基于膝關節軟骨損傷探討自體軟骨細胞植入術的相關研究進展

王寧,王廣積,杜秀藩

(1.海南醫學院,海南 海口 570311;2.海南醫學院附屬海南醫院,海南省人民醫院運動醫學科,海南 海口 570300)

膝關節軟骨是覆蓋雙關節末端的無血管和非神經結締組織,其功能主要是實現潤滑的關節運動,在日常活動中其承受重復的高沖擊和負荷,所以膝關節軟骨損傷是常見的骨科疾病之一[1]。由于其無血管結構,再生能力較差,因此對于它的修復和再生具有很高的挑戰性。臨床上對于修復關節軟骨損傷的手術已有多種方法,比如微骨折(microfracture,MF)、骨軟骨自體移植(osteochondral autograft transplantation,OAT)、同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)、自體軟骨細胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)以及組織工程技術等。

目前關節軟骨缺損的理想治療方法是恢復有組織的透明軟骨,降低其再發病率。目前ACI、OAT與OCA以及組織工程技術理論上能提供透明軟骨的幾種手術方案,然而OAT存在供體區發病率的問題,并且與移植物的面積大小成正比,即軟骨損傷區域越大,應用OAT治療軟骨損傷后引發供體區發病率的可能性越大[2]。OCA作為替代OAT的治療手段,目前是臨床研究的熱點之一,但OCA作為異體移植物,可能存在宿主-移植物反應,這可能導致移植失敗。除此以外OCA還存在著疾病傳播、移植物輪廓匹配以及從移植物獲取到植入的時間有限等因素的影響[3]。

1 ACI的進化過程

20世紀60年代末,Chesterman和Smith[4]發表了一篇具有里程碑意義的文章,描述了成功地將分離的軟骨細胞移植到兔子身上。他們的發現為后續ACI的發展做了良好的鋪墊,直到1994年ACI技術被Brittberg等[5]首次報道。ACI技術主要分為兩個步驟:(1)在關節鏡檢查過程中獲得軟骨細胞,然后將其送去培養;(2)在獲得的軟骨細胞培養2～3周后,將骨膜貼片用可吸收縫線固定在周圍的軟骨上以形成一個儲液器,并在其下方注射培養的軟骨細胞懸浮液。最早的ACI技術也被稱為第1代ACI,基于骨膜的自體軟骨細胞植入(periosteum-based autologous chondrocyte implantation,ACI-P)。隨著技術的發展,研究者也對第1代ACI技術進行了新的改進,比如應用膠原膜替代骨貼膜、使用支架等;第2代ACI在懸浮培養的軟骨細胞表面覆蓋一層由I型或Ⅲ型膠原組成的膜;第3代技術涉及細胞外基質或臨時支架的創造,旨在誘導細胞在體外生長和成熟。軟骨細胞附著在支架上,從而避免了將細胞注射到病變部位的需要。這些第2代和第3代技術也被稱為基于膠原膜的自體軟骨細胞植入(collagen membrane-based autologous chondrocyte implantation,ACI-C)、膜相關自體軟骨細胞植入(membrane-associated autologous chondrocyte implantation,MACI)和基于支架的ACI[6]。

2 關于3代ACI

三種ACI技術均以軟骨細胞培養以誘導透明軟骨形成為目的,三者的區別主要在于貼膜性質與承載軟骨細胞的介質不同。雖然ACI-P的短期和中期結果可觀,但可能發生多種并發癥,包括骨膜肥大、骨膜鈣化、分層和關節內病變等[7]。

ACI-C與MACI的發展相當迅速,其目的是解決與ACI-P相關的局限性。ACI-C目前經過至少一項前瞻性研究已被證實持久有效。比如在一項前瞻性實驗中,Ossendorf等[8]使用一種基于自體聚合物的三維軟骨細胞移植物,可以很好地修復局灶性關節軟骨缺損。這種聚合物名為BioSeed-C,是一種第2代ACI組織工程軟骨移植物,它能將自體軟骨細胞與凝膠樣基質的組織二者特性結合在穩定的生物可吸收聚合物支架中。該研究結果報告認為這種第2代ACI方法與ACI-P相比具有許多優勢,具體表現在通過使用穩定的生物貼膜,使接種的軟骨細胞更有效地保留在植入部位,減少關節腔細胞丟失,從而促進新軟骨與周圍宿主關節軟骨組織之間更充分的整合。Gooding等[9]比較了ACI-P和ACI-C的短期療效,隨訪2年中試驗結果差異無統計學意義。然而,ACI-P組的并發癥發生率較高,因為多例患者因移植物(骨膜)肥大或出現分層需要進行翻修手術。Samuelson和Brown等[10]則對ACI-P和ACI-C進行了成本效益分析,他們發現雖然這兩種方法都具有成本效益,但是基于移植物肥大風險而言,發現ACI-C比ACI-P更具成本效益。在一項針對第1代和第2代ACI技術臨床治療效果長達10年隨訪的研究中,與ACI-P相比,ACI-C將膠原膜與自體軟骨細胞結合使用可帶來更好的臨床長期結果。基于這些結果,ACI-C應優先于ACI-P[11]。

MACI出現于20世紀90年代和21世紀初,提倡使用MACI的研究者們認為該技術消除了與ACI-P和ACI-C相關的某些并發癥和困難[12]。例如,當使用帶骨膜或膠原蛋白貼片的ACI時,很難均勻分布軟骨細胞或在不規則骨軟骨連接處形成安全貼片。ACI-P和ACI-C二者都需要縫合和行關節切開術,會延長手術時間,與貼片技術相關的常見并發癥包括移植物肥厚、貼片剝離以及縫合線對周圍軟骨的損傷等。與ACI-P和ACI-C不同,MACI中自體軟骨細胞是在膜上植入的。MACI膜由含有軟骨細胞的Ⅰ型/Ⅲ型膠原雙分子層組成,雙分子層的一側有間距很大的膠原纖維,這就形成了一個粗糙的表面,雙分子層的另一側由緊密排列的膠原纖維組成,這就形成了一個光滑的表面。軟骨細胞分布在雙分子層粗糙的一側。在手術過程中,用纖維蛋白膠將膜直接固定在軟骨損傷處,從而避免了縫合膜的需要。由于其粘附性,這種膜可以植入困難的部位,細胞也均勻分布在整個膜上。MACI的另一個優點是它可以作為成纖維細胞移入軟骨細胞的屏障,否則會導致纖維軟骨的形成[12]。

Ebert等[13]用MACI治療膝關節軟骨損傷,并在移植后5年用臨床癥狀和MRI進行評估治療效果。在接受治療的45例患者中,膝關節損傷和骨關節炎結局評分(knee injury and osteoarthritis score,KOOS)以及健康調查簡表(the MOS item short from health survey, SF-36)均有顯著改善,MRI評分顯著提高,67%患者的移植物顯示完全填充,89%患者的移植物顯示良好到極好的填充。同樣,Marlovits等[14]報告了用MACI治療軟骨缺損的臨床和放射學的5年隨訪結果,MACI術后患者的KOOS評分均有顯著改善,不僅如此,患者國際膝關節文獻委員會(international knee documentation committee,IKDC)評分、辛辛那提膝關節評分和膝關節Lysholm評分也取得了顯著改善,而在治療5年后大多數患者觀察到移植物完全填充(83%)。在一項Ⅱ級研究中,Zeifang等[15]比較了MACI和ACI-P的2年預后,該研究納入了21例軟骨受損平均面積為4.1 cm2的患者,雖然術后IKDC的差異不大,但ACI-P組Lysholm的評分卻較高。此外,術后MRI的評估顯示,ACI-P組的軟骨修復組織MRI觀察評分較MACI組更高,但隨訪2年后結果差異無統計學意義。而Bartlett等[12]在ACI-C與MACI治療效果的Ⅱ級隨機研究中共納入91例患者,結果兩組辛辛那提膝關節評分、國際軟骨修復協會評分、疼痛視覺模擬評分表的差異均無統計學意義,且兩組患者并發癥發生率接近,均發生移植物肥厚。

3 ACI與其他手術的差異

3.1 ACI與MF 以MF為代表的骨髓刺激技術因為其簡易、成本低、短期效果好而常常做為軟骨損傷后的首選治療方式。但有證據提示在接受MF治療5年后,特別是應用MF治療大面積軟骨缺損治療時,膝關節功能會發生惡化[16]。在一項多中心前瞻性試驗中,Saris等[17]將118例患者隨機分組,分別進行MF和ACI治療(ACI-P或ACI-C),隨訪3年后發現兩組KOOS、疼痛視覺模擬評分表以及生活質量上比較,ACI組明顯高于MF組。而Kon等[18]進行了一項前瞻性隊列研究,比較了ACI-C與MF治療膝關節軟骨損傷的療效。該研究應用了一種名為Hyalograft C的聚合物,發現隨著時間的推移,植入Hyalograft C組在2～5年后觀察到良好的結果,而MF組在治療4～6年后逐漸惡化。在Kon[19]的另一項研究中,在高水平的男性足球運動員中發現了類似的結果:雖然MF組較早恢復運動,但隨著時間的推移結果有所下降,所以他認為基于膠原貼膜的軟骨細胞植入技術(Hyalograf-C)較MF能提供更持久的臨床結果。Basad等[20]進行了一項前瞻性隨機對照試驗研究,將MACI與骨髓刺激技術進行了比較,其中20例患者接受MACI手術,20例患者接受MF手術,兩組在Lysholm評分、國際軟骨修復協會評分方面均有顯著改善,但手術后2年內MACI優于MF。而在Dhillon等[21]一篇關于MACI與MF治療膝關節局灶性軟骨缺損的meta分析也支持這種觀點,他認為在短期隨訪中,MACI治療成功率高于MF。

3.2 ACI與OAT/OCA 既往研究已經表明[22-23]關節軟骨缺損區域在2～4 cm2可以使用ACI或OAT,當缺損區域>4 cm2則可以使用ACI或OCA。OAT是一種能立即用透明軟骨填充關節軟骨缺損的手術治療方式,這種技術需要從患者自己的關節收集軟骨(通常是同側膝蓋的非承重區域),收獲一個或多個骨軟骨移植物,并將其移植到軟骨缺損區域,但這將導致收集軟骨區域發生軟骨缺損的概率增大[2]。在一項關于ACI與OAT隨訪時間至少10年的前瞻性研究中發現,與OAT相比,接受ACI治療功能結局明顯更好[24]。

關節軟骨缺損太大而無法成功自體移植時,OCA可作為OAT的替代療法。研究表明[25],這種技術可改善功能,用于治療局灶性和彌漫性軟骨病變以及高需求患者。在一項隊列研究中[26]對比了OCA與ACI治療局灶性關節軟骨缺損的臨床和功能結局差異,研究結果表明,ACI在所有病變部位治療癥狀性關節軟骨缺損的結局與OCA相似。

4 ACI相關并發癥

雖然ACI技術從短期和長期結果來看都有不錯的成績,但伴隨ACI的并發癥問題不容小覷,一篇關于研究膝關節軟骨缺損自體軟骨細胞植入后的特征性并發癥認為,ACI的并發癥主要診斷可歸納為四種:癥狀性肥大、融合紊亂、分層和移植失敗[27]。(1)癥狀性肥大即前文所述的移植物肥厚,最常見于骨膜瓣覆蓋ACI(ACI-P)的患者,常引起的臨床癥狀如持續疼痛或膝關節功能障礙。Harris等[28]在一篇囊括了13項Ⅰ級和Ⅱ級研究報告的關于ACI系統綜述中發現移植物肥厚發生率在ACI-P中占22%、ACI-C中占5%、MACI中占4%。(2)融合紊亂是指再生軟骨不能與周圍的健康軟骨融合。Niemeyer等[27]發現融合不足的發生率為23.1%。以MACI組(4.8%)中發生干擾融合最為常見,其次是ACI-C組(3.7%),而ACI-P組無干擾融合病例。(3)分層是ACI后的并發癥之一,指的是軟骨與軟骨下層骨的分離。這是由剪切力引起的,在兩層融合發生之前,導致軟骨層在軟骨下骨層上滑動,這可能因不順應或過早恢復負重而發生[27]。(4)在系統綜述[28]中對移植失敗最常見的定義是再次手術,在13項研究報告604例病例中,有17例需要再次手術,總體失敗率為2.8%。而在Harris的另一篇單獨對82項Ⅰ～Ⅳ級系統研究的綜述中[29],囊括了5 276例患者,使用了不同代的ACI和手術技術,總體來說ACI治療后失敗率較低(1.5%～7.7%),與前面的系統綜述[28]不同。這篇文獻中將失敗率與再手術率分開來描述結果,在3代ACI技術中,以ACI-P的術后失敗率和非計劃再手術率最高分別是7.7%和27.0%。其中以移植物肥厚和分層后進行清創為最常見的再手術原因。除此之外,還存在再生軟骨不足、關節纖維化、深靜脈血栓形成、傷口感染以及膿毒性關節炎等少見的并發癥[27]。針對這些并發癥,Welton等[2]認為選用ACI之前應從年齡、貼膜類別、軟骨缺損位置等去考慮,比如老年人群及ACI-P治療的患者容易出現再生軟骨不足、移植物肥大等并發癥,而髕骨軟骨缺損可會導致移植物肥大的風險增加。分層的治療方法是清除已經發生分層的軟骨層后,根據剩余缺損的大小進一步治療,較小的缺損(<2 cm2)可以通過MF或OAT進行二次治療,而較大的缺損則考慮通過ACI或OCA來進行補救[2]。

5 ACI球狀體的應用

2002年,Anderer和Libera[30]首次提出了源自自身聚集軟骨細胞的球狀體的概念,通過在瓊脂糖包被的孔中培養擴增的軟骨細胞來制造球狀體是可行的,在內含自身血清的培養基中進行完整的細胞培養,不使用額外的生長因子、抗生素或其他異種產物。

基于球狀體的概念,科研人員在早期進行了一系列臨床前和非臨床研究。在一項臨床前實驗中,Schubert等[31]進行了球狀體的原理驗證試驗,該實驗首次證明了軟骨細胞球狀體填充軟骨病變的預期功能。而在另一項研究中,針對于骨骼成熟的雄性豬進行評估大型動物模型軟骨細胞球狀體的體內療效[32]。在進行人為軟骨缺損形成及球狀體治療后2個月后,對缺損區域進行組織學評估,結果發現在進行球狀體治療后表現出較未處理缺損更高程度的填充,并伴有更光滑的再生表面。除此之外,研究人員通過根據良好實驗室管理規范評估免疫缺損型小鼠的生物分布和致瘤性,解決了植入球狀體ACI后的安全性問題[33]。在隨后的Ⅱ、Ⅲ期臨床實驗中研究了球狀體劑量對治療膝關節軟骨缺損的安全性和有效性,以及對比了球狀體與MF治療膝關節軟骨缺損的效果,結果顯示隨訪數據得到改善,且較MF治療水平高[34]。

在進行了一系列研究確保該技術的安全性和有效性后,球狀體在近幾年逐漸應用于臨床。目前臨床上應用的球狀體是德國制造的產品,又稱為Spherox。在這種技術中,軟骨細胞在單層中培養,然后進行三維培養,形成由軟骨細胞及其自合成的細胞外基質組成的球狀體,在使用前球狀體被放入NaCl溶液中。其可以自粘在軟骨下骨和軟骨上,與其他ACI技術相比,這去除了任何外源性基質、膠水或縫合線的需要[35]。在最近一項研究中,研究人員將球狀體與MF進行了治療對比研究,并進行了5年隨訪,發現球狀體ACI治療在5年隨訪期間的IKDC、KOOS、Lysholm以及軟骨修復組織的磁共振觀察等評分均有良好改善。其中球狀體ACI的KOOS評分優于MF且沒有發現安全隱患[35]。除了臨床數據以外,在組織學結果上,研究人員對球狀體ACI修復膝關節軟骨缺損后的患者進行穿刺活檢,并對標本進行組織學染色,發現在所有患者的再生組織中都觀察到具有完整軟骨-骨邊界界面的缺血性軟骨組織。再生組織內的細胞顯示出圓形和軟骨細胞表型,并形成簇狀。該研究發現基于球狀體的ACI治療后再生的軟骨組織在組織學和免疫組織化學上與透明關節軟骨非常相似,這表明了基于球狀體的ACI在以透明關節軟骨為主的再生方面產生了有意義的組織學結果[36]。

6 總結與展望

目前常用的骨軟骨病變治療方法對于軟骨缺損均有不同程度的療效,ACI是一種有效的關節軟骨再生方法,目前ACI/MACI被英國國家衛生與臨床優化研究所推薦作為適用患者的一線手術[37]。

對于歷代ACI技術,ACI-C較ACI-P的區別就在于貼膜的性質,能夠更好的使軟骨細胞溶液儲存在缺損區域。雖然目前已經有研究證明ACI-C較ACI-P有短期至長期的優勢,但大多數是基于ACI-P并發癥多且高發來當做證據,這也將可能導致得出研究結論的依據過于單一以至于證據等級可信度不高。而現在尚未有有力的證據去證明MACI較前兩代ACI技術存在優勢,且闡述歷代ACI之間比較的文獻也較少。除此之外,對于移植失敗的定義與再手術率的相關性在三種ACI技術中尚未得到共識。所以在三種ACI技術之間差異的問題上,未來可能需要通過設計良好且長期的隨機對照試驗研究來進一步探討。

球狀體ACI是一項相對較新的技術,多項研究報告已經確定了其安全性和有效性,甚至是相較于MF技術的優越性。而在與傳統ACI技術的比較上,根據球狀體ACI應用原理與傳統ACI技術相關的并發癥發生率可能會下降。比如有文獻表明縫合線固定會永久性損傷周圍的軟骨[38],此外因為含有抑肽酶,導致使用人纖維蛋白封閉劑粘合移植物可能會引發免疫反應[39]。基于目前對球狀體ACI技術的研究報告,球狀體ACI治療軟骨缺損的效果似乎很有潛力,但目前關于球狀體軟骨細胞最佳培養時間和劑量還有待進一步研究,除此之外球狀體ACI不良反應包括關節積液、關節痛和關節腫脹[40]。未來還需要更多且精心設計的隨機對照實驗去對比球狀體ACI與傳統ACI技術之間以及與其他軟骨治療方法的差異,才能得出其在治療關節軟骨缺損上證據等級更高的臨床結論。