基于聚A單鏈DNA模板合成金納米簇快速檢測化妝品中的氯霉素*

曾希珂，易 姿，楊麗霞，黃小貝，2，趙 佳

(1 長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410036；2 國家酒類產品質量檢驗檢測中心，湖南 長沙 410036)

氯霉素(CAP)是一種廣譜抗生素，具有殺菌消炎的作用，使用后能明顯改善皮膚狀態[1]。然而，長期使用添加氯霉素的化妝品會產生嚴重的副作用，可能引起皮疹、過敏等不良反應，表現為紅斑、水腫、糜爛、灼熱、脫屑等，還會誘發再生障礙性貧血、骨髓抑制[2-5]等疾病，對人體健康構成嚴重危害。因此，我國《化妝品安全技術規范》[6]規定氯霉素為化妝品禁用組分。目前，檢測化妝品中氯霉素的常用方法有高效液相色譜法[7-8]、液相色譜-質譜聯用法[9-10]、酶聯免疫法[11]等，這些方法可以實現對氯霉素高靈敏度檢測，但大都依賴大型精密貴重儀器，樣品前處理復雜，基質干擾較強，分析時間長，不利于快速篩查。因此，尋找一種簡單快速且可靠的方法檢測氯霉素具有重要意義。

貴金屬納米簇由于其發光效率高、合成簡便、低毒性及生物相容性好等優點，為生物傳感領域提供了一種新型高效的分析方法[12]。其中，金納米簇光學穩定性好、發光性能優良，具有廣泛的應用前景。Wang等[13]以聚A(腺嘌呤)為模板的單鏈DNA可以簡單快速的合成金納米簇，且發光性能良好。歐麗娟等[14]利用聚A單鏈DNA為模板合成金納米簇，建立了一種檢測汞離子的熒光方法，該方法簡單快速，靈敏度高，選擇性好。

基于此，本文利用聚A單鏈DNA為模板合成的金納米簇作為熒光探針，構建一種新的熒光生物傳感方法用于檢測化妝品中的氯霉素，以期為化妝品中氯霉素的快捷檢測提供參考。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

A30-DNA單鏈、氯金酸(HAuCl4)、10×PBS緩沖液：生工生物工程(上海)股份有限公司；

青霉素、頭孢氨芐、鏈霉素、卡那霉素、鹽酸林可霉素：USP級，生工生物工程(上海)股份有限公司；

五水合硫酸銅、檸檬酸三鈉、甘氨酸、精氨酸、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用水：超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)，超純水系統SMARTPLUS-N；

LS-55型熒光分光光度計，珀金埃爾默股份有限公司；

ME204電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 金納米簇的合成

取10 μmol/L A30-DNA模板40 μL，1 mmol/L氯金酸溶液60 μL，50 mmol/L檸檬酸鈉溶液100 μL混合后，加入800 μL超純水，最終反應總體積為1 mL。將混合液置于90 ℃水浴鍋里反應30 min后迅速放入4 ℃冰箱里避光保存，得到熒光金納米簇溶液。

1.3 檢測條件的優化

由于反應溫度、加入氯霉素的反應時間、緩沖液pH值是影響氯霉素檢測的重要參數，采用單一變量原則，對3個參數進行了優化。

1.3.1 反應溫度的優化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS緩沖液10 μL混合均勻成100 μL體系，考察反應溫度(5，15，25，35，45，55 ℃)對體系熒光強度的影響。

1.3.2 反應時間的優化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS緩沖液10 μL混合均勻成100 μL體系，考察加入氯霉素反應時間(0，1，2，3，4，5，6，7，8 min)對體系熒光強度的影響。

1.3.3 緩沖液pH值的優化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS緩沖液10 μL混合均勻成100 μL體系，考察緩沖液pH值(5，5.5，6，6.5，7，7.5，8)對體系熒光強度的影響。

1.4 氯霉素的檢測

按照1.2的方法合成熒光金納米顆粒，再按照1.3最優條件對終濃度為0，0.01，0.1，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0，400.0 μmol/L的氯霉素進行測定。使用熒光分光光度計測量熒光，激發波長290 nm，狹縫寬度10 nm，掃描范圍400～560 nm，發射波長475 nm。

1.5 氯霉素檢測的特異性

為了驗證方法的特異性，按照1.4的試驗方法對濃度為50 mmol/L的青霉素、頭孢氨芐、鏈霉素、卡那霉素、鹽酸林可霉素、甘氨酸、精氨酸等多種目標物進行測定，使用熒光分光光度計測量熒光。

1.6 樣品中氯霉素的測定

化妝品樣品前處理方法參照標準GB/T 24800.1-2009[15]略作修改：稱取1 g化妝品樣品置于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，超聲提取20 min后于渦旋混勻儀上混勻1 min，以6 000 r/min離心5 min，吸取1 mL上清液氮吹至干，加純水定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后用于樣品分析。采用標準加入法進行化妝品樣品中氯霉素的分析。

2 結果與分析

2.1 實驗原理

試驗方法的檢測原理如圖1所示，以聚A單鏈DNA為模板，氯金酸為金源，檸檬酸鈉為還原劑，將金離子還原成零價金后富集在聚A-DNA單鏈上，形成強熒光的金納米簇穩定存在于溶液中。加入氯霉素后，氯霉素與金納米簇結合，通過強吸電子作用阻礙電子轉移進程，從而淬滅金納米簇熒光強度，實現對氯霉素的檢測[16]。

圖1 基于聚A單鏈DNA模板金納米簇檢測氯霉素的原理圖Fig.1 Schematic of CAP detection based on A30-DNA template AuNCs

2.2 檢測方法的可行性

為了檢驗該方法用于化妝品中氯霉素檢測的可行性，即判斷氯霉素的加入對金納米簇熒光強度的影響，分別測定了氯霉素存在與不存在時金納米簇的熒光值。如圖2所示，不存在氯霉素時，檢測到強熒光值(a)，而加入氯霉素后，熒光值顯著降低(b)。由此表明該方法適用于氯霉素的檢測。

圖2 不同條件下A30-DNA模板金納米簇的熒光發射光譜圖Fig.2 Fluorescence emission spectra of AuNCs under different conditions

2.3 試驗條件優化

2.3.1 反應溫度的優化

如圖3所示，金納米簇的熒光強度隨溫度的升高先下降后升高，當溫度為25 ℃時，熒光強度最低。因此，選擇25 ℃為最佳反應溫度。

圖3 溫度對金納米簇熒光強度的影響Fig.3 The effect of temperature on the fluorescence intensity of AuNCs

2.3.2 反應時間的優化

如圖4所示，加入氯霉素后金納米簇的熒光強度迅速下降，當反應時間超過5 min后熒光強度趨于平穩。因此，選擇5 min為最佳反應時間。

圖4 時間對金納米簇熒光強度的影響Fig.4 The effect of time on the fluorescence intensity of AuNCs

2.3.3 緩沖液pH值的優化

如圖5所示，緩沖液pH值為5.5時，加入氯霉素后，金納米簇的熒光強度降到最低，因此，選擇pH值為5.5作為后續試驗的緩沖體系。

圖5 pH值對金納米簇熒光強度的影響Fig.5 The effect of pH on the fluorescence intensity of AuNCs

2.4 檢測方法的性能

在優化的試驗條件下，對0.01～400 μmol/L范圍內的氯霉素濃度進行了檢測，結果見圖6。由圖6(a)所示，隨著氯霉素濃度的增加，金納米簇熒光強度逐漸降低。圖6(b)顯示了氯霉素濃度與475 nm處的熒光強度之間的關系。在0.01～80 μmol/L的濃度范圍內，金納米簇熒光強度和氯霉素濃度之間呈良好的線性關系，線性回歸方程為：y=-3.419 5CCAP+318.88，線性回歸系數R2=0.996 6，根據空白響應的3倍標準偏差原則確定檢測限為7.0 nmol/L。

圖6 不同濃度氯霉素的熒光發射光譜圖Fig.6 Fluorescence emission spectra with different concentration of CAP

2.5 檢測方法的特異性

為了驗證檢測方法的特異性，檢測了其他可能產生干擾的抗生素、氨基酸、金屬離子、糖類等對金納米簇熒光強度的影響，結果如圖7所示。從圖7可以明顯看出，只有氯霉素能有效的淬滅金納米簇的熒光，其他干擾物對熒光強度基本無影響，說明該方法對氯霉素的檢測具有高選擇性。

圖7 傳感器的特異性Fig.7 Specificity analysis of the sensor for CAP

2.6 實際樣品分析

為探討化妝品實際樣品中氯霉素測定方法的可行性，對爽膚水、面膜、玻尿酸三種化妝品樣品采用標準加入法評價該方法的實用性，結果見表1，爽膚水樣品中，3個加標水平的平均回收率在98.22%～108.40%，相對標準偏差(RSD，n=6)為3.28%～8.82%；面膜樣品中，3個加標水平的平均回收率在98.12～105.28%，相對標準偏差(RSD，n=6)為2.32%～8.57%；玻尿酸樣品中，3個加標水平的平均回收率在98.55%～107.23%，相對標準偏差(RSD，n=6)為3.21%～7.57%，方法的準確度和精密度較好，可以用于樣品中氯霉素的檢測。

表1 實際樣品中氯霉素的加標回收率Table 1 Recovery of CAP in real samples

3 結 論

本研究以A30單鏈DNA為模板，制備了具有強熒光的金納米簇探針。基于氯霉素和金納米簇之間強的結合作用可以猝滅金納米簇的熒光，提出了以金納米簇為熒光探針快速檢測化妝品中氯霉素的方法。該方法選擇性好，靈敏度高，操作簡單快速，檢測成本低，時間短，在化妝品實際樣品中的檢測具有良好的應用前景。