工程化益生菌活菌制劑在疾病治療中的研究進展

賀鼎元,何東升,涂家生

(1.中國藥科大學藥學院藥用輔料及仿創藥物研發評價中心,江蘇 南京 210009;2.國家藥品監督管理局藥物制劑及輔料研究與評價重點實驗室,江蘇 南京 210009)

益生菌作為對人體能產生健康功效的活性微生物補充劑,與人們的生活關系密切,在食品、藥品和動物飼料等多個領域已經得到廣泛應用。益生菌可在呼吸道、泌尿生殖道和腸道定植,并調控人體各部位菌群,進而調節乳糖代謝、鈣吸收、維生素合成,以及抑制癌變等[1-2]。關于益生菌的研究已經在全世界開展了數十年之久,由于基因編輯技術的迅速發展與基因工程相關試驗成本的降低,目前已可更便捷地實現益生菌的定向工程化改造,使其具有特定的治療功能[3]。近年來,如脂質體包裹納米酶涂層修飾的工程化益生菌應用于潰瘍性結腸炎治療[4]、基因工程改造乳酸乳球菌分泌β-內酰胺酶進而治療艱難梭菌感染[5]等多種治療策略的出現,都展示了益生菌制劑的廣大前景。

1 益生菌活菌制劑的優勢

益生菌活菌制劑繼承了益生菌本身的安全性,同時易于改造以發揮新功能,另外還具有獨有且優異的目標病灶靶向性及組織留存能力,這讓益生菌活菌制劑在疾病治療方面顯示出了巨大的潛力[6-7]。

1.1 基因組龐大,便于改造益生菌具有龐大的基因組,便于進行基因工程改造。以嗜酸乳桿菌為例,其基因組大小在1.99 Mb左右,基因數目約1 927～1 948,蛋白數目約1 832～1 845,龐大的基因組和蛋白數目使其適合作為基因工程化改造的原材料[8]。除傳統電激法、熱激法質粒導入外,近年來CRISPR等基因編輯技術的迅速發展也使目標工程化益生菌的制備更為高效便捷。通過基因編輯技術對現有益生菌進行改造,可以直接驗證這些新型微生物的遺傳物質、蛋白質和功能作用是否發生了預期的改變。Zhou等[9]利用外源性Ⅱ型CRISPR-Cas9系統和內源性I-B型CRISPR-Cas系統進行了無縫基因組工程的研究,而這種高通量基因組工程工具的應用除了為益生菌改造提供便利外,也對從基因組學角度來探究益生菌對宿主產生益處的機制有著重要意義。此外,益生菌表面的細胞膜和細胞壁可進行修飾以攜帶多種元件,使其成為更加多功能化的藥物載體。在益生菌表面利用沉積法形成雙分子脂質涂層以及自組裝絲素蛋白納米涂層用于保護細菌載體等相關設計思路在國內外均有報道[10-11]。

1.2 生長簡單可控,培養技術成熟益生菌的生長簡單可控,具有培養技術成熟高效和培養成本較低的優點。目前益生菌的培養技術已經趨于成熟,益生菌繁殖迅速、成本低廉和操作簡便的優點使其相較于其他傳統納米藥物載體而言更加易于獲得,在載體設計與前期預實驗的進行上更為高效。而益生菌本身作為一類常被用于食品中的安全的添加劑,對人體健康益處已在食品上得到驗證,因此其在安全性方面具有明顯的優勢[12]。

1.3 對腫瘤微環境存在靶向性在不同種類腫瘤的腫瘤微環境中,存在乏氧或富氧的不同情況,而益生菌中也存在好氧菌和厭氧菌,這讓益生菌形成了天然的腫瘤微環境靶向性。以丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌為代表的厭氧益生菌具有主動靶向乏氧腫瘤微環境的潛質,而枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等好氧型益生菌則具有靶向富氧腫瘤微環境的潛質。除了利用腫瘤微環境富氧/乏氧特性實現靶向外,部分益生菌(如嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌)由于具有一定胃腸道耐受能力與定植能力,在進行工程化改造后可以設計成具有胃腸道主動靶向功能的口服藥物遞送載體[13]。

2 工程化益生菌活菌制劑在疾病治療中的應用

工程化益生菌活菌制劑本身不僅具有較大的空間作為藥物的載體,作為益生菌還具有調控菌群的功能,同時還可作為生產平臺在原位表達多種具有治療作用的組分,因此其在藥物制劑領域和疾病治療中的應用前景十分廣闊[3,14-15]。

2.1 工程化益生菌用于治療細菌感染細菌感染通常使用抗生素進行治療,然而抗生素的過度使用會造成人體內細菌耐藥增強,經抗生素篩選后存活的具備耐藥性的“超級細菌”的繁殖會導致腸道菌群失衡,進而導致乳糜瀉、膿毒癥、炎癥性腸病、肝臟甚至胰腺相關炎癥的產生[16]。在面對類似問題時,工程化益生菌為細菌感染的治療提供了新的思路。

艱難梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)一般是由產毒素艱難梭菌過度繁殖導致腸道菌群失調并釋放毒素所引起的,其臨床表現多樣,從無癥狀的攜帶者狀態,到不同程度的腹瀉,再到最嚴重的威脅生命的結腸炎,最終導致死亡[17]。常用的對CDI的診斷手段是使用酶免疫分析進行檢測,然后結合萬古霉素、非達霉素等抗生素進行治療[18]。Chen等[19]對布拉迪酵母菌進行了工程化改造,使其分泌一種單一的四特異性抗體,該抗體能有效和廣泛地中和CDI的主要毒力因子(TcdA毒素和TcdB毒素),對抗疾病而不引起抗生素耐藥性。在對小鼠疾病模型的預防和治療實驗中,該工程菌證明對原發性和復發性CDI具有保護作用。這種工程化酵母菌免疫療法具有能夠與抗生素聯用的優點,有作為CDI風險預防藥物和CDI患者治療藥物的潛力。此外,已被認證對人體安全的布拉迪酵母菌用于遞送時,可以使用口服給藥,這種方便而高順應性的給藥方式也讓這個治療方案相比傳統藥物載體介導的免疫療法有著明顯的優勢。

李斯特菌是最致命的食源性病原體之一,可造成二至三成的感染者死亡[20]。Bhunia團隊設計了可以產生李斯特菌黏附蛋白的工程干酪乳桿菌菌株,該菌株在小鼠腸道定植,競爭性地減少李斯特菌的黏膜定植和全身傳播,保護小鼠免受致命感染。它們還可以通過聚集腸黏膜調節性T細胞、CD11c+樹突狀細胞和自然殺傷細胞來增強腸免疫調節功能[21]。這種基于配體-受體結合機制來設計的抗感染策略更為直接有效,也具有更好的生物安全性。菌株與腸道上皮細胞的近距離接觸和接近增加了與宿主相互作用的機會,從而更好地執行接觸依賴機制(競爭排斥和免疫調節),以發揮其預期的有益作用。

2.2 工程化益生菌應用于病毒感染治療在病毒感染治療方面,工程化益生菌主要通過在原位表達抗病毒因子而發揮治療作用,也得到了廣泛的應用。針對HIV感染,Petrova等[22]構建了工程化鼠李糖乳桿菌表達HIV抑制劑用于HIV的治療。他們首先分別在鼠李糖乳桿菌GG和GR-1中表達Actinohivin(AH)和Griffithsin(GRFT)兩種抑制HIV的凝集素,分別用于胃腸道和陰道黏膜遞送,并研究GRFT在胞內的表達情況。該研究成功構建了能夠生產GRFT的重組鼠李糖乳桿菌GG和GR-1菌株。在nisA啟動子誘導下,觀察到重組GRFT表達水平最高,證明了對M型和T型HIV-1病毒株的抗HIV活性。該研究開發了一種有效的基于工程化微生物的抗HIV-1藥劑,使用鼠李糖乳桿菌GG和GR-1作為治療蛋白的載體獲得了較好的效果,這項工作代表著關于抗艾滋病凝集素原位高效表達的研究邁出了重要的一步。針對小鼠諾如病毒感染,Hoang等[23]構建了工程化副干酪乳桿菌進行了研究。該研究首先對鼠源的具有潛在抗病毒活性的3D8單抗的編碼序列進行密碼子優化,將其導入副干酪乳桿菌中使其能夠分泌3D8單抗(3D8 scFv),并對該單抗對胃腸道病毒感染的抗病毒作用進行評價。結果表明,新構建的工程化副干酪乳桿菌分泌的3D8 scFv保持了穿透細胞和核酸水解活性。使用提取的3D8 scFv來預處理RAW264.7細胞,可防止小鼠諾如病毒感染誘導的細胞凋亡,降低病毒衣殼蛋白VP1 mRNA的表達。小鼠模型中,在小鼠諾如病毒感染前口服工程化副干酪乳桿菌可使編碼病毒聚合酶mRNA的表達水平降低20.1倍。綜上所述,這些結果表明,可分泌3D8 scFv的副干酪乳桿菌為開發可攝入的抗病毒益生菌提供了抗胃腸道病毒感染的基礎。

2.3 工程化益生菌應用于腫瘤治療工程化益生菌的潛在多功能修飾特性為其在腫瘤治療中提供了多種可能,如通過調節腸道菌群及利用自身靶向作用等特點,為腫瘤的治療提供了新的思路。為了實現治療目的,工程化益生菌制劑的構建主要通過兩種策略:一是將益生菌包裹于載體材料內;二是將治療性藥物裝載于益生菌內部,而將益生菌作為載體[24]。

將益生菌包括與載體材料中,可以利用載體材料的可修飾特性賦予益生菌新的功能。Zheng等[25]利用β-環糊精和金剛烷介導的主客體相互作用,將葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外部制備了益生菌孢子(孢子-dex),并探究了其在結腸癌治療中的應用。在腸道的厭氧環境中,孢子-dex會復活,分解葡聚糖,并特異性地富集在腫瘤組織中。葡聚糖的引入改善了腸黏附,促進了丁酸梭菌的發酵,進而產生大量的抗癌短鏈脂肪酸。此外,益生元的易修飾性也提供了與卡培他濱和雙氯芬酸等負載藥物聯合治療的可能性。重要的是,這項研究表明,孢子-dex能系統地調節腸道微生物群,從而將腸道微生物群從促腫瘤轉變為抗腫瘤類型,可為胃腸道疾病的新療法設計提供參考。

益生菌的安全性和內部空間使其可以作為良好的藥物載體。Xie等[26]構建了趨磁益生菌負載光熱治療劑并開展了用于腫瘤治療的研究。他們提出了一種將藥物加載到益生菌中的遞送策略,通過電穿孔將化療藥物5-氟尿嘧啶和巨噬細胞表型調節劑唑來膦酸裝入大腸桿菌Nissle 1917(EcN)中,然后在EcN表面裝飾金納米棒來構建工程化益生菌。在近紅外照射下,金納米棒的光熱效應提高了局部溫度,內部藥物逐步釋放,實現了由外部開關來控制藥物的釋放,也是實現通過活細胞來實現對藥物的控釋。EcN的主動靶向促進了藥物在腫瘤內滲出血管并蓄積的過程。這個治療方案將化療、免疫治療和光熱效應結合于一體,為益生菌作為靶向藥物載體在腫瘤治療中的研究提供了新思路。

2.4 工程化益生菌應用于炎癥治療在炎癥治療方面,工程化益生菌同樣可通過原位表達特異性治療分子以及腸道菌群的調節等方式來發揮作用。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)分為兩種亞型,即克羅恩病和潰瘍性結腸炎,均與T細胞介導的對腸道細菌的免疫反應失調有關,是慢性復發緩解的胃腸道炎癥性疾病。Zhou等[27]開發了一種能夠在胃腸道內原位產生過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的工程益生菌[EcN-pE(C/A)2],并考察了他們在IBD中的治療作用。他們設計了殼聚糖和海藻酸鈉為組分的材料來包裹工程化益生菌,使口服工程益生菌具備胃腸道環境耐受能力。結果表明,口服EcN-pE(C/A)2可有效上調結腸組織緊密連接相關蛋白的表達水平,保護結腸上皮細胞免受炎癥誘導的凋亡。動物實驗結果表明EcN-pE(C/A)2的治療能顯著減輕葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)誘導的急性IBD,具體表現包括體重恢復、結腸黏膜組織損傷恢復和結腸髓過氧化物酶活性降低。結果表明,口服這種包被的工程化益生菌對急性IBD的治療是安全有效的。在口腔炎癥方面,Silva等[28]使用分泌人三葉因子1(hTFF1)的基因對乳酸乳球菌進行了工程化改造,并在臨床中配制成漱口液用于治療口腔黏膜炎癥。結果表明,局部給藥工程化乳桿菌來原位分泌hTFF1為口腔黏膜炎的預防和治療提供了一種安全有效的工具。值得一提的是,安全性研究結果也支持對有發生中性粒細胞減少風險的口腔黏膜炎患者安全給藥,這將大大降低此類患者因口腔黏膜損傷誘發菌血癥的額外風險。這項研究的結果對于口腔黏膜炎癥這一重要且目前仍未被滿足的醫療需求而言具有重大臨床意義。

2.5 工程化益生菌應用于其他治療領域除了細菌與病毒感染、腫瘤、炎癥這些較為熱門的治療領域外,工程化益生菌活菌制劑還能為許多其他疾病的治療提供方便和有益的平臺。

在代謝性疾病方面,隨著高嘌呤飲食消費的增加,高尿酸血癥已經成為繼糖尿病之后的第二普遍的代謝性疾病,而人體內缺乏尿酸氧化酶,無法將尿酸進一步代謝。體內多余的尿酸通過腎臟和腸道排出,因此,腸道微生物可能為治療高尿酸血癥提供一種新的方式。Zhao等[29]構建了含有編碼枯草芽孢桿菌尿酸鹽代謝蛋白PucL和PucM、編碼大腸桿菌尿酸鹽轉運蛋白YgfU和過氧化氫酶KatG以及編碼透明顫菌細菌血紅蛋白Vhb的質粒,將質粒導入EcN中。該工程化EcN能夠在常氧和低氧條件下快速降解尿酸,能夠實現腸道的定植,且無論胃腸道給藥還是血液注射給藥的方式都能夠顯著降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸濃度。研究結果支持腸道中應用工程化EcN菌株來治療高尿酸血癥的可行性,同時提出了直接向血液中注射工程化EcN菌株的新療法,為使用工程化益生菌治療代謝紊亂類疾病提供了新思路。

腸-腦軸的發現已經證明,大腦功能會受到腸道微生物群代謝物的影響,因此利用工程化益生菌來調節腸道微生物群從而對大腦功能的調節具有重要意義。基于腸道微生物群的腸-腦軸調節可用于神經退行性疾病的治療。Pan等[30]設計了3種藍光響應益生菌,它們分別通過上轉換光基因分泌GABA、GCSF或GLP1等物質構建成微納米系統,從而進行對遞送系統的時空傳遞和控制。該微納米系統可促進小腸靶向和腸內外源性乳酸乳桿菌的產生,實現由腸道對焦慮行為、帕金森病、迷走神經傳入等腦功能的精準操控。已有研究表明,口服GABA能夠緩解小鼠的焦慮樣行為[31]。本實驗設計并構建了光照下能分泌具有生物活性的GABA的乳酸乳球菌,口服遞送工程化益生菌并用上轉化光照射后,結果表明,該實驗成功利用基于微生物的腸-腦軸調節實現了對焦慮的精確調節。值得一提的是,這項設計中使用的上轉化光照射觸發響應的方法比起在腸道插入光纖的傳統方法,避免了腸道組織的損傷,可控性也更強。此外,該實驗還通過相同的原理構建了能通過光照觸發響應分泌在PD恢復過程中的神經保護和神經功能恢復中發揮作用的GCSF、作用于腸神經系統(ENS)中的GLP1受體的GLP1等多種工程化光照響應型益生菌,并取得了較為理想的治療效果。這種無創、實時的益生菌干預策略使腸道菌群與宿主的交流更加可控,為工程微生物準確、有效地調口服活生物治療劑的設計方案結合了納米技術和基因工程的進展,在微生物治療的臨床應用方面有著巨大應用前景。

3 總結與展望

近年來,工程化益生菌領域的發展非常迅速,得益于CRISPR等相關基因編輯技術的發展和工程菌基因編輯平臺的構建,益生菌的工程化改造變得更加便捷高效,不斷拓展了工程化益生菌的應用。但是,工程化益生菌活菌制劑仍然存在一定的局限性。例如,由于益生菌主要定植在腸道部位,目前其在疾病治療中的應用仍以腸道部位疾病為主,將益生菌應用于人體其他部位疾病治療仍有一定難度。雖然基于腸-腦軸調節的研究使基于工程化益生菌的生物治療方案在神經退行性疾病的治療中顯示出巨大的潛力,為拓寬工程化益生菌的應用提供了有益的證據,但工程化益生菌與宿主相關大腦功能之間的遠程調節關系仍有待進一步探索。

目前FDA仍將益生菌歸類為膳食補充劑,對益生菌相關制劑的劑量、療效、安全性的要求并不嚴格。但是,益生菌活菌制劑設計研發過程中常常涉及到對益生菌進行基因工程改造以使其具備治療作用,在這一過程中獲得抗生素耐藥基因的益生菌有可能將耐藥基因轉移給鄰近的病原微生物。因此,在制備得到益生菌活菌制劑后,有必要加強相關研究,對其制劑和微生物的穩定性、在腸道上皮中的定植、抗致病反應、免疫激活等重要功能指標進行相應檢測,并進行深入探討。此外,針對益生菌改善腸道菌群豐度的生物原理尚不明確,仍需結合蛋白組學相關研究以進一步實現益生菌作為治療藥物的應用。

總之,工程化益生菌具有穩定性、特異性、選擇性、成本低、相對安全等優點,可能成為癌癥、炎癥、感染等不同類型疾病治療的新方法,同時在罕見疾病的診斷和治療方面具有巨大潛力,有望成為疾病治療和藥物制劑領域新的選擇。