。股四頭肌作為下肢最強(qiáng)壯的肌肉,“一體四頭”形成伸膝裝置,其結(jié)構(gòu)功能與KOA的發(fā)病具有密不可分的聯(lián)系[15]。髕周軟組織作為股四頭肌肌腱的延伸部分,其軟組織的張力變化會(huì)同步影響髕股關(guān)節(jié)和脛股關(guān)節(jié)的應(yīng)力分布,影響KOA的發(fā)生發(fā)展。因此,本研究基于經(jīng)筋理論、依據(jù)《中國經(jīng)筋學(xué)》[10]中的治療位點(diǎn)和KOA筋結(jié)點(diǎn)的觸診規(guī)律,結(jié)合筆者團(tuán)隊(duì)前期臨床研究結(jié)果,圍繞髕骨周圍軟組織選取了股內(nèi)、外側(cè)肌,髕內(nèi)、外側(cè)支持帶,髕韌帶在髕骨上的附著點(diǎn)以及鵝足腱脛骨內(nèi)髁附著點(diǎn),作為本次針刀治療松解點(diǎn)開展治療,研究針刀療法的作用機(jī)制[16]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的惟一細(xì)胞類型,在生理?xiàng)l件下,它保持著增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡,從而維持著關(guān)節(jié)軟骨的正常生理狀態(tài)。當(dāng)KOA發(fā)生時(shí),異常機(jī)械應(yīng)力刺激打破了動(dòng)態(tài)平衡,促使軟骨細(xì)胞過度凋亡,進(jìn)而出現(xiàn)軟骨退化。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn),KOA軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于正常軟骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量與軟骨退化程度、KOA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組相比,模型組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評(píng)分顯著升高,軟骨面無光澤,關(guān)節(jié)面較粗糙,軟骨表層不平整,厚度變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,軟骨細(xì)胞凋亡率明顯提高。針刀組與模型組相比,Lequesne評(píng)分顯著降低,軟骨厚度增加,軟骨細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞凋亡率明顯降低,這表明基于經(jīng)筋理論針刀髕周筋結(jié)松解法能夠有效降低KOA軟骨細(xì)胞凋亡,為臨床針刀療法治療KOA提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。