氯化鈷模擬低氧條件下紅景天苷對小鼠成骨細胞的調節作用

羅婷 祁琳 李杰 薛文舒 田晨晨 曹清文 王越

基金項目：1.天津伊特生命科學研發有限公司項目（編號：HX2023-7）；2.天津市自然科學基金重點項目（編號：18JCZDJC33200）；3. 天津中醫藥大學研究生創新基金（編號：ZXYCXLX202119、ZXYCXLX202213）

作者簡介：羅婷（1989.5-），女，湖南湘潭人，碩士，主治醫師，主要從事口腔種植外科研究

通訊作者：王越（1968.8-），女，天津人，博士，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合抗骨丟失分子機制的研究

摘要：目的? 研究氯化鈷（CoCl2）模擬的低氧條件下紅景天苷（SAL）對小鼠成骨細胞的調節作用。方法? 用CoCl2模擬低氧條件（1%O2），建立體外低氧模型。采用MTS法研究低氧條件下不同濃度SAL對MC3T3-E1細胞增殖的影響，磷酸苯二鈉法研究低氧條件下SAL對MC3T3-E1細胞分化的影響，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）、Western blot及ELISA技術檢測低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、下游靶基因血管內皮生長因子（VEGF）mRNA及蛋白表達水平。結果? 確定用0.5 mmol/L的CoCl2來模擬低氧（1%O2）環境。低氧可明顯抑制MC3T3-E1細胞的增殖及分化。經SAL預處理后，可顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖及分化，其中SAL（10 nmol/L）可顯著上調HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平及HIF-1α的蛋白表達水平，并下調VEGF蛋白的表達。結論? 低氧條件下SAL促進小鼠成骨細胞增殖與分化。其具體機制有待進一步研究，可能與HIF-1α/VEGF信號通路有關。關鍵詞：紅景天苷；成骨細胞；增殖；分化；骨結合；HIF-1α/VEGF通路

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.019

文章編號：1006-1959（2024）09-0101-06

Regulatory Effect of Salidroside on Mouse Osteoblasts Under Hypoxic Conditions Simulated

by Cobalt Chloride

LUO Ting1，QI Lin2，LI Jie1，XUE Wen-shu3，TIAN Chen-chen3，CAO Qing-wen3，WANG Yue3

（1.Department of Stomatology，General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China;

2.Department of Pharmacy，Characteristic Medical Center of PAP，Tianjin 300162，China;

3.School of Integrative Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract：Objective? To study the regulatory effect of salidroside （SAL） on mouse osteoblasts under hypoxic conditions simulated by cobalt chloride （CoCl2）.Methods? CoCl2 was used to simulate hypoxic conditions （1%O2） to establish an in vitro hypoxic model. MTS method was used to study the effect of different concentrations of SAL on the proliferation of MC3T3-E1 cells under hypoxic conditions. The effect of SAL on the differentiation of MC3T3-E1 cells under hypoxic conditions was studied by disodium phenyl phosphate method. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）， Western blot and ELISA were used to detect the mRNA and protein expression levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and downs.Results? 0.5 mmol/L CoCl2 was used to simulate the hypoxic （1%O2） environment. Hypoxia could significantly inhibit the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. After pretreatment with SAL， the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells were significantly promoted. SAL （10 nmol/L） significantly up-regulated the mRNA expression levels of HIF-1α and VEGF and the protein expression level of HIF-1α， and down-regulated the expression of VEGF protein.Conclusion? SAL promotes the proliferation and differentiation of mouse osteoblasts under hypoxia. The specific mechanism needs to be further studied， which may be related to the HIF-1α/VEGF signaling pathway.

Key words：Salidroside;Osteoblasts;Proliferation;Differentiation;Osseointegration;HIF-1α/VEGF pathway

口腔種植術后容易導致手術區域血供不足、微循環受阻，從而出現術區的低氧環境。術區牙周組織的低氧，致使周圍骨穩態失衡，導致骨量的損失，最終引起種植體的松動或脫落。如何促進種植區新骨形成和避免種植區牙槽骨的吸收萎縮，對于種植體繼發性初期穩定性具有重要的臨床意義。紅景天苷（salidroside， SAL）是藏藥紅景天主要活性成分，具有抗缺氧、促血管新生、抗骨質疏松、抗細胞凋亡、抗癌、抗炎、抗衰老、抗疲勞、抗缺氧、抗纖維化、抗病毒、等多種藥理作用[1，2]。低氧條件下骨組織通過血流再分配、增加無氧代謝等代償反應來適應低氧微環境[3]。低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha， HIF-1α）對組織的缺氧比較敏感，可在特異性缺氧狀態下迅速發揮活性。HIF-1α是細胞缺氧的重要指標之一，在血管新生、骨改建、炎癥反應等多種生理和病理過程中均有表達，通過活化下游靶基因血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）來調節骨改建。VEGF是促進骨組織周圍血管新生的主要細胞因子。本課題組前期研究發現[4，5]，常氧條件下SAL促進成骨細胞的增殖、分化以及HIF-1α依賴的VEGF的表達。王潔等[6]的研究發現，低氧通過激活HIF-1α/VEGF通路，促進牙周組織成骨能力。持續的缺氧通過調控c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）和核因子κB抑制蛋白α磷酸化抑制破骨細胞分化和骨吸收[7]。而低氧環境下SAL是否通過激活HIF-1α信號通路調節成骨細胞增殖與分化功能從而調節骨重建的研究少見報道。本研究以小鼠成骨細胞MC3T3-E1為細胞模型，進一步研究CoCl2模擬的低氧條件下SAL對其影響，旨在為促進種植骨結合的藥物治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要試劑? SAL：中國藥品生物制品鑒定所（純度99.9%）。CoCl2：美國Sigma公司（純度＞92.5%）。胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）及DMEM高糖培養基：美國GIBCO公司。乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）及羥乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic， HEPES）：美國Sigma公司。青鏈霉素混合液：南京凱基生物科技公司。胰蛋白酶及二甲基亞砜（Dimathyl sulfoxide， DMSO）：北京索萊寶科技有限公司。MTS細胞增殖與毒性檢測試劑盒：上海貝博（BestBio）公司。堿性磷酸酶（AKP）測試盒：南京建成生物工程研究所；引物：南京金思特科技公司。Trizol Reagent：美國Invitrogen公司。cDNA合成試劑盒及RT-qPCR擴增試劑：上海Yeasen生物技術公司。HIF-1α及VEGF引物：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。BCA蛋白定量試劑盒、HiFi Script cDNA Synthesis Kit：康為世紀生物科技有限公司。HIF-1α抗體（ab2185，1∶1000）：Abcam公司。VEGF試劑盒：天津伊特生命科學研發有限公司。

1.2主要儀器? SW-CJ-1F醫用型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術公司。Forma 3111 CO2培養箱：美國forma公司。實時熒光定量PCR儀及酶標儀：美國Bio-Rad公司。

1.3細胞系和細胞培養? 小鼠成骨細胞MC3T3-E1購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。使用加入含有雙抗（100 IU/L青霉素及100 μg/ml鏈霉素）的10% FBS DMEM高糖培養基培養。其置于CO2孵箱（37 ℃，5%CO2）中培養，隔天換液。

1.4低氧模型及CoCl2模擬低氧模型的建立

1.4.1低氧模型的建立? 取對數生長期的小鼠成骨細胞MC3T3-E1消化后接種到培養皿中，待細胞飽和度達到80%左右，更換1% FBS DMEM高糖培養基使細胞同步化24 h。然后將細胞放入低氧罐中密封培養，同時通入40 min的混合氣體（1%O2），最后放入孵育箱培養24 h。

1.4.2 CoCl2模擬低氧模型的建立? 取對數期細胞接種。在細胞同步化24 h后加入不同濃度CoCl2（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L），隨后放入CO2孵箱培養24 h。用MTS法檢測細胞增殖活性，Western blot法檢測關鍵蛋白HIF-1α的表達變化，按說明書比例配制含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解后按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定樣品濃度。隨后進行SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉孵育后顯影，用Image J分析條帶，使用GraphPad Prism 9作圖。

1.5 MTS法檢測MC3T3-E1細胞增殖活性? 取對數生長期的MC3T3-E1接種于96孔培養板上。24 h后，更換1% FBS DMEM高糖培養基。設對照組、CoCl2組（0.5 mmol/L）及SAL干預組（0.1、1、10、100、1000、10 000 nmol/L）。每組均設5個復孔。藥物作用24 h后，CoCl2組和SAL干預組加入CoCl2，作用24 h。結束前4 h，避光加入MTS，置于CO2孵箱中培養4 h。4 h后，應用酶聯免疫檢測儀，測量各孔波長492 nm的吸光度（A492）。

1.6 ALP法檢測MC3T3-E1細胞分化活性? 細胞處理同前，每組均設2個復孔。SAL干預組分別加入相應濃度的SAL，分別作用2、6、9、12 d。培養結束前24 h加入CoCl2。0.01 mol/L PBS緩沖液漂洗細胞3次，吸干。其次加入0.1% Triton X-100，用移液器充分吹打，作用3 min，收集入1.5 ml Ependorf管中。然后低溫下用細胞超聲破碎儀破碎細胞，1500 rpm離心10 min。最后取上清液作為細胞內ALP活性測定的標本。按照說明書使用堿性磷酸酶試劑盒進行ALP活性測定。

1.7 RT-PCR法檢測HIF-1α及VEGFmRNA表達水平? 取對數生長期的MC3T3-E1細胞調整濃度后接種在6孔培養板中。實驗共分對照組、CoCl2組和SAL干預組（終濃度10、100、1000、10 000 nmol/L）。用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書將RNA逆轉成cDNA備用，最后使用RT-qPCR擴增試劑在實時熒光定量PCR儀中將cDNA擴增，記錄結果。目的基因數據用內參基因β-actin矯正后，用Graphpad prism 9軟件作圖。

1.8 Western blot法檢測HIF-1α蛋白表達水平? 用Western blot法檢測加入SALHIF-1α蛋白表達水平。處理同上，引物見表1。

1.9 ELISA技術檢測VEGF蛋白表達水平? 收集對照組、CoCl2組和SAL干預組（終濃度10、100 nmol/L）細胞上清液。按照ELISA試劑盒說明書繪制標準曲線，依次加入樣品，每個樣品設置３個復孔，酶標儀檢測OD值，檢測上清液中VEGF表達量。

1.10統計學方法? 實驗數據均采用SPSS 21.0以及GraphPad Prism 9進行統計學分析及圖表處理。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異有統計學意義，P＜0.01表示統計學意義顯著。

2結果

2.1 CoCl2模擬低氧模型的建立? 與對照組相比，低氧（1%O2）抑制小鼠成骨細胞MC3T3-E1的增殖。選擇不同濃度CoCl2（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）模擬低氧條件，結果顯示，0.5 mmol/L CoCl2與低氧組（1%O2）對MC3T3-E1細胞增殖及HIF-1α蛋白表達的影響相近，見圖1，故選擇作為模擬低氧的濃度。

2.2 CoCl2模擬低氧條件下SAL對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖活性的影響? 與以上結果一致，低氧可抑制MC3T3-E1細胞的增殖（P＜0.05）。SAL（0.1、1、10 nmol/L）可以促進MC3T3-E1增殖（P＜0.05）。其中以10 nmol/L促增殖作用最為顯著（P＜0.01）。而高濃度的SAL（1000、10 000 nmol/L）則抑制MC3T3-E1細胞的增殖活性（P＜0.05），見圖2。

2.3 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對小鼠成骨細胞MC3T3-E1分化的影響? ALP是成骨細胞早期分化的特異性標志酶之一。檢測細胞上清液中的ALP活性可間接反映成骨細胞的分化程度。本研究進一步檢測了SAL對小鼠成骨細胞MC3T3-E1分化的影響。結果顯示，CoCl2模擬的低氧可抑制小鼠成骨MC3T3-E1細胞分化（P＜0.01）。與CoCl2組相比，低氧條件下SAL作用2 d后，MC3T3-E1細胞ALP活性增加，延長作用時間至6、9、12 d后，SAL對ALP活性的影響更加顯著，見圖3、圖4。提示低氧條件下SAL對MC3T3-E1細胞ALP的升高作用可能具有時間依賴性，但還需進一步驗證。

2.4 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對小鼠成骨MC3T3-E1細胞HIF-1α/VEGF信號通路的影響? 誘導低氧基因和修復細胞內微環境是HIF-1α主要功能之一。本研究進一步研究了CoCl2模擬的低氧條件下SAL對小鼠成骨細胞MC3T3-E1 HIF-1α及其下游效應分子VEGF的基因表達影響。CoCl2組HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表達水平較其對照組顯著上調（P＜0.01），SAL干預組HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表達水平較低氧組上調，其中SAL（10 nmol/L）作用明顯（P＜0.05），見圖5，提示CoCl2模擬的低氧條件下SAL能夠激活HIF-1α/VEGF信號通路。

2.5 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對HIF-1α/VEGF信號通路相關蛋白表達影響? 為進一步驗證CoCl2模擬的低氧下SAL對成骨細胞HIF-1α通路關鍵蛋白表達的影響，采用Western blot法檢測SAL預處理后HIF-1α蛋白表達的變化。與CoCl2組相比，SAL干預組HIF-1α蛋白表達水平上調，且當SAL濃度為10 nmol/L最為明顯（P＜0.05）。使用ELISA法測定加入濃度為10～100 nmol/L SAL的上清液中VEGF的表達，見圖6。結果顯示：CoCl2模擬的低氧條件下VEGF蛋白表達增加，加入SAL后對其蛋白表達有一定抑制作用。

3討論

骨結合即種植體表面與周圍骨組織的直接結合，兩者界面之間無纖維組織長入。骨結合是種植手術成功的基礎。基于目前研究顯示[8，9]，促進種植體骨結合的基礎研究方法主要包括調節骨代謝、種植體表面改性、干細胞相關療法和調節骨免疫微環境等。種植體周圍的成骨細胞與破骨細胞的骨穩態直接影響骨結合。種植術后常見的微血管供應不足會導致組織缺氧，從而影響骨重建。基于SAL抗缺氧、促血管新生及抗骨質疏松等多種藥理作用[1，2]，本實驗利用CoCl2來模擬細胞體外的低氧環境。運用MTS比色法檢測低氧條件下SAL對成骨細胞增殖的影響，此方法具有重復性好、靈敏度高和操作簡便等特點，可反映存活細胞的數量。實驗結果證明，CoCl2模擬的低氧抑制小鼠成骨細胞的增殖，SAL預處理后促進小鼠成骨細胞的增殖。

成骨細胞的分化為礦化提供骨基質，促進骨重建過程中新骨的形成。ALP是反映成骨細胞的活化及骨形成的特異性標志酶。成骨細胞活性增加，則ALP的合成和分泌增加。ALP是一種外分泌性糖蛋白，可作為成骨細胞早期分化的標志酶。檢測細胞上清液中的ALP活性，即可間接反映出成骨細胞分化成熟程度[10，11]。本實驗結果顯示低氧條件下成骨細胞分化受到抑制，這與高文魁等[12]的研究結果一致。劉紫杉等[13]的研究發現，125 μmol/L CoCl2作用MC3T3-E1 48 h后，促進成骨細胞分化，提示CoCl2濃度及作用時間對成骨細胞的分化影響可能不一致。CoCl2模擬的低氧條件下加入SAL則能促進成骨細胞分化。

細胞能依靠氧感受器和信號轉導通路特異地調節相應基因或蛋白的表達來適應低氧環境[14]。機體在對外界低氧的應答過程中HIF-1α發揮了核心作用。HIF-1α對于機體組織的急性缺氧的恢復的十分關鍵的。HIF-1α通過上調與血管生成相關蛋白的基因表達，如VEGF及其受體，增加血流量，降低組織損傷[15]。HIF-1α/VEGF在調節骨代謝過程中發揮重要作用[16]。目前普遍認為HIF-1α是上調VEGF的主要調節因子[17]。VEGF是一種多功能糖蛋白，分布于血管附近的細胞，促進血管內皮細胞的生長，從而達到促進血管生成的作用[18]。在骨形成早期階段，VEGF被分泌釋放到細胞外并激活血管的生成，為骨重建區提供血供和氧氣[19]。VEGF可通過激活VEGFR-2的表達促進血管生成；同時還可以通過激活VCAM-1的表達促進細胞的黏附與增殖[20]。本實驗中CoCl2模擬的低氧條件下SAL可顯著上調小鼠成骨MC3T3-E1細胞HIF-1α、VEGF mRNA和HIF-1α蛋白的表達量，而VEGF蛋白表達量降低。所以HIF-1α蛋白質翻譯修飾后與其它相關蛋白間如何相互作用，影響VEGF mRNA翻譯的相關因素，以及低氧條件下信號轉錄的精確過程還需進一步研究。提示低氧條件下SAL促進成骨細胞的增殖與分化的具體機制尚待進一步研究。

綜上所述，0.5 mmol/L CoCl2模擬的低氧條件下，SAL促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1的增殖與分化。其具體的調控機制有待進一步研究以利于SAL用于調整種植術后骨重建。

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收稿日期：2023-07-28；修回日期：2023-08-22

編輯/肖婷婷