脫落酸生物合成研究進展

作者簡介：張馨逸（2004-），女，江蘇泰州人.

摘 要：脫落酸是一種植物激素，能抑制植物生長和增強植物抗逆性，對某些動物疾病也有治療作用，在農業和醫藥方面有廣泛應用，傳統的植物提取法和化學合成法存在成本高、產率低、對原材料依賴高等問題。利用微生物合成脫落酸是一種更經濟、便捷的方式。文章以異源合成脫落酸的代謝通路構建方法為重點，對利用釀酒酵母、大腸桿菌、解脂耶氏酵母作為底盤細胞，合成脫落酸的研究和生產應用進行綜述與展望。

關鍵詞：脫落酸；異源酶表達；酶改造；底盤選擇；多模塊調諧

中圖分類號：Q94 " " 文獻標志碼：A 文章編號：1671-0142（2024）03-0081-05

脫落酸（ABA）是一種倍半萜類植物激素，主要在葉綠體和其他質體內合成，也會在應對某些環境壓力時產生[1]。此外，某些動物和真菌也可以合成ABA。ABA在植物生長發育過程，如種子休眠、細胞生長、塊莖形成中起重要作用。在農業方面，ABA制劑可以增強柑橘的抗鹽性、鷹嘴豆的耐旱性以及小麥等作物的抗寒性[2]。在醫療健康方面，ABA可降低胰島素和血糖水平[3]，有作為營養品和藥物制劑的潛力。ABA試劑的應用，將會帶來巨大的經濟和社會效益。

1 脫落酸生物合成途徑及生產技術現狀

1.1 脫落酸的生物合成途徑

ABA合成途徑可以分為間接途徑和直接途徑。真菌主要采用C15的直接途徑；而在高等植物中，主要通過間接途徑合成ABA。高等植物合成ABA的途徑可以分為兩個模塊：番茄紅素合成模塊和脫落酸合成模塊。

在植物中，脫落酸的合成主要發生在質體中，根冠和葉片也是合成ABA的重要場所。在高等植物體內，通常以牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）為前體，合成番茄紅素，經環化酶產生物質合成關鍵中間體β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素也是合成ABA的重要前體物質[4]。在ABA合成模塊中，β-胡蘿卜素經β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）氧化催化依次形成隱黃質和玉米黃質；玉米黃質經玉米黃質環氧化酶（ZEP）催化形成紫黃質，后經過酶的依次催化，最終形成脫落酸。

1.2 投產技術

1.2.1 新型高產菌株 中科院成都生物研究所利用自主知識產權的高產B. cinerea TB-3-H8高產菌株，使用分子生物學技術探明了部分ABA合成相關基因的功能，獲得4個與ABA合成相關的基因（Bc ABA1、Bc ABA2、Bc ABA3、Bc ABA4）[5]。基于4個ABA合成相關基因，通過對B. cinerea TB-3-H8菌原生質體進行復合誘變和定向選育，獲得了新型高產菌株TBC-A，使ABA產量提高2.8倍，5L發酵罐產量達到5.0 g/L以上。該項目的后續研究建立了基于代謝調控的“精準補料分批發酵工藝”和ABA膜分離提取技術精制工藝。放大試驗表明，50L發酵罐ABA產量達到5.0g/L以上、50噸生產規模發酵罐ABA產量達到3.0g/L以上；ABA提取收率達到85%以上，粗產品含量達到90%以上，精品純度達到98%。后續開發的ABA單晶制備技術首次獲得純度達到99.8％的ABA。該項目成果于2013年通過科技成果鑒定，整體水平居國際領先。

1.2.2 大體積發酵和純化工藝 北京泛球生科建立了快速、簡便的ABA產生菌篩選方法[6]，篩選獲得高產ABA灰葡萄孢菌株，并對該菌株進行了紫外、化學、激光等多種誘變。優化發酵工藝使發酵時間縮短，使該菌株在50T發酵罐ABA產量達到 2.3～4.6g/kg 培養物（實驗室達到 8.1g/kg），發酵時間從 25 天縮短到 7～10 天。同時建立了快速分離、純化方法，使產品純度大于 98％，總收率大于 60％。該工藝路線步驟較短、操作簡單、重現性好、安全方便、污染較少，產生 ABA 具有純度高、生理活性強等優點， 是一條生產天然型 ABA 的創新性工藝。

1.3 前沿研究

1.3.1 釀酒酵母底盤研究進展 類環氧胡蘿卜素，如紫黃質和新黃質是ABA合成的重要前體物質。Agosin等首次報道了在酵母中異源生產類環氧胡蘿卜素，對釀酒酵母進行了多層次的改造，使其能夠高效地積累紫黃質。研究人員以一株產β-胡蘿卜素的酵母菌為底盤，首先評估了來自不同物種的幾種β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）和玉米黃質環氧化酶（ZEP）的性能，以及它們各自的N-端缺失變體。通過共表達幾個氧化還原伙伴體系，促進還原等效物向ZEP的轉移，進一步提高了環氧酶的活性。同時，增加胡蘿卜素基因拷貝數來提高酶的表達量，并使用搖瓶培養和間歇式生物反應器，最終產量達到7.3 mg/g DCW。這是目前報道的微生物生產紫黃素的最高產量[7]。

1.3.2 解脂耶氏酵母底盤研究進展 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是生產多種萜類物質的潛力底盤。Borodina等在甲羥戊酸（MVA）合成途徑優化的底盤細胞中構建了與ABA生物合成相關的灰芽孢桿菌基因，在小規模發酵實驗中的ABA產量為59.2 mg/L。研究人員通過增加B. cinerea來源的ABA合成相關基因拷貝數，并表達植物來源的ABA轉運蛋白，從而使菌株ABA產量達到263.5 mg/L（9.1 mg/g DCW）。發酵罐培養的解脂耶氏酵母的ABA比產率為12.8 mg/g DCW，但獲得的生物量僅為10.5 g DCW/L。ABA滴度也較低，為133.6 mg/L，尚需進一步優化[8]。

1.3.3 大腸桿菌底盤研究進展 運用代謝工程方法將紫黃質合成途徑構建到大腸桿菌細胞中，實驗證明可以產生紫黃質，但產率較低，后續研究通過引入異源ABA合成相關基因等方法提高了紫黃質的產率[9]。不過，大腸桿菌是原核生物，缺乏復雜的細胞器，表達真核生物來源酶的效率低下，只適合驗證相關酶的活力和作用，不適合大規模生產。

2 不同底盤細胞中合成脫落酸的工程化策略

2.1 釀酒酵母

2.1.1 增強β-胡蘿卜素羥化酶的活性 β-胡蘿卜素是ABA合成的起始代謝產物并通過單羥基化的中間體隱黃質產生玉米黃質。研究人員比較了細菌、藻類和高等植物等不同來源的β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）的性能[10]，發現細菌的β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）表現出比真核生物更高的羥基化活性[11]。細菌CrtZ能夠有效地將β-胡蘿卜素轉化為玉米黃質，且中間產物的積累量最小，積累了75%的玉米黃質（6.9mg/gDCW）和7%的中間體隱黃質。

2.1.2 截短玉米黃質環氧化物酶的N-末端 玉米黃質生成紫黃質是玉米黃質環氧化物酶（ZEP）催化的。與其他胡蘿卜素原酶相似，ZEP具有質體轉運肽，通過ZEP轉運受體定位在類囊體膜上。研究人員在β-胡蘿卜素原性菌株SM14中共表達了PaCrtZ和ZEPs以獲得第一個產紫黃質的菌株。不同ZEP基因的表達極大地改變了類胡蘿卜素的組成和占比。實驗中發現，N-末端截短顯著影響所有測試的ZEP的環氧化活性。在HlZEP的情況下，全長酶是活性的，但截短的對應物顯示紫花紅素產量增加了4倍。實驗發現，N-端截短顯著影響所有被測試的ZEP的酶活性[12]。通過截短ZEP，菌株的紫黃質產量增加4倍。目前可以通過生物信息學工具進行轉運肽的預測，從而評估提高紫黃質產量的截短位置。

2.1.3 共表達氧化還原伴侶 葉綠體中的環氧化反應是NADPH依賴性的，需要FAD作為輔因子。ZEP不能直接從NADPH接受還原當量，因此，電子從鐵氧還蛋白轉移到與ZEP結合的FAD。

異源表達的ZEP部分可以直接從酵母的內源代謝中獲取還原力，但酵母內源可提供的還原力是有限的。為提高紫黃質產量，研究人員在Tr59 HIZEP菌株中共表達了ZEP氧化還原伴侶RFNR1和FD3，使紫黃質的產量增加了2.2倍。這說明，雖然藍細菌氧化還原伴侶在產生紫花紅素的大腸桿菌菌株中的表達不能提高紫花紅蛋白的產量，但釀酒酵母是表達全功能FNR/FD/ZEP系統的合適宿主。

2.1.4 基因表達量調節 研究人員通過添加多拷貝的β-胡蘿卜素合成基因CrtE、CrtI和CrtYB來增加上游前體的表達量，并引入可控啟動子調節表達[13]。多拷貝的CrtYB基因顯著增加了總類胡蘿卜素（從9.1到12.3 mg/g DCW）和紫黃質產量（從3.5到4.2 mg/g DCW）。最終，這種基因劑量策略使紫黃質的產量增加了2.1倍。

2.2 解脂耶氏酵母

2.2.1 增加基因拷貝數 研究人員研究發現BcA

BA1、BcABA3以及ERG20的額外拷貝的表達會增加ABA的產量。BcABA1的多拷貝使ABA產量增加了2.8倍，達到168.5±4.8mg/L；BcABA1的多拷貝和ERG20的多拷貝（ST9724）使ABA產量增加到217.0±3.1mg/L，比僅表達BcABA1的菌株增加了29%。

2.2.2 表達異源ABA轉運蛋白 在解脂耶氏酵母中表達異源ABA轉運蛋白，可以在ABA產量水平高的情況下促進ABA的外排。擬南芥ABC轉運蛋白G亞家族中的AtABCG25是ABA的輸出蛋白[14]，并參與形成細胞間ABA信號通路；擬南芥中DTX/Mate家族成員AtDTX50也有作為ABA輸出蛋白的功能[15]。在目前的產量水平下，天然酵母轉運蛋白足以輸出大部分的ABA，但在ABA產量提高的條件下表達異源ABA轉運蛋白，比如AtDTX50p和AtABCG25p，可以進一步強化ABA的分泌，從而緩解細胞壓力。

2.2.3 改進培養條件 研究人員發現，y10p20d20培養基在ABA和生物量積累方面均優于礦物培養基，250mlAmbr?生物反應器中的ABA產量遠低于小規模培養，不控制pH的培養效果優于控制pH為5.5的培養效果。這說明部分培養條件可能限制了ST9727的生長和ABA合成，因此可以通過改進培養條件提高ABA產量。

2.3 大腸桿菌

運用代謝工程方法將高等植物合成ABA前體紫黃質的代謝途徑構建到大腸桿菌細胞中，發現可以產生紫黃質，但產率較低，后續研究通過異源ABA合成相關基因的引入等方法提高了大腸桿菌合成紫黃質的產率。不過，大腸桿菌終究是原核生物，缺乏真核生物的復雜細胞器，表達真核來源酶的效率低下，只適合驗證相關酶的活力和作用，不適合大規模生產。

2.3.1 異源ABA合成相關基因的引入 研究者將擬南芥、辣椒、野菊花等7種高等植物來源的ZEP分別構建到產紫黃質的大腸桿菌JM101底盤中，發現辣椒來源的ZEP（CaZEP）表現出最高的催化活性。此外，研究者還在MVA中引入外源性異戊烯基二磷酸（IPP）異構酶（IDI），以增強前體物質的供給。

2.3.2 表達元件的優化 核糖體結合位點（RBS）

是與16S rRNA結合的一段序列，與翻譯強度息息相關。研究者使用Salis等開發的“RBS計算器”軟件進行設計，獲得了一系列得分較高的RBS序列。RBS計算得分越高，16S rRNA與RBS序列互補配對形成復合物過程的吉布斯能變（ΔG）越低，即復合物越穩定，理論上翻譯效率越高。經設計優化，JM101菌株的紫黃質產量可以達到231μg/g。

3 微生物合成脫落酸現階段的問題和瓶頸

（1）B. cinerea天然可以合成ABA，但該菌是一種天然致病菌，產生ABA的同時會伴有其他致病原，增加提純成本，且缺少成熟的基因編輯工具，難以理性設計和篩選ABA高產菌株。（2）目前生物異源合成ABA的產量都相對較低，如何提高微生物異源合成ABA的產量是一個重要的挑戰。（3）ABA異源合成的間接途徑增加了代謝途徑的長度，引發更多碳分流，這需要持續積累更多前體物質，以確保碳的持續供應；該途徑大多數的酶原本在葉綠體中表達，而微生物底盤不具備該細胞器，因此在進行異源表達時會受到一些限制。（4）ABA直接合成途徑中，BcABA1和BcABA2的活性是異源合成ABA的瓶頸，除增加基因拷貝數外暫無其他提高催化效率的方法；暫無較好的改善NADPH氧化還原輔因子的供應而對菌株生長無負面影響的方法。

4 設計和解決方案

筆者以釀酒酵母作為底盤細胞為例，在內源性萜烯骨架合成模塊（Module-T）的基礎上，從頭構建以GGPP為前體的番茄紅素合成模塊（Module-L）和以番茄紅素為前體的脫落酸（Module-A）合成途徑。

4.1 前體物質供給強化

通過表達和異源引入前體合成途徑相關酶來強化前體物質供給（表1）。過表達促脂滴形成蛋白Ldp1，強化脂滴對親脂性前體的儲備能力[16]。對HMG-CoA還原酶進行酶工程改造（N-端截短），將CrtY定位至脂質體，提高酶活力。敲除YPL062W，將MVA途徑定位至線粒體中，以便更好地利用乙酰-CoA。

表1 前體物質相關基因和操作方法

[酶 前體 基因操作 ALD6 乙酰-CoA 過表達 PDC ACS tHmg1 IPP Erg10 Erg13 Erg12 Erg8 Erg19 Idi1 異源引入（Bacterial） GGPPsynthase GGPP 異源引入（P.yew） CrtB 過表達 Crtl 番茄紅素 異源引入（B.trispora） ]

4.2 脫落酸的合成與轉運

通過過表達和異源引入ABA合成途徑相關酶，共表達ZEP氧化還原伴侶RFNR1和FD3，來提升碳利用率（表2）。對HI ZEP截短N-端氨基酸序列，去除導肽，提高酶活力。表達異源ABA轉運蛋白AtDTX50p和AtABCG25p，強化ABA外排。

表2 ABA合成相關基因和操作方法

[酶 底物 基因操作 CrtY 番茄紅素 多拷貝 CrtZ β-胡蘿卜素 異源引入（Bacterial） ZEP 玉米黃質 異源引入（H.Lacustris） NCED 紫黃質 多拷貝 AAO3 脫落醛 多拷貝 ]

4.3 次級代謝途徑的抑制

敲除乙醇脫氫酶1（ADH1）和丙酮酸脫羧酶1（PDC1），增加乙醇脫氫酶2（ADH2）的拷貝數，調整糖酵解途徑的相關酶，減少乙醇產生。敲除檸檬酸合酶1（MLS1），減少乙醛酸途徑對乙酰-CoA的分流（圖2）。

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圖2 釀酒酵母次級代謝途徑的抑制

4.4 代謝途徑模塊化調諧

分別選取Module-T、Module-L、Module-A的關鍵酶Hmg1、CrtI、ZEP，將其編碼基因的啟動子序列作為調控靶點（圖3）。根據原始序列生成隨機序列組合系列，用計算化學方法算出各組合吉布斯能變（ΔG），濕實驗測定各組合ABA產量（W），將W映射為ΔG的函數，求解極值和對應的ΔG值，再反推啟動子序列，進行理性設計以實現模塊調諧。

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圖3 多模塊調諧操作流程

5 總結與展望

傳統的化學合成脫落酸的方法由于在合成過程中使用大量溶劑、催化劑，會產生有毒的廢物與污染物；此外，化學合成還存在能耗高、產物純度低、選擇性差等問題。隨著對產脫落酸的植物和真菌基因組和轉錄組基因測序的完成，已經明確了脫落酸的生物合成途徑，且合成路徑上關鍵的基因已通過體外或體內被測定出來。因此，利用合成生物學在微生物中構建脫落酸的合成路徑是一種更經濟、更便捷的生產方式。

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（責任編輯 劉 紅）

Research Progress on Abscisic Acid Biosynthesis

ZHANG Xin-yi

（Tianjin University， Tianjin 300072， China）

Abstract：Abscisic acid is a kind of plant hormone， which can inhibit plant growth and enhance plant stress resistance. It also has therapeutic effect on some animal diseases， and is widely used in agriculture and medicine. Traditional methods of plant extraction and chemical synthesis suffer from high costs， low yields， and high dependence on raw materials. Utilizing microorganisms for abscisic acid synthesis presents a more economical and convenient approach. This article primarily focuses on the metabolic pathway construction for heterologous synthesis of abscisic acid， highlighting the current research and production applications utilizing Saccharomyces cerevisiae， Escherichia coli， and Yarrowia lipolytica as chassis cells.

Key words： Abscisic acid; heterologous enzyme expression; enzyme transformation; selection of chassis cells; multi-module tuning