醫學實驗動物采血方式及檢前因素對生化指標的影響*

張金月 惠 敏 道力給艷 張子英 張 楠 曹曉東 朱曉偉 韓 帥

內蒙古醫科大學,內蒙古呼和浩特市 010110

血液檢驗是臨床中最常見的檢測項目之一,血液生化結果對于臨床的診斷和治療具有重要的參考意義。飼料半衰期測量、藥代動力學研究、醫學免疫學指標值檢驗、病源致病力等有關指標的評定均可通過血液測定。血液生化檢測項目的樣品類型分為全血、血清/血漿,檢測指標多達70余項[1]。

小型實驗動物的采血方式主要有眼眶靜脈叢采血、尾靜脈采血、心臟采血、腹主動脈采血、耳緣剪口采血、毛細血管采血等。大型實驗動物采血多為靜脈采血。不同采血方式各有優缺點,依據實驗要求選擇合適的采血方式至關重要。最理想的采血方式既要操作簡便,又要緩和實驗動物狀態,使血液質量得到保證;然而每種采血方式在具體實施中,都難免會受到各種操作因素的影響;一定時間內不合理的多次采血,會使動物生理和情緒發生變化,且具有累積效應,使血液生化指標發生變化,這與試驗數據的有效性、準確性有直接關系。因而,依據實驗需求與采血特性開展有針對性的挑選極其重要[2]。采血方法、血樣處置方式、采血過程等多種因素均可影響血液生化檢測結果。實驗動物采血的具體操作要考慮多種因素,如動物福利、血樣要求和采血頻次等,選擇合適的采血方式,既保證得到高質量的血液樣本,又能減少對實驗動物的傷害。本文對實驗動物常用的采血方法以及影響血液生化指標的一些因素進行總結,為檢測者和實驗者提供參考和幫助。

1 實驗動物微量采血方式

連續微量采血可在無須處死動物的情況下追蹤血樣生化指標的動態變化,相比于一次性大量采血可有效減少實驗動物的使用量。

1.1 舌下靜脈采血 適用于大小鼠,對舌肌等細胞損傷比較小,痊愈快,可不斷采血,但是必須在麻醉狀態下開展。

1.2 尾部采血 適用于大小鼠,包括尾尖采血、尾靜脈取血和尾靜脈穿刺采血,可用于全程動態檢測,如血常規檢測、血糖監測等。尾尖采血應注意防止剪尾太長和尾端斷端的止血難題,一次采血量為0.2mL,采集的血液是動靜脈混合血,適用范圍較小。尾靜脈取血除操作簡便外還具備損害小、痊愈快、副作用少、血液不易受環境污染等優點。尾靜脈穿刺采血大鼠一次采血量0.15mL[2],因注射針伸縮速率不易操縱會導致毛細血管收縮、血液外溢,可使用真空采血管開展采血,從而避免因為伸縮注射針速率不均而引起的試驗失敗風險。

1.3 眼眶采血 適用于大小鼠,速度較快,抽血量較多,規模試驗適用于此方法。小鼠單眼眶采血組織修復期為 10d 左右[2],多次眼眶下取血會引起眼眶細胞損傷、自主神經系統性紊亂等,比較嚴重狀況也會導致死亡。數次采血時要重視眼部保養從而減少并發癥的發生。

1.4 頸靜脈取血 適用于嚙齒類動物如大鼠、小鼠等以及馬、牛、羊等。采血量多,品質高,但部位比較深,規定操作人員了解實際操作技術以及頭頸部解剖結構,防止不斷試插而造成大量出血。頸靜脈取血可采集約0.5mL的血量[2]。使用頸靜脈方法采血一般無麻醉劑,可能會由于皮下組織穿針造成皮下出血點,體現為淤血。規定采血量多,采血部位損傷小,麻醉后也可選用一次性真空泵采血,但長時間麻醉易使實驗動物的中樞神經系統遭到破壞。現階段采用的新型的套管技術能夠填補數次入針上的不足,在減少小鼠應激同時持續收集大量高品質血液。頸靜脈取血一般應用于藥代動力學的研究,頸靜脈套管技術的實施解決了連續數次采血造成的機體損傷問題,一次取血可達全身上下循環血量的15%[2]。

1.5 隱靜脈采血 常用于大小鼠、兔的少量血液采集,血管部位淺,易穿刺,應激反應小,血液品質高。

1.6 下頜靜脈取血 常用于小鼠的采血,其創口小、采血量多、恢復快,但是入針點比較難掌握。

1.7 大動靜脈埋管 常用于大鼠的采血,此方法適用于實驗動物的持續采血,為數次微創采血帶來了新的方向,但是埋管操作繁雜,中后期需維護保養。

1.8 其他實驗動物采血方式 兔的常見采血部位包括耳和心臟。兔耳耳型大,動靜脈分布明顯且有規則,耳緣靜脈采血方法一般可采血1～2mL;兔的胸腔由縱隔分為互不相通的兩部分,為心臟采血提供了方便,一次可采血15～20mL。猴常用靜脈采血法,也可根據所需血量選擇不同取血部位,即少量(1mL以下)在后肢隱靜脈采血;中等量(3mL左右)在股靜脈采血,大量在麻醉狀態下進行心臟采血,體重2～4kg的猴子可取血100～150mL。豚鼠可采用心臟采血,將豚鼠麻醉后仰臥固定,觀察并用指尖觸摸到豚鼠胸部心跳最明顯部位,用針頭插入胸壁后稍向右下方刺入,可重復多次采血,成年豚鼠每周采血量不應超過10mL[3]。

2 檢前因素對血液生化結果的影響

對實驗動物來說,年齡、性別、飲食搭配、長期服用藥物、精神狀態及運動狀況、采血體位、采血方式、采血技術等均是影響生化檢驗指標的因素,通過制定相應的規范操作方法可最大限度地減少檢驗偏差。

2.1 個體因素

2.1.1 生長發育對血液生化指標的影響。幼年時期處于動態發育過程,正常成年實驗動物的參考范圍與幼年時期的某些生化指標不同。如:幼年動物骨骼發育代謝活躍,促使成骨纖維細胞分泌乳酸脫氫酶(ALP)增加,因此幼年動物體內的ALP值比成年的相對值要高。幼犬幼貓的某些生化指標會比成年時期小,如有文獻報道2日齡身心健全的幼犬血糖濃度比成年犬要小;但8日齡犬的血糖濃度高于成年犬[4]。幼時動物機體脂肪含量偏少,所以其血清肌酐濃度值稍低。幼犬的肌蛋白激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)高于成年犬,發育到7個月齡時下降到成年后范圍內。

2.1.2 性別對血液生化指標的影響。許多研究表明,年齡因素和性別因素也是影響動物血液生化指標的因素之一[5]。Obese等人通過研究豚鼠,認為年齡、性別、品種均會影響豚鼠的血液生化指標[6]。不一樣性別的實驗動物體內性激素水平也不一樣,而且某些種類實驗動物的成年雌激素水平會在月經周期內有明顯變化,幼犬4月齡后雄性動物的5-羥色胺水平開始高于雌性動物[7]。

2.1.3 生物節律及環境對血液生化指標的影響。哺乳動物的晝夜節律活動差別十分明顯,實驗動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬等都有各自的生活習性和晝夜節律活動。節律會影響到動物的新陳代謝、血液成分。Olanrewaju等發現,光照不僅影響生理應激指標如皮質酮和葡萄糖的濃度,還影響著體重和部分血液生化指標。長期處于黑暗環境會促進褪黑素的分泌,降低血糖濃度[8]。血液中的膽固醇、血鈣、尿素氮等指標也會受晝夜節律的影響。

不同海拔地區、生長環境也會影響血液生化指標。辛迪在實驗中發現低氧環境下對大林姬鼠血液生理生化指標、呼吸頻率、活動量、取食量、取水量以及心臟、肺、肝、腎等臟器功能都有影響[9]。長期生長在海拔3 000m高原環境下的高原蕨麻小型豬,適應了當地氧分壓低、紫外線照射強、寒冷晝夜溫差變化大的自然環境特點,機體功能發生了適應性的變化,在某些血液生理生化指標上與一般巴馬小豬存在差異[10]。

2.1.4 其他。飲食搭配會對血液中如葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG)、ALP和磷等多種化學物質濃度造成影響。在采血前1d進食含高蛋白的食物,會導致尿素氮(BUN)和血尿酸(UA)濃度較高[11]。進食后血中的脂類尤其是TG濃度升高,可引起血清蛋白呈奶白色樣混濁,對生物化學測量產生影響,可能導致總膽汁酸、蛋白、鈣、磷的測量結果較高,而胃蛋白酶的測量結果稍低。動物禁食時間超過16h,常因饑餓過度而降低血清蛋白(ALB)和GLU濃度值。另外,實驗動物的飲水缺乏也會對各項生化指標造成影響。

應激反應會影響動物的神經中樞,造成體內內源性糖皮質激素代謝增加,引起血象改變,進而引起血清蛋白、乳酸菌、血脂濃度值升高的非酯化反應[12]。因此,要注意操作方法,避免實驗動物出現應激反應。

強烈的肌肉運動對新陳代謝有顯著影響,使得血清蛋白非酯化反應油酸快速降低,繼而升高。劇烈運動時可導致呼吸加深加快,使CO2分壓降低,pH值升高。運動會使心肌細胞耗氧量增加,從而促進心肌細胞酶的釋放,造成血清蛋白(ALB)、天冬氨酸谷丙轉氨酶(AST)、LDH 和 ALP 的濃度值上升。因此,在采血前最好進行30min的休息,以減少動物劇烈活動對檢查結果的影響[13]。

2.2 操作因素 當體位改變時,血液循環與體液循環之間的平衡會發生改變,從而使細胞成分和大分子物質在血清蛋白中的濃度值發生改變。小型實驗動物的采血體位最好是平舉,四肢向外伸展;而大型實驗動物則需要平躺在地面上,也可以平躺在診床上。Ilies等人利用定性和定量分析蛋白質得出,血液收集管的類型和所使用的抗凝劑在一定程度上會影響血液中蛋白和肽數量的變化。血細胞內、外各種成分存在濃度差,因此標本溶血會對檢測結果產生影響。造成標本溶血的主要原因有:穿刺前消毒乙醇未干、注射針或采血管不潔、采血速度過快、猛烈搖晃采血管、抗凝劑和血液比例不合適等。溶血對于血液測量指標值所造成的影響包括:(1)紅細胞中濃度較高的成分逸出,使測量結果偏高,如LDH、AST、K+和CK等。(2)紅細胞成分進入血漿后,會與血清蛋白中的磷酸酯酶發生水解反應,如血細胞鞘磷脂進入血漿后引起檢測物質濃度值發生改變,導致血清蛋白無機磷濃度值顯著升高。(3)血紅蛋白本身濃度會使光學檢測受到影響,例如由重氮試劑法測定溶血癥可引起總膽紅素顯著上升[14]。上述三類影響同時存在于溶血癥樣本中,可互相影響。

影響實驗動物少量采血血液品質的另一關鍵因素是采血頻次。血液的采集對生物都有一定刺激作用,會對測試指標產生影響。1d 內數次開展尾端采血會引起副作用:如血液皮質酮濃度上升等,但當采血工作頻率減少到每日1次時,血液皮質酮濃度值則不會產生以上影響[15]。在大小鼠尾部采血實驗操作中,如要檢測血液皮質酮濃度值指標值,需在24h之后進行2次取樣。應依據藥物和有害物質的特性和新陳代謝特性明確采血時間間隔,提升測試數據信息的真實性和精確性。

2.3 樣本處理方式 混勻是采血后的一個重要步驟,通常將采血管混勻3～8次,且應遵循盡快送檢原則,在最短的時間內送到實驗室。離心后室溫放置半小時,總放置時間最好不超過3h,避免管中內容物的震蕩,防止標本溢出或污染。標本檢驗中要注意避免陽光直射,以4～25℃的適宜環境溫度為宜,根據保存溫度不同進行室溫、低溫或保溫處理。楊艷茹等人認為,生化檢驗結果受采血方法不同、樣本保存方式不同等因素影響較大,肝臟功能指標中的總蛋白(TP)、直接膽紅素(DBL)、總膽紅素(TBL)、AST/ALT與保存溫度和時間的關系較為密切,且樣本保存時間越長、溫度越低,測定AST/ALT的結果就越不準確[16]。

徐公民的研究結果認為,送檢時間15min和2h的患者血液樣本生化指標除血糖值外,其他血液生化指標差異不大[17]。田玫玲等人的研究認為,血液中的各種生物化學指標都會因為血液樣本的放置和處理方式而發生變化,采集到的血液標本如果放置時間過長,就會造成血液中某些生物化學成分的改變[18]。朱科燕等人研究發現,大鼠采血后離心前放置時間延長,血清天門冬氨酸氨基轉移酶、肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶等升高,可導致血清血液中葡萄糖含量降低[19]。

很多檢查項目在正式檢測前都要做準備處理,而及時準確的樣本處理是每個檢測者必須了解遵從的,比如在測定血糖濃度時要及時將血清蛋白分離出來,這樣才能避免糖酵解反應影響試驗結果;電解質溶液的測量也要及時將血清蛋白分離出來,尤其要注意K+的測量,避免體細胞內的K+遷移到體細胞外。生物化學實驗用水水質的好壞直接關系檢驗結果的準確性,應依據儀器設備具體需要提供符合要求的相應水質。實驗試劑應選用合乎政策法規標準生產廠家的商品,同時也要查驗其準字號與生產批準文號等標識。選購回來后應做科學實驗以認證產品質量要求是否相符,一旦認同并投入使用,勿隨便拆換。實驗試劑應按照要求妥當儲存,由專職人員存放,保證有效期內應用,以確保實驗試劑的穩定性。

2.4 給藥因素 麻醉劑因具備可減少穿刺術出錯、緩解細胞損傷和減輕動物痛苦等明顯優點而廣泛應用于臨床試驗中,但麻醉刺激動物產生一些生理與行為的變化,包括造成血流動力學轉變、血液血胺等應激反應指標上升、血糖含量改變以及影響激素類藥物等物質新陳代謝等,以上部分由麻醉劑造成的數據信息誤差可以通過設置對照實驗來校準[15]。因而,必須在合理分辨麻醉劑對科學研究指標的實際危害后,再選擇是否需要麻醉劑。

醫學檢驗結論錯誤(非生理性異常值)的重要因素之一是藥物進入體內所引起的化學物理變化。藥品自身或其他代謝物能夠對有機化學的檢測流程造成影響。藥物可以通過自身的物理特性影響指標值的檢測,如藥物本身具有色彩或能發出熒光,或由于藥物的物理性質,如強氧化性、與蛋白融合成復合物、抑制酶的作用等;還可以通過其生理作用、藥理和毒理功效影響生化檢測,如杜冷丁類藥物會引起唾液淀粉酶和總胃蛋白活性升高。很多藥品的不良反應使肝腎功能、造血機能發生變化,造成檢驗結果出現異常。這類危害一旦出現,即便斷藥也難以恢復。如大量使用青霉素及抗癌化療藥時,常對腎臟功能造成危害,出現尿蛋白、造成腎小球及腎小管損傷。有許多種藥品,如羅紅霉素、對氨基水楊酸等可使腎臟功能出現異常。長期性打點滴會稀釋血樣,導致一些檢驗結果偏低;由于靜脈輸液時高濃度藥品進入到血液中,使很多檢驗結果產生巨變,比如在靜脈輸液葡萄糖水或甘油果糖后,采血所測出的血糖指標會受到影響[20]。輸液會使血液稀釋,且輸注成分可能干擾檢驗結果。最常見的干擾項目是葡萄糖和電解質,因此要盡量避免在輸液過程中采血。

3 實驗動物福利與采血

目前,實驗動物福利的國際公認的3R原則和5項自由原則,為動物實驗研究提供了一個倫理框架[21]。在實施臨床試驗時,應綜合考慮采血方法對實驗動物造成的不良影響,在3R原則的基礎上,盡可能地使用對實驗動物機體損傷最小的采血方法,以保障實驗動物的權利。有研究表明在小鼠的采血過程中,尾靜脈切割收集到的血液與頸靜脈穿刺相比會容易產生溶血癥,但這兩種方式對小鼠造成的損傷類似,因此在相關的科學實驗中,如研究血液變量等實驗中,頸靜脈取血更適合進行多次持續采血[22]。

4 小結

總之,實驗動物采血要依據不同的實驗目的,所需檢測的參數,實驗研究的要求來確定血液樣本的特性。實驗設計時應按照采血的具體要求,選擇相匹配的采血方式及采血頻率,靈活運用采血專業技能,確保實驗的有效開展,與此同時最大限度地減少人為操作對血液樣品所產生的影響。