基于VSMCs在腹主動脈瘤發病機制中的研究進展

余玉勇 王 成 陳世玖

主動脈瘤(aortic aneurysm, AA)是血管壁永久性、局限性的擴張,是繼動脈粥樣硬化之后第二大最常見的主動脈疾病,占總體死亡原因的第9位[1]。腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是由多種病因引起并發生于腎動脈以下最常見的主動脈瘤疾病,起病隱匿而無明顯臨床癥狀,破裂后病死率極高,嚴重威脅患者的生命健康。目前,開放手術或主動脈腔內修復術(endovascular aortic repair, EVAR)是預防AAA破裂的主要治療手段,尚未發現可以防治AAA藥物應用于臨床[2]。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是血管壁中膜的主要細胞成分,其結構和功能的改變通過破壞血管壁的完整性,促進AAA的發病[3]。盡管AAA的發病機制復雜,但這種血管疾病的發展突出表現為VSMCs的逐漸喪失、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性增加及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)降解、炎癥顯著、表型轉換、活性氧水平升高、自噬缺陷和衰老增加[4, 5]。因此,全面深入地認識VSMCs的病理改變和調控機制在AAA發生及發展過程中的影響,有助于發現治療這種血管疾病的更多有效的藥物新靶點,對于在更早的時間點延緩或阻止AAA發展具有相當大的希望。

一、AAA中VSMCs的表型轉換

健康的VSMCs保持收縮/靜止(分化)表型,在響應外界環境刺激下誘導轉變為合成/增殖(去分化)表型。收縮表型VSMCs功能是保持血管的彈性并確保它們的收縮以維持血管張力,VSMCs表型轉換導致血管收縮功能的喪失,進而改變血管張力并增加主動脈壁應力以促進AAA的形成。

1.轉錄因子對VSMCs表型調控:VSMCs自身一系列特異性收縮基因表達的標志蛋白,包括平滑肌22α、SM-鈣調蛋白、α-肌動蛋白-2,轉錄過程主要受心肌素(myocardin, MYOCD)和血清反應因子(serum response factor, SRF)的調控[6]。MYOCD與含有順式作用元件(CArG盒)靶基因上的SRF結合,通過轉錄激活下游多種特異性收縮基因和表達高水平的收縮蛋白以維持VSMCs收縮表型。相反,Krüppel樣因子4(kruppel-like factor 4, KLF4)作為一種關鍵轉錄因子,其通過直接與G/C阻遏元件結合或抑制SPF和CArG盒結合等多種機制促進VSMCs收縮表型轉變為合成表型[7]。Wang等[8]研究表明,調控KLF4依賴性VSMCs表型轉換可以減輕血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)誘導的小鼠AAA。該研究指出,體外瞬時受體電位香草素5(the transient receptor potential vanilloid-5, TRPV5)過表達下調了VSMCs中KLF4表達,同時使AngⅡ誘導的VSMCs收縮蛋白水平下降及收縮表型向合成表型轉變。此外,與對照組比較,體內AngⅡ誘導ApoE-/-小鼠AAA的發生率及腹主動脈最大直徑在TRPV5治療后顯著降低。因此,針對這種轉錄因子對VSMCs表型轉換的調控機制,可能有助于今后AAA治療上的臨床應用。

2.非編碼RNA對VSMCs表型調控:非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指不編碼蛋白質的RNA,它的功能主要是通過調控表觀遺傳、轉錄及轉錄后過程而影響基因的表達。隨著研究的不斷深入,多種ncRNA在調控VSMCs表型轉換的作用逐漸被發現。微小RNA(microRNA, miRNA)是短的單鏈ncRNA,其功能是通過降解信使RNA或模仿小干擾RNA來抑制翻譯和負調節基因表達。研究發現,miR-126-5p可以直接靶向抑制VEPH1在VSMCs中的表達,促進收縮型VSMCs的轉換,進而限制AngⅡ誘導的ApoE-/-小鼠AAA直經的擴張[9]。同樣,在AngⅡ誘導的ApoE-/-小鼠AAA模型中,miR-23b也被證實具有抗AAA作用。miR-23b通過靶向抑制轉錄因子叉頭盒O4(forkhead box protein, FoxO4)在VSMCs中表達,促進收縮型VSMCs的轉換,從而維持血管穩態,限制AAA的擴張[10]。劉雪瓊等[11]研究還發現,miR-135b-5p過表達促進了脂多糖誘導的VSMCs的增殖及遷移,附子多糖和脂多糖共處理VSMCs后miR-135b-5p蛋白表達顯著下降,表明了附子多糖可能通過靶向抑制miR-135b-5p進而阻礙VSMCs向增殖表型轉換。此外,其他miRNA也參與VSMCs表型調控,如miR-143/145缺乏促進VSMCs鎖定在合成表型中,miR-24、miR-26a、miR-146a和miR-221/-222的表達可誘導VSMCs向合成/增殖表型轉變[12]。

此外,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)也被確定為VSMCs表型的調節因子,其作用機制目前尚不完全清楚,可能充當miRNA的“海綿”降低其對信使RNA的調節作用。研究發現,lncRNA SMILR可以通過調節有絲分裂CENPF mRNA驅動細胞周期進程,進而促進VSMCs增殖[13]。同樣,Cheng等[14]研究指出,膜聯蛋白A2(annexin A2, ANXA2)通過促進核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)p65的磷酸化,并與p65共易位進入細胞核導致VSMCs增殖、遷移和去分化,lncRNA LINC0028作為ANXA2上游的負性調節因子通過抑制ANXA2/NF-κB p65信號通路參與VSMCs表型轉換的調節。此外,CARMN、PEBP1P2、ANRIL及PVT1等其他lncRNA也被認為對 VSMCs表型轉換發揮重要調節作用。

以上這些表達異常的ncRNA通過促進或抑制VSMCs的表型轉換影響AAA的發生及發展,其具體調控機制目前并不明確,尚需開展進一步實驗研究。但可以確定的是,阻礙VSMCs向去分化表型轉換有助于維持血管彈性及血管張力,進而抑制 AAA的進展。

二、AAA中VSMCs的氧化應激

氧化應激定義為活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平異常升高,并通過多種機制促進AAA的發育。研究發現,人類AAA中ROS過量產生的主要來源是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)和解偶聯內皮一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS),ROS物質通過引起VSMCs炎癥、MMPs激活和細胞凋亡來促進AAA的發展[15～17]。Siu等[15]在一項將hph-1小鼠與NOX1、NOX2、NOX4及p47phox敲除小鼠雜交以產生雙突變體研究中,發現減少的超氧化物通過提高決定eNOS偶合/解偶聯開關的關鍵輔助因子四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, H4B)和NO的生物利用度,并保留內皮二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)的表達和活性重新偶合了eNOS,證實了NOX通過調節eNOS偶聯狀態以介導AAA的形成。此外,在動脈瘤患者中發現兩種人類NOX4突變體N129S和T555S與增加H2O2的產生有關,分析表明了NOX4可能通過產生更多H2O2作為中間體誘導內皮DHFR缺乏和eNOS解偶聯。該研究雖未闡明不同NOX異構體在AAA發病機制中的潛在相互作用,但抑制NOX信號來恢復eNOS偶聯活性機制為防治AAA提供了新線索。此外,在將AngⅡ輸注到DHFR基因敲除小鼠體內的研究中,發現DHFR缺乏/eNOS解偶聯/線粒體功能障礙級聯參與了介導AAA的形成,用Mito-Tempo體內清除線粒體ROS在消除AAA的發展上完全有效,表明靶向線粒體ROS可能作為治療與內皮DHFR 缺乏和eNOS解偶聯相關的AAA新治療選擇[16]。

近年來,有研究證實了TGF-β/NOX4/DHFR/eNOS解偶聯/TGF-β軸是在馬方綜合征胸腹主動脈瘤形成中的新前饋通路,抗TGF-β和葉酸靶向此軸的前饋信號可減弱Fbn1C1039G/+小鼠主動脈瘤的形成[18]。以上研究均表明了氧化應激是介導AAA形成的一個重要病理過程, NOX、DHFR、eNOS解偶聯、線粒體功能障礙四者之間的調控機制為AAA的防治開辟了一個新的研究方向。

有研究發現,AngⅡ誘導的小鼠主動脈VSMCs NOX4水平增加直接促進了基因工程轉基因小鼠主動脈擴張,并表明了這種過度的氧化應激可能部分通過上調骨橋蛋白促進了AAA的進展[19]。此外,Hsu等[20]利用一氧化碳釋放分子2抑制人VSMCs NADPH氧化酶和線粒體衍生的ROS產生,逆轉了由Ang Ⅱ誘導的IL-6/Jak2/Stat3 途徑相關的血管壁炎癥及減少MMPs水平,進而防止了AAA的進展。盡管這些研究中ROS如何產生以及ROS如何影響VSMCs生物學的實際機制尚不完全清楚,但過量的ROS會導致VSMCs功能障礙以及隨后AAA發展中的主動脈壁破壞。因此,VSMCs氧化應激調控的分子機制也是AAA研究中又一值得關注的領域。

三、AAA中VSMCs炎癥和MMPs

1.VSMCs炎癥:AAA是以各種細胞因子及MMPs過表達為特征的慢性炎性疾病。炎癥總是存在AAA病變中,作為對血管損傷的免疫反應,肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞、B細胞及T細胞等免疫細胞均被證明參與了AAA形成[21]。然而,VSMCs本身不是典型的炎性細胞,在應激狀態下(如衰老、高血壓、動脈粥樣硬化)可被激活成具有和單核-吞噬細胞相似的功能,通過分泌多種促炎性細胞因子(如IL-6、MCP-1、IL-1β和TNF-α)和趨化因子將炎性細胞募集到主動脈壁進一步加重主動脈壁局部炎癥,促進AAA的進展。據報道,哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、JAK/STAT、NF-κB、TGF-β/Smad、平滑肌特異性NOX4及SMARCD1偏碼基因BAF60a等信號通路的激活促進了VSMCs炎癥和主動脈瘤進展,而過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)、Rho GTPase激活蛋白18和Nrf2-Keap1信號等在內的信號通路通過抑制促炎型VSMCs表型減輕血管炎癥和防止AAA進展[5,19,22,23]。雖然VSMCs炎癥與AAA聯系的具體機制難以捉摸,但以上研究充分說明這些信號通路在驅動或抑制VSMCs炎癥的作用,了解這些信號通路對VSMC炎癥調控機制將可能作為預防和治療AAA的潛在治療靶點。

2.VSMCs中的MMPs:在健康血管中,VSMCs產生的彈性蛋白和膠原蛋白以抵抗血管舒張和破裂,并通過協調MMPs/TIMPs比率來控制ECM的完整性和降解。TIMPs作為MMPs的特異性抑制劑,對AAA的進展起到重要保護作用。然而,處于合成型的VSMCs通過抑制TIMPs表達而增加MMPs活性,誘導ECM中彈性蛋白和膠原蛋白降解,導致主動脈壁退化,促進AAA的形成和最終破裂[3]。目前,來自VSMCs的幾種MMPs(包括MMP1、2、9、13和14)對彈性蛋白和膠原蛋白發揮蛋白水解活性,在AAA發生、發展中促進ECM降解和削弱主動脈血管壁是必不可少的[12]。

四、AAA中VSMCs衰老和自噬

1.VSMCs衰老:研究發現,衰老的VSMCs可以釋放多種促炎性細胞因子和基質降解分子,如MCP-1、IL-6 和MMP2,促進 AAA的形成[24]。AAA患者來源的VSMCs檢測到老化細胞及衰老相關蛋白p21、p16表達均顯著升高,煙酰胺磷酸核糖轉移酶通過阻礙VSMCs老化發揮抑制AAA進展作用[25]。這些研究表明了衰老的VSMCs更容易受到病理刺激,導致老年患AAA的風險增加,延緩VSMCs衰老可能作為防治AAA的一種有效手段。

在哺乳動物中廣泛表達的sirtuins家族,由Sirt1～7 7個成員組成,被認為是目前抗衰老治療最有希望的靶點。在人類AAA樣本和老年小鼠腹主動脈中觀察到Sirt1的表達和活性明顯降低,對VSMCs特異性Sirt1敲除和轉基因小鼠研究均表明,Sirt1通過抑制AngⅡ和CaCl2誘導AAA小鼠模型中的p21和 NF-κB途徑顯著減弱血管細胞老化和炎癥,從而阻礙AAA的形成[26]。同樣,Tao等[27]研究指出,miR-199a-5p過表達通過靶向抑制VSMCs Sirt1加重了AngⅡ誘導的VSMCs衰老,并分析表明AngⅡ激活的miR-199a-5p/Sirt1通路可能是誘導VSMCs衰老和AAA的形成新分子機制。該研究并未排除AAA患者中其他上調的miRNA是否介導VSMCs衰老,對于介導VSMCs衰老的潛在機制還需多角度進行深入探討。

2.VSMCs自噬:自噬是細胞代謝和穩態的關鍵調節因子,在維持正常的血管細胞功能方面發揮著關鍵作用。研究發現,通過特異性敲除VSMCs中自噬蛋白7(autophagy protein 7, ATG7)加劇了AngⅡ治療后小鼠腹主動脈重塑[28]。此外,自噬在AngⅡ誘導的主動脈瘤VSMCs中被激活,敲除VSMCs中自噬蛋白5(autophagy protein 5, ATG5)減少了自噬體的產生,同時增加了VSMCs細胞凋亡及AngⅡ誘導動脈瘤小鼠模型中的血管炎癥[29]。這種特異性敲除VSMCs自噬蛋白機制,表明了自噬對于維持VSMCs的穩態至關重要。

五、AAA中VSMCs凋亡

VSMCs凋亡削弱了它們產生結締組織和修復彈性蛋白斷裂的能力,導致主動脈壁薄弱,促進了AAA的發生、發展。因此,闡明介導VSMCs的凋亡途徑可能為開發靶向VSMCs的藥物以及維持患病主動脈中正常的VSMCs數量和功能提供幫助。

1.VSMCs細胞凋亡:細胞凋亡是由線粒體凋亡途徑(內在途徑)和死亡受體(外在途徑)介導的一種進化上保守的細胞死亡途徑。VSMCs是血管壁的主要細胞構成成分,AAA形成過程中VSMCs細胞凋亡是主動脈壁VSMCs丟失的主要原因,抑制VSMCs細胞凋亡將是治療AAA的重要關注事件。

研究發現,TIMP-3通過靶向抑制p38信號通路的激活介導的人VSMCs細胞凋亡,促進人VSMCs細胞增殖能力,在AAA形成過程中發揮保護作用[30]。同樣,發現 2-羥丙基-β-環糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HPβCD)通過激活自噬主要調節因子轉錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)依賴性方式上調Bcl-2,抑制了β-氨基丙腈和AngⅡ誘導的VSMCs細胞凋亡,阻礙了AAA的發生、發展[31]。此外,在研究ncRNA在調節VSMCs凋亡和AAA發展中的作用時發現,lncRNA H19通過將轉錄因子特異性蛋白1募集到啟動子區域來誘導HIF-1α的轉錄,后者表達增加促進了AngⅡ和豬胰彈性蛋白酶誘導的AAA動物模型中VSMCs凋亡,而敲低H19可以有效抑制這種影響[32]。同時,H19還可直接與miR-148b相互作用并抑制其表達,從而調節ox-LDA刺激的人主動脈VSMCs中的Wnt/β-catenin信號通路并發揮抗細胞凋亡作用[33]。近年來一項研究表明,circ-0092291過表達通過靶向miR-626/COL4A1信號軸來抑制AngⅡ誘導的人主動脈VSMCs細胞凋亡、減輕血管炎癥和ECM降解,進而改善AAA進展[34]。盡管ncRNA亞類在動物模型和人體樣本中調節VSMCs細胞凋亡的機制不同,并且這些亞類在很大程度上仍未得到研究,但這些研究發現強調了VSMCs細胞凋亡是AAA發展中的一個重要病理事件。

2.VSMCs壞死性凋亡:壞死性凋亡是另一種程序性細胞死亡,是AAA發展過程中VSMCs數量減少的另一細胞死亡機制。這種機制被認為是通過死亡受體的配體(如細胞因子)激活受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP1)的激酶活性,后者介導RIP3和MLKL兩種關鍵的壞死性凋亡下游介質的激活,進而誘導細胞死亡。研究發現,在人類AAA樣本和彈性蛋白酶誘導的AAA小鼠模型中,介導壞死性凋亡的關鍵蛋白RIP1、RIP3表達水平升高(尤其是VSMCs層明顯),使用necrostatin-1抑制RIP1或RIP3基因缺失可改善彈性蛋白酶誘導小鼠模型AAA的疾病進展,表明了RIP1/3 是主動脈VSMCs壞死性凋亡的誘導劑[35]。此外,Zhou等[36]研究指出,混合譜系激酶結構域樣假激酶(mixed lineage kinase domain-like pseudokinase, MLKL)、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)兩者的激活在體內外均參與了RIP3依賴性介導VSMCs壞死性凋亡。該研究發現,MLKL和CaMKⅡ在CaCl2誘導的小鼠AAA模型中均被磷酸化,通過沉默MLKL觀察到CaMKⅡ的磷酸化受抑制,表明MLKL可能作為CaMKⅡ的上游信號參與AAA的發病機制。此外,通過TNF-α加zVAD處理誘導的VSMCs壞死性凋亡,進一步分析表明,這種細胞死亡結果是通過激活RIPK3-MLKL-CaMKⅡ信號軸介導的。盡管知識有限,但人們越來越關注靶向細胞死亡途徑作為AAA治療的新方法。

六、展 望

AAA的發病過程是一個復雜、動態的過程,是主動脈疾病重要的死亡原因。遺憾的是,沒有特定的藥物可以預防或逆轉AAA在臨床試驗中被證明是有效的。目前,手術治療是預防主動脈瘤破裂唯一的手段,但又具有患者進行手術的可行性、術后相關并發癥等不同的局限性,僅靠手術治療遠非理想。在人和動物模型的AAA病變研究中,主動脈血管突出表現為VSMCs的逐漸喪失、表型轉換、ROS水平升高、炎癥顯著、MMPs活性增加、自噬缺陷及衰老增加,這些病理機制之間甚至相互串擾共同促進AAA的發生、發展,抑制這些病理改變恢復VSMCs結構和功能對于延緩或阻止AAA的進展具有重要作用。然而,雖然大量關于VSMCs病理改變及相關信號通路的研究為AAA的防治提供了多方向的策略與藥物設計靶點,但許多詳細機制仍然來自動物模型,考慮不同動物模型與人類狀況和病理生理學的相關性差異,如何全面克服這些不足,在今后治療AAA的臨床應用中仍然是一個挑戰。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。