靜電紡絲纖維支架在軟骨損傷修復中的研究進展*

閆超立，王 棋，劉晨婷，花扣珍

(杭州醫學院，浙江 杭州 310053)

據調查顯示，在超過50歲的人群中導致行動不便、殘疾的誘因中，骨關節炎排在第二位，僅次于心腦血管疾病[1]，已然成為人類健康生活質量的重要威脅。骨關節炎的最基本病理改變是關節軟骨的降解退變。關節炎及外傷所致的軟骨缺損常常導致關節疼痛，由于軟骨組織本身的無血管特性，軟骨缺損后常常難以自身修復[2]，目前采用自體軟骨移植、自體軟骨細胞移植、異體軟骨移植、關節清創術、微骨折技術(Microfracture)等[3]外科手術進行軟骨修復治療手段，已在臨床上廣泛使用，但其長遠效果并不理想。20世紀80年代以來，組織工程技術快速發展，為解決這種難題提供了可行的辦法。軟骨組織工程的核心之一是構建適合人體組織移植的支架，目前主要構建支架的方法有相分離法、溶劑澆鑄/粒子瀝濾技術、氣體發泡技術、靜電紡絲法[4]。其中靜電紡絲技術是近年來制備纖維支架的研究熱點，其設備操作簡單，能夠連續制備納米級超細纖維，制備的支架具有獨特的微觀結構和適當的力學性能，可以模仿天然細胞外基質結構特性，利于細胞黏附、增殖計分化，已在骨、軟骨、肌腱[5]等組織器官損傷修復中廣泛應用。

本文從靜電紡絲纖維支架的制備原理、接收裝置的取向性以及支架的材料、結構特點進行分析，總結在軟骨修復領域中的應用研究，旨在為靜電紡絲能進一步用于臨床研究提供參考。

1 靜電紡絲技術概括

1.1 靜電紡絲技術原理

靜電紡絲技術是指聚合物流體在高壓靜電場作用下，使液滴狀聚合物克服表面張力而產生噴射細流，細流在噴射過程中拉伸、固化，最終形成直徑在幾十到幾百納米級纖維落在接受屏上。其基本原理可分為三個步驟[6]：(1)通過高壓電場的作用，射流和接受裝置之間形成一定的電位差，帶電的聚合物溶液或熔體被拉伸，在電場力的作用下，針狀前端的流體溶液會由半球狀變為錐形體(稱為泰勒錐，錐角一般為49.3°)。(2)當需要加載的電壓達到某個閾值Vc時，泰勒錐前端的流體溶液克服表面張力而直接進入電場中，形成細流，在毛細噴頭和接收板之間發生細流噴射。(3)溶劑蒸發或熔體由于降溫發生凝固，在接收網上得到無紡布狀的纖維氈(見圖1)。

圖1 靜電紡絲裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of electrospinning device

圖2 噴絲頭及接受裝置設計及其對納米纖維膜性能的影響[12]Fig.2 Effect of spinneret and receiving device design on the properties of nanofiber membrane[12]

靜電紡絲技術制備的納米纖維膜，具有纖維直徑小、比表面積大，孔隙率高，結構上能夠模擬天然細胞外基質，為細胞黏附、增殖提供便利條件[7]。靜電紡絲技術制備的納米纖維直徑、走向、形貌及導電性可依據不同功能需求，對電紡參數、噴射頭和接受裝置進行調控。因其獨特的可調控性能，靜電紡絲納米纖維膜在生物醫藥(手術縫合線、包扎繃帶、人造血管、組織工程支架、醫護服)、電子器件、濾材等領域具有極大的應用潛力[8]。

1.2 靜電紡絲裝置

靜電紡絲的實驗裝置主要包括三個部分，即高壓電源、射流裝置和接收裝置。高壓電源的主要功能是在噴絲裝置與目標電極之間形成一種強大的高壓電場；噴絲裝置中主要放置紡絲液，一般為聚合物或者無機物和聚合物雜化的混合物；接收裝置一般接地，也叫做目標電極，作用是提供負極，以便收集纖維。在靜電紡絲技術中的設備進展中，實驗裝置得以改進創新，不同形式的部件也成為了靜電紡絲制備納米纖維的影響因素[9-11]。比如接收裝置，從初始的靜態平面衍生至曲面收集板、可移動收集裝置、可旋轉收集器(圓柱形、平板狀或網格狀)、固定框架收集裝置、電極輔助收集裝置和水浴接收裝置等多種形式。

具體而言，改變接收裝置的體積大小以及形狀形貌對電場分布和纖維網形態均會產生影響。對于單孔靜電紡絲，得到的每個纖維的平均直徑也會隨著接收板占地面積的不斷增加而增大，且每個纖維分布的均勻性也將逐漸變差[12]。當一個接收裝置的面板形狀由圓形的平板變為圓形的鍋狀，可以充分改善圓形平面接收裝置表面電場中間大，邊緣小的物理特點，得到纖維氈中間部分厚度均勻的纖維網。且對于這種單孔式的小型靜電紡絲，圓鍋狀接收裝置還改善了紡絲區域內的電場分布，得到直徑更細的纖維。

1.3 靜電紡絲技術應用于軟骨修復支架的優勢

靜電紡絲技術利用高壓電源提供的電場力能直接連續地制備納米纖維，擁有相對低的成本和簡易的加工工程，這給予了支架研究實驗極大的方便。制備材料在常溫下進行，有利于生物活性因子之間進行復合，也能夠避免由于高溫導致的聚合物降解、支架結構損害等情況[13]。靜電紡絲材料來源廣泛，兼容天然高分子和合成高分子。可通過加工工藝和對材料調控，使其在機體中達到良好的生物相容性與降解性。趙文文[14]通過控制纖維膜的組成，結合體外預分化培養的手段，構建具有材料和細胞雙梯度的骨軟骨修復體，其中聚乳酸/明膠/透明質酸/硫酸軟骨素復合纖維膜具有最強的促軟骨分化能力，通過調整紡絲參數，可實現梯度合成，得到不同直徑和不同排列分布的纖維膜。支架作為組織工程的關鍵要素之一，主要發揮著臨時細胞外基質的作用，因此，支架的設計從結構到組成等方面都應盡量模仿天然細胞外基質的微環境[15]。從支架結構形貌上看，靜電紡絲技術制備的纖維支架在微觀尺寸與分布結構能更好地模仿天然ECM。

2 靜電紡絲技術在軟骨中的應用

軟骨組織工程中三個至關重要的因素分別為：種子細胞、支架與生物活性分子。其中，支架不但可以促進細胞的黏附、增殖和分化；支架負載的生物活性分子還能夠調控細胞功能，對軟骨組織的再生具有重要作用。相關研究表明[16]，用納米纖維構成的支架比表面積大，有利于促進細胞黏附；同時，納米纖維支架還為種子細胞提供了類似軟骨細胞外基質的網狀支撐結構，有利于軟骨組織的修復。近年來，常見的用于納米纖維制備方法有熱致相分離法、自組裝法及拉伸法等。綜合考慮可控性和適紡范圍及成本等客觀因素后，以上方法均有一定的局限性且產量較低，難以大規模生產。然而，靜電紡絲技術卻能克服上述方法的缺點，僅利用高壓靜電場便能直接連續地制備納米纖維。靜電紡絲各項參數的設置可精確地調控納米纖維支架的微觀形貌，從而更好地模擬天然細胞外基質結構，利于組織再生。

2.1 應用于軟骨修復的材料

用于靜電紡絲的理想支架材料應具備良好的生物相容性、可降解性、無毒性和生物活性，同時，還要具有一定的機械強度并能保持其形狀的可塑性。

2.1.1 天然生物材料

天然生物材料的生物相容性好，利于種子細胞黏附；易降解，能夠與組織再生保持動態平衡；并且毒副作用小，降解產物易吸收[17]，已成為組織工程支架材料中的研究熱點。

(1)膠原

膠原蛋白存在于哺乳動物的許多組織中，是細胞外基質的主要組成成分。膠原蛋白為細胞提供支持和保護，有利于細胞的黏附和增殖。同時，還具有良好的生物相容性和可降解性，以及很強的可塑性。但是，膠原的機械性能較弱，降解速率難以控制，成本高并且制作工藝復雜；這些缺點都限制了其單獨應用。 Kadir等[18]證明膠原蛋白具有調節免疫力的能力。基于膠原的半月板植入物(CMI)是修復半月板的首個支架材料。 CMI是一種可吸收的膠原蛋白支架，可在植入半月板缺損區域后在關節鏡下縫合。該技術的局限性在于它只能用于修復部分半月板缺陷。

(2)透明質酸

透明質酸是具有獨特分子結構的多糖聚合物，是軟骨基質的重要組成部分之一，可以促進軟骨的形成和維持。但其較弱機械性能使其在臨床應用中受到限制，往往與其他材料復合使用。有研究表明，將PCL(聚己內酯)與透明質酸結合使用可改善其機械性能；二者的結合物不僅有利于細胞增殖和粘附，而且細胞的I型和II型膠原蛋白以及蛋白聚糖也顯著增加。FU等[19]將透明質酸浸漬并包覆碳纖維網作為支架，培養成體兔骨髓間充質干細胞用以修復同種關節軟骨。實驗結果顯示，修復后的軟骨細胞含量高于對照組，并具有更強的機械強度。

(3)殼聚糖

殼聚糖是一種可降解的乙酰氨基聚多糖，其化學結構與氨基葡聚糖相似，故可作為細胞外基質成分應用于各類組織工程中。殼聚糖具有良好的親水性，利于細胞的黏附與增殖。同時，殼聚糖的生物相容性好、抗菌活性強。然而，殼聚糖的機械強度較弱，無法在受損區域承受壓力。并且，難以電紡和控制降解速率。目前，臨床上較常見的殼聚糖水凝膠，用以促進軟骨組織再生修復。Jia等[20]將殼聚糖與硫酸軟骨素結合為一個可直接注射殼聚糖水凝膠的支架，再將兔滑膜間充質干細胞(rbSF-MSC)完全避存于其內；結果顯示，其對兔軟骨損傷的修復效果顯著優于同期對照組。證明殼聚糖水凝膠支架具有優越的生物相容性，能夠有效修復兔股骨髁間滑車軟骨。

2.1.2 人工合成材料

人工合成材料的來源豐富，具有機械性能較好，降解速率快等優點，不足之處在于生物相容性較差和易引起人體內免疫系統的排斥反應。人工合成材料主要包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙酸內酯(PCL)等。其中，由前三種制成的醫療產品已獲得美國FDA許可，可用于臨床工作。

(1)聚乳酸(PLA)

PLA是一種降解半衰期為6～8周的合成高分子材料。機械性能和生物相容性良好，代謝產物水和二氧化碳及中間產物乳酸均對人體無毒性。Aval等[21]將兔肋關節軟骨膜來源修復細胞種植于PLA支架上，結果顯示，大部分兔關節缺損部分可觀察到與周圍軟骨相似的大量新生軟骨，證明PLA支架能夠有效支持軟骨組織的正常生長。但PLA支架的低生物相容性和易誘發免疫排斥等特性限制了其單獨應用。

(2)聚羥基乙酸(PGA)

PGA是一種代謝反應產物環保無毒的新型生物材料，生物相容性良好且可降解性高。卞繼超等[22]應用PGA支架材料復合肋軟骨來源軟骨細胞植于兔皮下，八周后發現PGA支架降解，軟骨組織基本形成且無明顯炎性和免疫排斥反應。

(3)聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)

PLGA是由乳酸和少量乙醇酸聚合而成的一種支架材料，目前已被廣泛應用于組織重建工程中。PLGA的生物相容性好，降解速率快慢可由PLA/PGA的含量比例調整。Kawk等[23]用血小板血漿預處理PLGA支架，再復合軟骨與PLGA支架用以修復裸鼠的半月板。實驗結果顯示，軟骨細胞在支架中附著均勻，具有良好的修復半月板效果。

2.2 復合材料

隨著材料科學的發展，研究人員意識到單一材料在軟骨再生中的應用不足。為了滿足理想支架的要求，學者逐漸選擇復合材料。通過組合不同的材料，新形成的復合材料可以綜合利用每種單一材料的優勢，從而獲得更好的機械性能，親水性和可降解率。有研究發現[24]，多層聚合物納米復合支架可模擬軟骨的結構設計和生物學特性，為細胞黏附和組織生長提供了適宜的微環境。Lee等[25]復合了兔軟骨細胞與纖維蛋白-聚氨酯支架材料，結果顯示，與未添加纖維蛋白的對照組相比，復合支架促進細胞增殖分化能力更強并能顯著提高細胞活性。將骨髓間充質干細胞種植于PLGA海綿/纖維蛋白凝膠支架后，再聯合基因治療也能有效修復軟骨缺損。

3 軟骨修復支架結構

細胞支架結構決定了支架的性能，支架結構按組成的材料種類可分為基礎支架和復合支架，也可按照結構層數的不同分為單層支架、雙層支架、多層支架。

3.1 基礎支架

基礎支架由同一種材料組成，通過靜電紡絲技術形成特定的結構層次，為單層支架。基礎支架無法同時提供多種細胞的生長環境，只能支持一種細胞繁衍。

3.2 復合結構

將兩種及兩種以上的具有生物互補特性、可降解性的材料按照一定的比例、排列方式通過靜電紡絲技術組合在一起的支架，在機械強度、孔隙率、微觀結構等方面有了提升，克服了單一材料帶來的缺點[26]。復合支架在軟骨修復方面的應用越來越多，是未來發展的趨勢。

3.2.1 多層復合結構

(1)合成聚合物復合支架

張康蘭[27]制備了靜電紡PLA/PCL 微納米纖維復合支架，將HaCaT細胞置于該支架上培養，一天后細胞在支架上有著更好的黏附狀態，兩天后細胞深入支架內生長，說明該支架具有良好的生物相容性。劉亞東[28]通過靜電紡絲技術制備了PGS-PCL 復合支架，體外接種兔骨髓間充質干細胞三天后發現細胞生長狀況良好。將BMSCs/PGS-PCL 細胞支架植入軟骨缺損部，手術12周后缺損處被新生的軟骨組織填充完好，說明該支架具有良好的兔膝關節缺損修復能力。

(2)天然—人工合成材料復合支架

單一材料無法滿足軟骨細胞的生長需要，為了模擬天然軟骨細胞基質結構，常用生物高分子材料與人工合成材料相結合，設計出一種雙層復合支架。聚乳酸是以乳酸為原料聚合得到的一種聚酯類聚合物，具有可降解性，絲素蛋白是一種天然高分子蛋白，具有良好的機械性能。Liu等[29]通過靜電紡絲技術制備出了PLA/絲素蛋白復合支架，該支架具有比較小的纖維直徑，較好的親水性，能夠有力支持軟骨細胞的黏附和擴散。Yao等[30]設計了一種支架，以膠原蛋白作為上層軟骨支架的材料，磷酸鈣作為下層骨支架的材料，模擬細胞外基質，將其植入兔子膝關節缺損獲得了良好的修復效果。

(3)生物活性分子復合支架

將生物活性物質、細胞因子轉載于支架之中，可促進細胞向軟骨細胞分化，也可誘導軟骨細胞加速增殖。陳偉明[31]運用靜電紡絲技術制備Gelatin/PLA 納米纖維復合支架，并將CS接枝復合支架的表面注入兔膝關節缺損處，實驗表明經過CS修飾的支架更利于骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化，而且與對照組相比能夠有效減少植入支架時炎癥的發生。研究表明[32]，生物活性物質還能夠提高細胞活性，誘導細胞進行定向分化。

3.2.2 三維多孔支架

傳統的靜電紡絲只是在二維空間上模仿天然細胞外基質的結構，缺乏相通的孔隙，而三維結構能夠模擬軟骨細胞的生長環境，使細胞進行有序地分布。張海濤[32]利用濕法靜電紡絲和冷凍干燥相結合的方法，制備了SF/PCL納米三維多孔支架，將小鼠胚胎成骨細胞接種在支架上，細胞的黏附增殖情況較好，七天后可觀察到細胞通過三維多孔向內部增殖且覆蓋支架表面。將靜電紡絲技術與冷凍干燥技術相結合制備出三維納米纖維多孔支架內部結構有相互連通的多孔結構，有助于細胞的增殖和滲透，機械性能好，抗壓強度和壓縮彈變性穩定。

4 結 語

靜電紡絲技術裝置簡單、成本低廉以及生產工藝高效可控，目前已發展為制備納米纖維材料的一個重要途徑。但將其應用于臨床之前仍有一些挑戰需要克服。首先，纖維結構調控方面如孔尺寸及機械強度等因素仍難以調控。其次，傳統的電紡纖維大多是簡單的二維結構，無法完全模擬天然軟骨組織的三維結構。若將靜電紡絲與3D打印技術結合則或許有望解決這一難題。總之，靜電紡絲纖維在軟骨再生中顯示出巨大的潛力，但在真正用于臨床之前還有很長的路要走。