丁酸鹽在炎癥性腸病中的免疫調節機制研究進展

崔馨月 石璠 鄭麗紅 王海強

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一組與腸道慢性炎癥相關的異質性疾病[1],常表現為腹痛、腹瀉、血便、體重減輕等,在過去的10年里在全球范圍內變得越來越普遍[2]。目前IBD的治療宗旨是誘導病情緩解,常用藥物包括皮質類固醇、免疫調節劑和生物制劑[3],然而這些藥物都有顯著的不良反應,因此需要確定新的IBD治療靶點,尋找安全有效的IBD治療方法[4]。IBD發病涉及腸道微生物群失調和腸道免疫功能紊,二者都有一個重要的共同信號因子:短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)。丁酸鹽是短鏈脂肪酸中研究最多的一種,為上皮細胞的主要燃料來源,能夠調節腸道穩態并保持上皮的完整性[4],具有顯著的抗炎功能,可以與免疫系統相互作用,調節腸道免疫細胞庫中幾乎所有類型的免疫細胞的發育和功能[5],調節免疫功能并且防止過度免疫反應發生[6]。已有研究證明丁酸鹽在實驗中治療結腸炎具有有益效果[7]。本文就丁酸鹽在調節免疫功能方面改善IBD作用機制的研究進展進行綜述,旨在為IBD的臨床治療提供新的選擇。

1 腸道丁酸鹽的來源和吸收

1.1 腸道丁酸鹽的來源和分布 丁酸鹽是微生物群產生的一種關鍵代謝物,由大腸腔內的非消化性碳水化合物如纖維素、菊粉和抗性淀粉分解產生[8]。消耗的膳食纖維的數量和類型以及丁酸鹽產生菌的存在決定丁酸鹽的產生。丁酸鹽產生菌大多屬于厚壁菌門中的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae),一些擬桿菌門成員也可能產生丁酸鹽[9],如臭桿菌屬Odoribacter 丁酸單胞菌屬Butyricimonas 卟啉單胞菌屬(Porphyromonas) 另枝菌屬(Alistipes)[10]。丁酸鹽占人體糞便中SCFAs總量的15%～23%,濃度為10～25 mmol/L,在大多數膳食纖維發酵發生的近端結腸中含量更高[9]。

1.2 腸道丁酸鹽的吸收和信號傳導 丁酸鹽是一種弱酸(pKa=4.8),主要在生理性結腸pH值(5.0～6.5)下以解離形式存在[11]。丁酸鹽通過擴散或主動轉運蛋白通過結腸細胞的細胞膜[12],這些轉運蛋白包括由SLC16A1基因編碼的H+耦聯的單羧酸鹽轉運蛋白-1(monocarboxylate transporter 1,MCT1),和由SLC5A8基因編碼的Na+耦聯的單羧酸鹽轉運蛋白-1(sodium-coupled monocarboxylate transporter 1,SMCT1)。MCT1是一種低親和力的轉運蛋白,在小腸中弱表達而在近端結腸中強表達,近端結腸丁酸鹽濃度更高,pH值更低[11]。SMCT1在遠端回腸和結腸表達,運輸包括乳酸鹽和丙酮酸鹽等各種單羧酸鹽。SMCT1對丁酸鹽具有很高的親和力(50 μmol/L),在丁酸鹽濃度低的遠端結腸發揮作用[13]。

丁酸鹽通過3個G蛋白耦聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR)[GPR43、GPR41和GPR109A]發出信號[14],在消化道,GPR41和GPR43在腸內分泌細胞、上皮細胞和平滑肌細胞以及腸道神經元中表達。較低水平的GPR41和GPR43也存在于包括單核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞在內的免疫細胞中[15]。GPR43和GPR41被乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽激活。丁酸鹽與GPR41結合優先于與GPR43結合。GPR109A被丁酸鹽、β-羥基丁酸和高劑量的煙酸激活。3個GPCR都與Gi/o耦聯,因此在激活其他信號通路的同時抑制了cAMP(環磷酸腺苷)依賴性通路。結腸細胞和免疫細胞中這些受體的激活會導致細胞因子水平和各種信號通路的變化,促進抗炎反應[16]。

2 丁酸鹽調節免疫細胞

2.1 中性粒細胞 中性粒細胞遷移是炎癥的標志[17]。中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)會損害腸道屏障功能,誘發腸道損傷和血栓形成傾向[18]。丁酸鹽能顯著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的IBD患者中性粒細胞產生促炎細胞因子、趨化因子和鈣衛蛋白,減少髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的釋放和NETs的形成,并且抑制中性粒細胞遷移。丁酸鹽對IBD中性粒細胞的免疫調節作用涉及白細胞活化、調節先天免疫反應和對氧化應激的反應?？诜∷猁}能夠抑制如促炎性介質和NETs的形成等中性粒細胞相關的免疫反應從而改善葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulphate sodium,DSS)誘導的小鼠結腸炎的黏膜炎癥。丁酸鹽調節中性粒細胞的功能、限制促炎潛力,改善IBD的黏膜炎癥[17],這為丁酸鹽在治療IBD方面提供了新的治療途徑。

而中性粒細胞在誘導腸道炎癥中具有兩面性,中性粒細胞能維持黏膜平衡狀態、促進結腸炎組織修復,而過度積聚和促炎介質的釋放又會加劇結腸炎[17]。中性粒細胞耗盡的小鼠在受到三硝基苯磺酸(trinitro-benzene sulfonic acid,TNBS)損傷后腸道炎癥加重[19]。相反,中性粒細胞過度的募集和積累伴隨著延遲溶解導致持續的炎癥激活和黏膜損傷[20]。有研究證實丁酸鹽在炎癥誘導的上皮屏障功能喪失中具有有害作用[21]。中性粒細胞被急性募集到炎癥黏膜中有助于改善炎癥,而慢性浸潤則會加劇腸道黏膜炎癥。在腸道炎癥急性期丁酸鹽可作為輔助藥物以限制免疫細胞的進一步募集和激活,而在慢性期應用丁酸鹽可能會阻礙上皮細胞的增殖和修復。因此需要辯證的看待丁酸鹽的作用[17]。

2.2 巨噬細胞 在組織損傷過程中,介導促炎反應的M1巨噬細胞被募集并迅速適應為在組織修復過程中起作用的M2巨噬細胞[22]。丁酸鹽增加氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)水平和脂質代謝來調節巨噬細胞功能,從而促進巨噬細胞的替代激活[23],丁酸鹽可以直接作為代謝底物本身,通過G蛋白耦聯受體信號傳導或通過抑制組蛋白脫乙酰酶來塑造腸巨噬細胞的代謝特征,從而抑制炎性細胞因子的產生[12]。丁酸鹽有效抑制M1巨噬細胞極化和白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β等炎性細胞因子的分泌[24]。丁酸鹽增加CD206和精氨酸酶-1(arginase-1,Arg1)的表達(M2巨噬細胞相關基因)從而促進M2巨噬細胞極化。丁酸鹽還以巨噬細胞依賴的方式增加結腸隱窩中黏蛋白的產生,提高分泌黏蛋白的杯狀細胞的比例。巨噬細胞衍生的WNT蛋白能夠促進損傷后局部組織再生,丁酸鹽誘導M2巨噬細胞中WNT蛋白的產生,激活細胞外調節蛋白激酶(extracelluar signal-regulated kinase 1 and 2,ERK)1/2 依賴性杯狀細胞的生成和黏液屏障的恢復[25]。因此丁酸鹽促進受損組織中產生促愈合巨噬細胞可能是一種獨特且有潛力的治療炎癥或腸屏障損傷相關疾病的方法。

2.3 適應性免疫細胞 調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)和輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)的失衡可能導致IBD的發病[26]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)在脂質和葡萄糖代謝中起作用并介導抗炎活性,其能促進脂肪組織中Treg細胞的增殖和功能,介導Th17細胞轉化為Treg細胞[27]。Treg細胞以氧化磷酸化(OXPHOS)為主要能量來源,而Th17細胞以糖酵解和谷氨酰胺解來維持其增殖、分化和功能[28]。PPARγ表達減少影響線粒體生物能量學,如減少細胞的耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)和促進糖酵解。雷帕霉素復合體的機制靶點1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通過上調缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表達來增強糖酵解。HIF-1α直接激活維甲酸相關孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan receptor gamma t,RORγt)并增強Th17細胞分化,但通過結合叉頭狀轉錄因子P3(forkhead box protein P3,FOXP3)蛋白并靶向其降解來抑制Treg細胞分化[29]。當mTORC1活性被抑制時,HIF-1α表達下調,PPARγ表達上調,阻斷糖酵解,從而抑制Th17細胞分化并促進FOXP3+Treg細胞分化,從而減少炎性反應[30]。丁酸鹽能夠激活PPARγ促進T細胞代謝從糖酵解轉變為OXPHOS,從而促進Treg細胞分化并抑制Th17細胞的分化[31]。此外,研究發現丁酸鹽激活沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/mTOR調節Th17/Treg平衡,從而減輕DSS和艱難梭菌引起的結腸炎[32]。因此丁酸鹽可能以恢復代謝重編程,調節Treg/Th17平衡成為治療IBD的靶點。

3 丁酸鹽的免疫調節機制

3.1 丁酸鹽是組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑 組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)分為18種異構體和4組,是可以從組蛋白和非組蛋白中去除乙?；拿讣易?從而改變轉錄活性。HDAC與腸道炎癥之間存在顯著關聯[33]。丁酸鹽可以作為HDAC抑制劑發揮抗炎作用,用丁酸鹽處理原始T細胞可以增強FOXP3的乙?；?從而上調Treg細胞的分化[34]。HDAC泛抑制劑ITF2357可以下調原始T細胞中IL-6R并減少IL-6誘導的/信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化,直接抑制ROR-γT并減少IL-17和Th17的產生。因此,IL-6/STAT3/IL-17信號通路對于通過抑制HDAC實現抗炎作用很重要[35]。HDAC是調節IBD中Th17/Treg細胞分化的靶點。丁酸鹽以抑制HDAC1、阻斷IL-6/STAT3/IL-17通路和激活FOXP3來維持Th17/Treg平衡,從而發揮抗炎作用。因此丁酸鹽-HDAC1-T細胞軸是治療炎癥性腸病的潛在靶點。增殖和活化的Th17細胞會減少脂質氧化并快速增加糖酵解作為其能量來源[36]。c-Myc是一種細胞代謝調節因子,其維持T細胞中乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase ,LDHA)和谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)的水平,從而調節糖酵解程序以及谷氨酰胺攝取和分解代謝[37]。丁酸鹽抑制HDAC3降低T細胞中的下游c-Myc和c-Myc相關代謝酶(LDHA和GLS)的水平,從而抑制Th17細胞分化。丁酸鹽可以為治療炎癥性疾病中減少Th17細胞提供新的選擇[38]。此外,HDAC3對于巨噬細胞的活化很重要。用LPS刺激HDAC3缺陷型巨噬細胞后表現出炎性細胞因子表達水平降低。丁酸鹽預處理能夠增強組蛋白H3乙?；?減少巨噬細胞中炎性細胞因子的產生[39]。因此丁酸鹽可以通過作為HDAC抑制劑在IBD中發揮抗炎作用。

3.2 丁酸鹽下調免疫炎癥相關轉錄因子NF-κB、阻止其核轉位 核因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)是炎癥的主要調節因子,以p50和p65的異二聚體的主要形式存在,其被緊密結合的抑制劑蛋白κB(inhibitor of NF-κB,IκB)家族的抑制蛋白螯合在細胞質中,當其被炎癥誘導物刺激后,IκB被磷酸化、泛素化和降解,NF-κB轉移到細胞核,與特定的啟動子元件結合觸發下游靶基因(炎性介質、細胞因子)的轉錄。丁酸鹽抑制NF-κB從細胞質向細胞核的遷移,通過抑制NF-κB活化和IκBα降解來降低促炎細胞因子的表達[40]。調節NF-κB能夠維持腸道穩態,在IBD患者的炎癥黏膜以及DSS誘導的結腸炎中,NF-κB活性上調。抑制NF-κB是治療IBD的一種治療策略。丁酸鹽可以抑制NF-κB的激活[41]。通過與IκBα等抑制性分子結合來調節NF-κB。其抑制了IκBα的降解和磷酸化,降低了NF-κB的DNA結合活性[39]。研究表明丁酸鈉能夠通過激活GPR109A、抑制蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和NF-κB p65的磷酸化從而改善TNBS誘導的炎性反應[42]。因此丁酸鹽對于NF-κB的抑制可以為治療IBD提供新的選擇。

3.3 丁酸鹽降低一氧化氮(NO)生成 NO是一種可以調節多種生理功能的小分子神經遞質和免疫調節劑,根據其劑量和環境的不同發揮促炎或抗炎的作用[43]。誘導型NO合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)可以通過免疫細胞激活誘導微摩爾水平的NO,從而引發慢性炎癥性疾病[44]。脂蛋白是金黃色葡萄球菌引起IBD的主要毒力因子,導致NO等炎性介質過多產生。有研究證明丁酸鹽抑制金黃色葡萄球菌脂蛋白(S.aureuslipoprotein,Sa.LPP)誘導的RAW264.7細胞和骨髓源性巨噬細胞中NO的產生,抑制Sa.LPP誘導的iNOS表達,抑制對于誘導巨噬細胞中iNOS轉錄至關重要的Sa.LPP誘導的NF-κB激活、干擾素-β(interferon-β,IFN-β)表達和STAT1磷酸化[45]。此外組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑也可以減少Sa.LPP誘導的NO產生。先前的研究已經證明了PPARγ激動劑可以減少干擾素γ或LPS誘導的NO產生[46]和iNOS[47]表達。此外,丁酸鈉作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑可以增強其啟動子上的H3K9Ac修飾來上調PPARα的表達。丁酸鈉誘導PPARα激活后刺激脂肪酸β氧化,并通過蛋白質-蛋白質相互作用抑制NF-κB介導的炎癥途徑[48]。最近的研究表明PPARα激動劑以蛋白酶體途徑增強iNOS蛋白降解,從而減少巨噬細胞中LPS誘導的iNOS表達和NO產生[49]。因此丁酸鹽可能以減少NO產生作為靶點來緩解和治療IBD。

3.4 GPCR途徑 GPR109A是一種在先天免疫細胞和脂肪組織中高度表達的G蛋白耦聯受體,其可被丁酸鹽激活。固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)是能夠誘導、調節和消退炎性反應的一個免疫細胞家族,ILCs受到微環境中的微生物和細胞因子刺激快速產生促炎和調節細胞因子。其中ILC3促進和調節腸道炎癥,在IL-23和IL-1β刺激下表達轉錄因子RORγt并產生IL-17和IL-22。研究發現與IL-22相比,ILC3在GPR109A-/-Rag1-/-小鼠中顯著增加了IL-17的產生。確定GPR109A抑制樹突狀細胞(dendritic cell,DC)產生IL-23從而抑制ILC3介導的結腸炎癥[50]。此外,丁酸鹽激活GPR109A后促進Treg細胞的分化,提高產生IL-10的Th2細胞和血漿IL-10水平,進而抑制促炎性IL-17[51],還能夠增加腸上皮細胞中IL-18的分泌[52]。SCFAs對腸上皮細胞上GPR41的激活導致快速炎性反應[53],丁酸鹽對其的刺激可阻止NO、IL-6和IL-12的釋放[12],并且可以促進CD4+T細胞和ILCs中IL-22的產生[54]。GPR43受體通過β-制動蛋白2(β-arrestin2)信號通路降低NF-kB水平,減少NF-kB2個亞基p65和p50進入細胞核的量,抑制促炎細胞因子(IL-1β和IL-6)的轉錄[55]。并且丁酸鹽在激活GPR43后會減少CD4+T細胞增殖并限制促炎細胞因子(例如IL-17和L-22)的分泌[56]。而另一項研究表明在各種慢性結腸炎小鼠模型中,GPR43 KO小鼠對結腸炎癥更具抵抗力[57]。這些矛盾產生的原因尚不清楚,可能與腸道微生物群的差異和SCFAs生產水平的不同有關[58]。除此之外,免疫細胞和上皮細胞中的GPR109A、GPR41和GPR43激活可以刺激NLRP3炎癥小體復合物[59]。丁酸鹽可以抑制LPS誘導的Caco-2細胞中的自噬和NLRP3炎癥小體激活[60]。因此丁酸鹽作為GPR109A、GPR41、GPR43激動劑有望作為緩解和治療IBD的潛在靶點。

3.5 丁酸鹽誘導宿主防御肽表達 宿主防御肽(host defense peptides,HDPs),也稱為抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs),能夠保護宿主免受病原體感染、共生細菌抗原易位以及調節健康微生物群的組成[61]。SCFAs通過與GPR43的相互作用、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)途徑的激活以及細胞生長途徑刺激腸上皮細胞(intestinal epithelial cell,IEC)合成HDPs。丁酸鹽通過抑制HDAC促進單核細胞到巨噬細胞的發育,刺激巨噬細胞中HDPs的合成,增加巨噬細胞釋放的HDPs的數量。研究表明,丁酸鈉在西式飲食誘導的肥胖小鼠體內增強潘氏細胞的抗菌功能,誘導潘氏細胞分泌α-防御素來減輕腸道屏障功能障礙,并強調了HDAC抑制和STAT3信號在介導菊粉及其發酵產物對α-防御素的轉錄調控和誘導中發揮作用[62]。丁酸鈉在牛乳腺上皮細胞中增強MAPK信號激活和組蛋白H3乙酰化來促進促炎細胞因子、趨化因子和β-防御素的表達,從而募集免疫細胞,促進病原體和刺激的消除,并促進感染后的恢復,增強LPS誘導的先天免疫反應[63]。在一項動物實驗中,GPR43-/-小鼠中,IEC內再生胰島衍生蛋白3γ(RegIIIγ)和β-防御素的產生受損,而給予GPR43激動劑增強小鼠和人IEC中HDPs的產生,丁酸鹽促進了野生型(WT)而沒有促進GPR43-/-腸上皮類腸中RegIIIγ和β-防御素的表達,表明GPR43參與HDPs的產生。丁酸鹽以GPR43依賴的方式促進IEC RegIIIγ和β-防御素的產生。研究還證明了mTOR和STAT3的SCFA激活可以協同促進AMPs在IEC中的表達[64]。因此靶向丁酸鹽介導的HDPs產生的內在途徑的藥物可能成為緩解和治療IBD有前途的候選者。見圖1。

圖1 丁酸鹽在炎癥性腸病中的免疫調節機制

綜上所述,丁酸鹽作為一種腸道微生物代謝產物,在調節免疫功能、上皮屏障功能和維持腸道穩態方面發揮著至關重要的作用。丁酸鹽通過對免疫細胞的調節,抑制HDAC,阻止NF-κB核轉位,減少NO合成,刺激GPR109A、GPR41、GPR43受體,誘導宿主防御肽表達等多種機制減輕炎癥。丁酸鹽可能是IBD的替代治療方法,需要進一步的研究來確定丁酸鹽在IBD發病中的作用以及丁酸鹽是否是IBD的有效治療方法。