離子色譜法測定嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖含量

赫秀萍，王 渤，劉 強

(1 通標標準技術服務(青島)有限公司，山東 青島 266101；2 賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 200120)

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一種具有天然屬性的功能性低聚糖[1]。在自然界中，動物乳汁中存在GOS較少，而人類的母乳含量則較多。低聚半乳糖可有效促進腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，顯著改善腸道菌群，改善人體腸道的消化吸收功能[2-4]。新生兒的消化功能比較薄弱，嬰幼兒乳粉中基本都會添加低聚半乳糖這一功能性低聚糖。

關于食品中低聚半乳糖的使用量和標識要求，我國也做了相應的規定。GB 14880-2012[5]《食品營養強化劑使用標準》允許低聚半乳糖作為營養強化劑在嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和配方食品中使用，但總量不超過64.5 g/kg。衛生部2008年第20號公告[6]批準低聚半乳糖作為新資源食品用于食品生產加工，使用范圍為嬰幼兒食品、乳制品、飲料、烘焙食品、糖果，使用量不大于12 g/天。GB 28050-2011[7]和GB 13432-2013[8]規定營養成分的實際含量不應低于相應標示值的80%。但是目前尚無嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖含量檢測的相關標準。

低聚半乳糖是由具有不同聚合度或同一聚合度但含有多個不同糖苷鍵異構體組成的寡糖混合物，分子結構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1～7個半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n=0～6，乳糖除外)，糖鏈中主要含有β-1，3、β-1，4和β-1，6半乳糖苷鍵[9]。低聚半乳糖組分十分復雜，現有技術無法制備其各個組分的標準品，所以不能完成各個組分的定量檢測。目前，國內外的檢測方法主要有薄層色譜法[10-11]、液相色譜法[12-13]和離子色譜法[14-15]等，其中而離子色譜法因為其靈敏度高、分離度好，在低聚半乳糖檢測中應用的越來越多。其中AOAC 2001.02[16]是目前應用比較廣泛的測定食品中低聚半乳糖含量的方法。但是由于該方法使用酶解，通過酶解前后的差值進行計算，當樣品中乳糖與低聚半乳糖的比例大于6時，測試結果存在較大誤差。而嬰幼兒乳粉中的乳糖含量約為50%，國產乳粉的低聚半乳糖添加量大多為0.5%～2%，所以不適用于嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖的檢測。邵琪[17]和葉滿香[18]使用低聚半乳糖原料作為標準品，通過乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)和成品粉的譜圖比對，選擇某個特征峰作為定量峰來計算低聚半乳糖的含量。此方法中未使用標準品，在選擇定量峰時有很大的主觀因素，結果也不統一。

本文綜合考慮以上關鍵問題，建立一種通過熱水提取，經凈化后的高效離子色譜-脈沖安培檢測方法。通過方法學驗證和大量實際樣品測試，所建方法能夠滿足嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖含量的檢測要求。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖(CAS：100430-40-8)，量子高科；6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖(CAS：645-03-4)，量子高科；低聚半乳糖原料(純度>57%，客戶提供)；乙腈(色譜純)，上海安譜科學儀器有限公司；50%NaOH溶液(色譜純)，美國sigma-aldrich公司；乙酸鈉(色譜純)，上海安譜科學儀器有限公司；Dionex OnGuardTMⅡ RP柱，美國Thermo Fisher公司；實驗室用水為Milli-Q系統純化水。

1.2 儀器與設備

ICS5000+離子色譜儀(配有脈沖安培檢測器)，美國Thermo Fisher公司；XS-205電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Centrifuge 5804高速離心機，德國Eppendorf公司；CP2600D超聲波清洗機，美國CREST公司；XW-80A渦旋混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；固相萃取裝置，美國sigma-aldrich公司；Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司。

1.3 方 法

1.3.1 標準溶液的配制

3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖和6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖標準品容量只有1 mg，采用直接溶解的方法配制標準溶液。在裝有標準品的小瓶內加入1 mL水，渦旋溶解后轉移至10 mL容量瓶，然后用水清洗小瓶兩次并將清洗液轉移至10 mL容量瓶，最終用水定容至刻度，制成濃度為100 mg/L的標準溶液。

準確稱取低聚半乳糖原料(按純度折算)10 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻后轉移至玻璃瓶中，(4±4)℃保存。精密移取上述溶液適量，用水稀釋成系列標準工作溶液，質量濃度分別為25、50、100、150、200 mg/L，臨用現配。

1.3.2 樣品處理

準確稱取樣品0.5 g(精確至0.001 g)于15 mL刻度離心管中，加水4 mL，振搖使溶解，60 ℃水浴超聲10 min。放置室溫后，加乙腈至刻度，搖勻。8 000 r/min離心2 min，取上清液1 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，過1.0 cc OnGuardTMⅡ RP柱(先用5 mL甲醇和5 mL水活化)，棄去前3 mL溶液，取續濾液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3.3 色譜條件

保護柱：Dionex CarboPac PA20(30 mm×3 mm)；色譜柱：Dionex CarboPac PA20(150 mm×3 mm)；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；流動相：A相為水，B相為200 mM NaOH溶液，C相為150 mM NaOH溶液+500 mM乙酸鈉溶液，D相為100 mM乙酸鈉溶液，流速和梯度洗脫程序見表1，檢測器：電化學檢測，金電極，標準糖電位。

表1 流速和梯度洗脫程序Table 1 Multi-step gradient and flow

2 結果與討論

2.1 定量峰的選擇

低聚半乳糖的組分復雜，現有技術無法獲得各個組分的標準品，況且不同廠家生產的低聚半乳糖中各組分含量也不相同，因此通過用各組分標準品來定量的方法是不現實的。隨著3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖和6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖兩個低聚半乳糖二糖標準品的研制成功，我們可以根據這兩個標準品的保留時間來選擇低聚半乳糖原料中的定量峰。結果顯示，低聚半乳糖原料中6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖組分含量較少，且色譜峰附近有干擾峰，不易定量。而3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖組分含量較高，是低聚半乳糖原料的幾個主要成分之一，且色譜峰附近干擾較小，可作為定量峰來使用，見圖1和圖2。

圖1 3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖標準品色譜圖Fig.1 Chromatography of 3-O-β-D-galactopyranosyl- D-glucopyranose

圖2 低聚半乳糖色譜圖Fig.2 Chromatography of GOS

2.2 色譜條件的優化

選擇Thermo CarbPac PA1(4 mm×250 mm)和Thermo CarbPac PA20(3 mm×150 mm)進行分離實驗。結果顯示，使用前者進行分離時，調整淋洗梯度也無法實現良好分離。而使用后者進行分離時，低聚半乳糖個組分峰形較好，信噪比更高。可能是PA1色譜柱柱容量小，適合分離單糖和雙糖類化合物；而PA20色譜柱的柱容量更高，在分離寡糖類化合物時靈敏度更好。通過優化淋洗梯度，定量峰與附近的色譜峰的分離度大于1.5，可滿足測試的需求。

2.3 凈化方法的選擇

乳粉的基質較為復雜，其中的蛋白質和脂肪含量較高，進入色譜柱前最好能將其除去。實驗室常用的蛋白質去除方式有乙腈沉降和亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等。由于我們使用的是離子交換模式，所以我們應該盡量避免離子的避免，因此選擇乙腈沉降蛋白。實驗初期未使用OnGuardTMⅡ RP柱進行進一步凈化，實驗發現測試20個樣品后柱效就會有所下降，定量峰與附近色譜峰不能達到分離度1.5的要求。而在使用OnGuardTMⅡ RP柱凈化后，測試50個樣品后柱效未降低，且離子色譜柱價格昂貴，綜合考量后使用OnGuardTMⅡ RP柱進行進一步凈化。

2.4 線性關系

量取質量濃度分別為25、50、100、150、200 mg/L的系列標準工作溶液，在優化的色譜條件下進行測定，以峰面積(Y)對相對的質量濃度(X，mg/L)繪制標準曲線。結果表明，目標物的線性關系良好，相關系數(r2)為0.999，滿足測試的需求。

2.5 檢出限和定量限的評定

參考GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中空白標準偏差法評估方法檢出限和定量限。具體操作如下：分別在10個乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)中加入低聚半乳糖制成含量為0.5 g/100 g的樣品，按本方法進行實驗，經測試后得到低聚半乳糖的含量，計算低聚半乳糖含量的3倍標準偏差即為方法檢出限，10倍標準偏差為方法定量限。結果見表2，該方法的檢出限為0.11 g/100 g，定量限為0.37 g/100 g。滿足國家標準中要求添加量的測試需求。

表2 檢出限和定量限Table 2 LOD and LOQ

2.6 回收率考察

以乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)為樣品進行加標回收實驗。準確稱取0.5 g(精確至0.01 g)樣品，添加低聚半乳糖原料，分別制成加標水平為0.5 g/100 g、1.0 g/100 g、2.5 g/100 g的樣品各6份，按本方法進行加標回收實驗。由表3可見，各加標水平下的平均回收率為87.5%～100.1%，相對標準偏差為2.1%～5.4%，方法的準確度和精密度均能滿足測試分析的要求。

表3 平均加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Average spiked recoveries (A.R.) and relative standard deviations

2.7 實際樣品測試

應用本方法對20個市售乳粉樣品進行檢測，結果見表4。結果表明所有樣品的檢測結果均與乳粉的標示值吻合，偏差在可接受范圍內，同時也反映了目前乳品企業均能按照國家要求進行生產。

表4 實際樣品低聚半乳糖含量測試結果Table 4 The concentration of GOS in actual samples

3 結 論

本文通過對前處理過程和色譜條件進行優化，選取了低聚半乳糖原料中的3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖組分作為定量峰，建立了測定嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖含量的離子色譜-脈沖安培方法。是首次使用標準品對乳粉中低聚半乳糖進行準確定性，解決了之前方法中存在的人為選取定量峰，定性不準的問題。該方法簡單快速，定量準確，經方法學驗證，本方法的檢出限、回收率、精密度等指標均滿足檢測要求，適用于嬰幼兒乳粉中低聚半乳糖含量的測定，是乳企進行內部質量控制的一個很好的選擇。