脂肪干細胞及其衍生物促慢性創面愈合的研究進展

王一 龔思宇 姜篤銀

[摘要]慢性創面一直是臨床治療中十分棘手的難題。脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells， ADSCs）因來源豐富，分離簡單且容易擴增，多次傳代后仍能保持其生物學特性等優點，已成為近年組織修復與再生研究的熱點，利用ADSCs促進創面愈合也已被證明是一項十分具有前景的治療策略。本文對ADSCs及其無脂肪細胞衍生物促慢性創面愈合的研究現狀進行綜述，以期為今后深入研究和臨床應用提供參考。

[關鍵詞]脂肪干細胞；慢性創面；無脂肪細胞衍生物；糖尿病；組織修復與再生

[中圖分類號]R641? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）04-0179-04

Research Progress of Adipose-derived Stem Cells and Their Derivatives Promoting Chronic Wound Healing

WANG Yi1，2， GONG Siyu3， JIANG Duyin1，2

（1.Emergency Medical Center， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， Shandong， China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， Shandong， China; 3.Basic Medical College of Jining Medical University， Jining 272067， Shandong， China）

Abstract： Chronic wounds have always been a difficult problem in clinical treatment. Adipose-derived stem cells （ADSCs） have become a hot topic in tissue repair and regeneration research in recent years due to their rich sources， simple isolation and easy expansion， and their properties after multiple passages. The use of ADSCs to improve wound healing has proven to be a promising treatment strategy. In this paper， the research status of ADSCs and their fat cell derivatives for chronic wound healing is reviewed， with a view to providing insights for future in-depth research and clinical applications. In this paper， we reviewed the research status of ADSCs and its adipocyte free derivatives in promoting chronic wound healing， in order to provide insights for further research and clinical application.

Key words： adipose-derived stem cells; chronic wound; adipose cell-free derivatives; diabetes; tissue repair and regeneration

慢性創面會導致患者生活質量降低、殘疾甚至死亡，因此，慢性創面的修復是燒傷及整形醫師常面臨的棘手的臨床問題和重大挑戰，需要開發新的治療方法以改進現有治療手段。在各種干預策略中，干細胞是一種頗有前景的治療手段，其中ADSCs和骨髓間充質干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs）已在臨床前和臨床條件下進行了研究[1]。雖然研究人員很早便認識到ADSCs對創面修復的重要意義，但至今仍然無法對ADSCs在慢性創面愈合過程中的作用進行精確干預和調控。盡管如此，ADSCs在相關領域的研究基礎，為慢性創面治療提供了新的發展前景和可能性。

1? ADSCs的提取方法和生物學特性

1.1 ADSCs的提取方法：自上個世紀60年代，Rodbell等嘗試從脂肪組織中分離細胞以來，人類對脂肪組織及其提取物的研究不斷深入，直到2002年Zuk等從脂肪組織中分離提取并證實了干細胞的存在，將其正式命名為ADSCs。典型的ADSCs分離程序包括用膠原酶消化脂肪抽吸組織、離心，繼而產生高密度基質血管組分（Stromal vascular fraction， SVF），然后進行傳代培養，最終將ADSCs分離提取出來[2]。采用直接消化法和干細胞基質膠消化法分離提取ADSCs，分別進行細胞表型鑒定、增殖活性檢測和成脂/成骨分化檢測，對比后證實了基質膠消化法比直接消化法分離得到的ADSCs有更好的成脂分化能力，其成脂誘導分化的標志基因-PPAR-γ mRNA和蛋白表達水平更高[3]。

現有的研究方法需在獲取脂肪前處死小鼠，但該操作會影響提取細胞的數量及活性，針對此問題，有研究人員[4]從小鼠腹膜外及腹股溝處分離脂肪組織，采用膠原酶消化獲得ADSCs，鑒定后證實從活體小鼠組織中獲取ADSCs可行且細胞質量較好。該提取過程耗時較少、成本較低，且提取的ADSCs純度高、狀態好，是一種較為理想的小鼠ADSCs提取方法，可廣泛應用于干細胞的相關研究。

1.2 生物學特性：ADSCs在一定條件下可分化為脂肪細胞、肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞及血管內皮細胞等，是一種類似于BM-MSCs的多能干細胞，具有很強的自我更新能力、多向分化潛能和旁分泌功能，主要參與機體組織細胞修復，促進細胞再生。與其他間充質干細胞相比，ADSCs生物活性更穩定，且具有更強的增殖能力；此外，脂肪組織中高含量ADSCs可避免長期體外培養，可能比BM-MSCs更適合同種異體移植。ADSCs可以增殖和分化為皮膚細胞以修復受損或死亡的細胞，也可以通過自分泌和旁分泌多種細胞因子，如轉化生長因子-β（Transfer growth factor-β， TGF-β）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor， HGF）、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）、基質細胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1， SDF-1）等[5]，激活細胞再生和愈合過程。在創面愈合過程中，ADSCs在向真皮成纖維細胞、內皮細胞和角質形成細胞分化的基礎上，能夠快速遷移到創面。此外，ADSCs是維持皮膚結構和功能的細胞外基質（Extracellular matrix， ECM）蛋白的主要來源[6]。由于ADSCs容易從皮下脂肪組織獲得，具有易于大量獲取、操作簡便、損傷較小、無免疫原性等優點[7]，使得ADSCs成為創面修復和組織再生中最具吸引力的MSCs來源。

2? ADSCs促慢性創面愈合機制

創面修復大體可分為炎癥反應期、肉芽組織形成期和組織塑形期的三個階段，需要多種細胞及ECM組分和多種生長因子、細胞因子的協同參與。ADSCs促進慢性創面愈合的機制可能有以下三個方面：①ADSCs在創面局部直接分化為皮膚的修復細胞，如成纖維細胞、角質形成細胞等；②通過旁分泌作用，分泌多種生長因子，如：TGF-β、VEGF、角質形成細胞生長因子（Keratinocyte growth factor， KGF）和成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor， FGF）等，這些生長因子已被證明參與創面愈合過程并發揮重要作用[8]；③通過抗氧化作用，捕獲缺血缺氧組織局部的自由基，保護成纖維細胞免受氧化應激損傷[9]。

有研究人員[10]評估了ADSCs對燒傷創面愈合的影響，ADSCs不僅可釋放多種促進創面血管形成的細胞因子改善創面血供，還可以增強成纖維細胞遷移和增殖并抑制增生性瘢痕成纖維細胞對膠原蛋白的分泌。同時，ADSCs還可以直接分化成皮膚干細胞以加速創面愈合，盡可能地縮短燒傷的愈合時間。由于ADSCs在體內移植后的低活性和低效率等缺點，人們做出了很多嘗試，試圖克服這些問題，新型材料的應用逐漸增多。殼聚糖、膠原、海藻酸鹽、多肽和聚氨酯較為常見，但都有其局限性。由此可見，設計和合成新的具有較高生物相容性和生物活性的促創面愈合生物材料是我們目前迫切需要解決的問題。據報道，一氧化氮（NO）有助于促進干細胞的生物活性，Wu Y等[11]利用生物打印技術合成了一種高效的生物支架以負載ADSCs和NO（3D ADSCs/NO），其實驗表明，3D-ADSCs/NO通過促進上皮化和膠原沉積加速了創面愈合。3D-ADSC/NO結構可能是嚴重燒傷創面愈合的一種新的治療方法，但由于生物支架成本高且制備速度慢，并不適合治療大面積創面。圓葉茅膏菜葉片分泌的黏附性水凝膠因為可以促進成纖維細胞的分化和附著，引起了研究人員的廣泛興趣，為了避免產量低等局限性，Sun L等[12]受圓葉茅膏菜啟發合成了一種粘合劑水凝膠，其特征骨架含有重復的葡萄糖醛酸和甘露糖二聚體。這種水凝膠與ADSCs聯合使用可以促進傷口愈合過程，在傷口修復的早期階段優勢明顯。

除了生物材料的研發，近年來也出現了ADSCs與其他細胞的聯用和誘導分化的相關研究。有研究表明，ADSCs、角質形成細胞與成纖維細胞三者的聯用不僅可以顯著促進多種參與創面愈合的細胞的增殖和遷移，ADSCs的干細胞特性在良好的微環境下也可分化為角質形成細胞與成纖維細胞，而角質形成細胞和成纖維細胞也表現出比單獨使用時更優秀的再上皮化和ECM沉積。Zhou ZQ等[13]研究表明，通過體外調節結締組織生長因子，可以誘導ADSCs分化為成纖維細胞，從而具有促進皮膚創面愈合的潛在應用價值。

3? ADSCs在糖尿病慢性創面治療中的作用

高血糖狀態可通過不同的機制導致創面難愈，神經源性感覺缺失可能會加劇創傷性組織丟失，而由于高血糖引起的細胞增殖受損和對生長因子的抵抗造成了創面上皮化不足，也可能會推遲創面愈合[14]。此外，糖尿病中巨噬細胞遷移受損和信號分子釋放不足同樣會抑制新血管的形成。因此，血管生成是創面愈合的關鍵部分，促進血管生成是糖尿病創面治療的主要目標之一。角質形成細胞的增殖和遷移，即再上皮化，也是創面愈合的關鍵。ADSCs能通過旁分泌作用分泌多種生長因子，這些因子可以起到促進血管化和細胞存活的作用。但由于糖尿病患者創面閉合困難限制了ADSCs移植的療效，目前迫切需要一種有效的方法來提高ADSCs的旁分泌功能以及其在糖尿病微環境中的存活率。

Marino G等[15]使用ADSCs治療20例嚴重肢體缺血患者，其中18例為糖尿病合并下肢難愈性潰瘍。將自體ADSCs注入患者下肢慢性潰瘍邊緣，監測第4、10、20、60、90天創面愈合情況，其中18例患者潰瘍創面有臨床改善。因此，對其他治療方式不敏感的嚴重肢體缺血患者，多次注射自體ADSCs也許是有效選擇。除移植自體ADSCs外，同種異體ADSCs也是治療糖尿病足潰瘍安全有效的措施，并且較自體ADSCs來源更廣泛，有效避免了ADSCs分離過程中耗材多和分離效率低等問題，但臨床治療的長期安全性尚需證實[16]。目前，多數臨床試驗處于早期階段，樣本量小、隨訪時間短，需進一步觀察和改進治療方案[17]，相關問題也缺乏臨床試驗證實，如自體與同種異體移植ADSCs、不同部位或不同分離方法獲取ADSCs的療效差異等。

為了克服目前糖尿病創面治療措施的局限性，研究人員在不斷探索與ADSCs結合的組織工程學最佳組合。Exendin-4（Ex-4）是一種胰高血糖素樣肽-1受體激動劑，對糖尿病皮膚創面的治療有效。Seo E等[18]在糖尿病動物模型中證明了Ex-4聯合ADSCs有著較好的治療效果。除此之外，他們還發現ADSCs對內皮細胞和角質形成細胞都有促增殖作用，有助于促進糖尿病創面再上皮化和傷口愈合。Wang Q等[19]探討了整合素β1在ADSCs促進傷口愈合中的作用及其機制，其在大鼠慢性難愈性創面模型上的實驗結果證明，整合素β1的過表達明顯縮短了愈合時間，提高了愈合率，驗證了整合素β1可通過激活PI3K/AKT通路促進ADSCs遷移和內皮樣分化從而促進創面愈合。由于缺氧誘導因子1α（Hypoxia-inducible factor， HIF1α）在創傷愈合過程中起重要作用，Xu J等[20]研究探討了高糖低氧條件下缺氧誘導因子1α過表達對ADSCs的影響。HIF1α過表達可顯著增加高糖抑制的血管內皮生長因子A、成纖維細胞生長因子2（FGF-2）和C-X-C基序趨化因子配體12的表達。在ADSCs中過表達HIF1α可減輕高糖誘導的小鼠主動脈內皮細胞增殖和遷移缺陷，并顯著抑制ADSCs中活性氧（Reactive oxygen species， ROS）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平，從而減少細胞凋亡。在體內，移植前ADSCs中HIF1α的過表達顯著增強了血管內皮生長因子的表達，促進了糖尿病小鼠創面的愈合。

在聯合生物材料來增強ADSCs的生物活性方面，研究人員也做出了很多新的嘗試。Tyeb S等[21]提出了將ADSCs移植到改良的抗氧化劑支架上的組合方法，即將ADSCs輸送到包被層黏連蛋白（GSL）的抗氧化明膠-絲膠（GS）支架上。層黏連蛋白是一種促進血管生成的內皮基底蛋白，絲膠的加入提高了支架對氧化應激下細胞的保護作用。實驗結果發現GSL-ADSC結合后促血管形成功能明顯增強。Pak CS等[22]研究了兒茶酚功能化透明質酸 （Catechin-functionalized hyaluronic acid， CF-HA）貼片聯合ADSCs對糖尿病小鼠模型的影響。在此研究中，他們發現HA-CA貼片聯合ADSCs后表現出極佳的協同作用，促創面愈合作用更強。這種協同效應反映HA-CA貼片提高了ADSCs的再生能力，提供了出色的生物相容性、組織黏附性和更高的存活率，并使ADSCs最大限度地發揮了其旁分泌作用。

4? ADSCs衍生物在創面修復中的應用

ADSCs旁分泌細胞因子、外泌體和其他活性物質是發揮生物學效應的主要因素[23]。近年來，研究人員對ADSCs旁分泌活性的潛在影響進行了大量的研究，旨在研發新的慢性創面無細胞治療方法。研究表明，脂肪無細胞衍生物的使用克服了ADSCs臨床應用的局限性，并顯示出許多優點，比如這些脂肪衍生物不含細胞，便于攜帶、運輸和儲存，免疫原性低，無潛在致瘤性，可用于同種異體移植，這使得脂肪無細胞衍生物更適合于商業推廣。脂肪無細胞衍生物包括ADSCs條件培養基（ADSCs-CM）、ADSCs來源的外泌體（ADSC-Exos）和無細胞脂肪組織提取物（adipose tissue extract，ATE），這些ADSCs衍生物被廣泛應用于抗衰老、創面愈合、瘢痕修復、神經再生等方面的研究，為新出現的無細胞療法開辟了道路。

有證據表明，ADSCs-CM能夠發揮以下作用：①改變炎癥階段巨噬細胞炎癥表型；②通過促內皮細胞分化和細胞遷移促進新血管生成；③在增殖和重塑階段促進肉芽組織、皮膚細胞和ECM的形成。有研究表明ADSCs-CM和/或細胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）促進愈合的體內外實驗研究結果顯示完全支持使用無細胞療法治療慢性難愈合創面。但其也表示需要在動物模型中進行更多同質性研究，以更好地確定ADSCs的諸多衍生物在皮膚創傷修復不同階段的作用。另外，有研究發現ADSCs的衍生物能促進成纖維細胞的增殖和遷移，并加速成年大鼠缺血創面的愈合[24]。

ADSCs能夠分泌豐富的外泌體，從而促使細胞增殖、分化和遷移以及改善創面微環境，在促進創面愈合方面有很好的療效，這是通過多種細胞的增殖和遷移介導的。有研究表明ADSCs-Exos作為治療藥物的載體或復合支架可以促進脂肪移植存活，促進糖尿病患者的創面愈合[25]。He L等[26]研究表明含MALAT1的ADSC-Exos可能通過激活Wnt/β-catenin通路靶向miR124，從而促進皮膚創面愈合，這可能為皮膚創面愈合的治療靶點提供新的思路。近幾年創面材料的發展突飛猛進，各類高分子生物材料負載干細胞、細胞因子及外泌體后，其促進創面愈合的作用大大增強。負載ADSCs-Exos的各類創面材料在研究中證實了其修復傷口的作用。Jiang T等[27]將ADSCs-Exos負載到基質金屬蛋白酶可降解聚乙二醇（MMPPEGo）智能水凝膠中，ADSC-exo@MMP-PEG智能水凝膠顯著緩解了過氧化氫誘導的氧化應激損傷，因而這種智能水凝膠為糖尿病創面修復提供了一種新的治療策略。綜上所述，ADSCs-Exos在臨床實踐中有著廣泛的應用前景。

5? 小結和展望

慢性創面一直是臨床工作中十分棘手的問題，以干細胞為基礎的組織工程的出現為慢性創面的治療帶來了新的可能。ADSCs的多種優點已使其成為組織工程的理想種子細胞，各種研究證明ADCSs在創面修復領域潛力巨大。不含脂肪細胞的無細胞衍生物因避免了ADSCs的諸多局限性，為一種新出現的無細胞療法開辟了道路，具有廣闊的臨床應用前景。最新研究也證明了皮片移植和皮瓣移植過程中應用ADSCs對移植效果的增益，由此可見，未來若聯合更先進的人工真皮有望為創面修復提供更大的可能性和可操作性，以解決自體供皮不足等局限性難題。除此之外，未來的研究將集中于在適當的載體中使用ADSCs，以促進它們在傷口愈合應用中以及在組織工程器官和組織中直接或間接促進血管生成的潛力。

盡管ADSCs具有非常廣闊的科研前景，基礎實驗與臨床實踐之間仍然有一定的差距。目前利用ADSCs對創面進行治療的方法還有待改進和進一步探索，許多研究領域仍然需要進一步完善。如何改進ADSCs移植方式來避免注射療法對干細胞療法臨床應用的限制，以及脂肪干細胞與其他相關細胞聯用能否產生更好的效果期待下一步研究。除此之外，需要進一步探索更好的ADSCs分離方法、治療指征以及ADSCs移植的遠期并發癥，最大限度地發揮新興療法的效益。ADSCs參與皮膚再生的分子機制也需要進一步的研究，以加深對創面微環境中炎癥、氧化應激和細胞衰老等病理生理問題的理解，為未來創面修復和再生醫學開辟道路。

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[收稿日期]2023-05-29

本文引用格式：王一，龔思宇，姜篤銀.脂肪干細胞及其衍生物促慢性創面愈合的研究進展[J].中國美容醫學，2024，33（4）：179-182.