云木香內生細菌的分離鑒定及其對大麗輪枝菌的抑制作用

金利容 許冬 王玲 叢勝波 楊妮娜 李文靜 尹海辰 黃薇 武懷恒 萬鵬

摘要

從藥用植物云木香中分離得到41株內生細菌，采用細菌16S?rRNA基因測序的方法對這些菌株進行鑒定，結果顯示，這些云木香內生細菌分別屬于6個屬，其中假單胞菌屬Pseudomonas和拉恩氏菌屬Rahnella為優勢菌屬。采用對峙培養方法對這些菌株進行篩選，發現其中12株內生細菌對大麗輪枝菌Verticillium?dahliae具有抑制作用，其中有2株屬于拉恩氏菌屬Rahnella，7株屬于假單胞菌屬Pseudomonas，3株屬于沙雷氏菌屬Serratia。12株內生細菌對棉花黃萎病的溫室防效評估結果表明，假單胞菌屬菌株R16、R113和S12對棉花黃萎病的溫室防效達到55%以上，具有潛在的生產利用價值。

關鍵詞

云木香;?內生細菌;?鑒定;?大麗輪枝菌;?抑菌活性

中圖分類號：

S?476;?S?435621

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023251

Isolation，?identification?of?endophytic?bacteria?from?Aucklandia?costus?and?its?inhibitory?effect?on?Verticillium?dahliae

JIN?Lirong，?XU?Dong，?WANG?Ling，?CONG?Shengbo，?YANG?Nina，?LI?Wenjing，?YIN?Haichen，HUANG?Wei，?WU?Huaiheng，?WAN?Peng*

（Key?Laboratory?of?Integrated?Pest?Management?on?Crops?in?Central?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，

Hubei?Key?Laboratory?of?Crop?Disease，?Insect?Pests?and?Weeds?Control，?Institute?of?Plant?Protection，?Soil?and

Fertilizer?Research，?Hubei?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Wuhan?430064，?China）

Abstract

Fortyone?strains?of?endophytic?bacteria?were?isolated?from?the?medicinal?plant?Aucklandia?costus，?and?the?16S?rRNA?gene?sequencing?method?was?employed?for?their?identification.?The?results?showed?that?the?endophytic?bacteria?belonged?to?six?genera，?with?Pseudomonas?and?Rahnella?being?the?predominant?ones.?Subsequently，?these?isolates?were?screened?via?confrontation?culture，?where?12?isolates?exhibited?inhibitory?effects?against?Verticillium?dahliae，?among?which?two?isolates?were?identified?as?Rahnella?spp.，?seven?isolates?as?Pseudomonas?spp.，?and?three?as?Serratia?spp..?In?a?greenhouse?experiment?evaluating?the?effectiveness?of?these?12?isolates?against?cotton?Verticillium?wilt，?showing?that?the?control?effect?of?R16，?R113，?and?S12?belonging?to?Pseudomonas?exceeded?55%，?indicating?their?potential?utility?in?production.

Key?words

Aucklandia?costus;?endophytic?bacteria;?identification;?Verticillium?dahliae;?antifungal?activity

植物內生菌是寄生在植物體內而不引起植物明顯癥狀的一類微生物，包括真菌、細菌和放線菌等［1］。植物內生菌與宿主植物在長期協同進化過程中形成一種互惠互利的和諧關系，宿主植物為植物內生菌提供合適的環境和營養物質，植物內生菌則能通過促進植物生長［2］、增強植物的抗病及抗逆能力［3］、幫助植物抵御生物或非生物的脅迫等多種方式增強植物的適應性［4］。

我國藥用植物資源豐富，關于中草藥的研究和利用也有著悠久的歷史，現在僅臨床常用的植物藥材就有700余種［5］，很多藥用植物因其特殊的生境蘊藏著豐富而獨特的內生菌資源。之前人們往往更關注藥用植物的醫用價值，但隨著國家大力提倡可持續發展的綠色生態農業，藥用內生菌資源在農業生產上的應用也受到了越來越多的關注。研究表明，一些藥用植物內生菌能夠促進植物生長，例如，從人參組織中分離的多株內生細菌具有產嗜鐵素、產吲哚乙酸等特性，其中有3株內生細菌具有促生特性［6］。從葛根Pueraria?montana?var.?lobata的根瘤、根系和根部愈傷組織分離出的223個菌株中，15株兼具固氮、溶磷、產嗜鐵素、產吲哚乙酸4種促生特性，17株兼具3種促生特性［7］。一些藥用植物的內生細菌是通過合成吲哚乙酸實現其對宿主的促生作用［8］。當小麥接種一株金銀花Lonicera?japonica中分離的內生類芽胞桿菌Paenibacillus菌株后，小麥幼苗生長速率和葉綠素含量顯著提高［9］。一些藥用植物內生菌還能增強植物對重金屬和高鹽等非生物脅迫的耐受能力。從印度高鹽地區的長春花Catharanthus?roseus中分離的耐鹽內生細菌Achromobacter?xylosoxidans通過降低乙烯水平和增加多種抗氧化酶含量而增強植物的鹽脅迫抗性［10］。藥用植物內生菌也能產生一些抗菌活性物質如生物堿、多肽類、萜類等以及一些新的化合物，可用于植物病害的防治。例如，從黃花蒿Artemisia?annua的1株炭疽菌屬Colletotrichum?sp.內生真菌中分離的化合物中有5種對小麥全蝕病菌Gaeumannomyces?graminis?var.?tritici、紋枯病菌Rhizoctonia?cerealis、根腐病菌Bipolaris?sorokiniana和辣椒疫霉Phytophthora?capsici等具有明顯的抑制作用［11］。從雷公藤Tripterygium?wilfordii中分離得到的內生真菌Cryptosporiopsis?cf.?quercina可產生活性化合物cryptocandin，該化合物可抑制核盤菌Sclerotinia?sclerotiorum和灰霉病菌Botrytis?cinerea等多種植物病原真菌活性［12］。然而，目前關于藥用植物內生菌的研究較為匱乏，據不完全統計，近10年來藥用植物內生菌相關研究涉及的種類僅占常用藥用植物的9%左右［5］，可見，藥用植物的內生菌資源亟待開發。

云木香Aucklandia?costus是一種菊科植物，主產于云南、四川等地，現廣泛栽培于我國湖南、湖北、廣東、廣西、陜西、甘肅和西藏等地。云木香在臨床上以根莖入藥，具有健胃消食、行氣止痛、降壓利尿、抗菌止瀉的醫用功效［13］。關于云木香內生細菌的研究，國內尚未見報道。

棉花黃萎病是棉花上的一種重要病害，其病原菌為大麗輪枝菌Verticillium?dahliae，該病的發生會嚴重影響棉花的產量和品質。棉花黃萎病是土傳維管束病害，加上V.dahliae能夠產生抗逆性強且能在土壤中長期存活

的休眠結構微菌核，增加了病害的防治難度。大麗輪枝菌寄生在棉花維管組織內，利用植物內生菌防治此病害具有天然的優勢。

本研究從藥用植物云木香中分離、鑒定內生細菌，篩選對大麗輪枝菌具有抑制作用的菌株，評估分離菌株對棉花黃萎病的溫室防效，旨在挖掘良好的生防菌資源用于棉花黃萎病的防治。

1?材料與方法

1.1?供試材料與培養基

云木香植物為云南省農業科學院提供。落葉型大麗輪枝菌（Vd）菌株V991b為本實驗室保存。

營養瓊脂培養基（NA）：細菌蛋白胨50?g，牛肉浸膏?30?g，氯化鈉?50?g，瓊脂200?g，蒸餾水

1?000?mL，121℃滅菌20?min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200?g，葡萄糖20?g，瓊脂20?g，蒸餾水1?000?mL，121℃滅菌20?min。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏30?g，蛋白胨?50?g，蒸餾水1?000?mL，pH?70。

檸檬酸鹽利用培養基：硫酸鎂02?g，磷酸二氫銨?10?g，?氯化鈉50?g，檸檬酸?20?g，1%溴百里香酚藍3?mL，瓊脂?120?g，蒸餾水1?000?mL，pH?68。

甲基紅試驗及VP試驗培養基：蛋白胨50?g，葡萄糖50?g，磷酸氫二鉀?50?g，蒸餾水1?000?mL，pH?70～72。

明膠液化培養基：蛋白胨?50?g，明膠?1200?g，牛肉浸膏?30?g，?蒸餾水1?000?mL，pH?72～74。

淀粉水解培養基：牛肉浸膏20?g，蛋白胨?175?g，淀粉20?g，瓊脂170?g，?蒸餾水1?000?mL，pH?70。

丙二酸利用培養基：酵母膏?10?g，硫酸銨20?g，磷酸二氫鉀06?g，磷酸氫二鉀04?g，氯化鈉20?g，丙二酸鈉?30?g，溴百里香酚藍?0025?g，蒸餾水1?000?mL，pH?70～74。

1.2?方法

1.2.1?云木香內生細菌的分離

云木香組織用自來水反復沖洗，再用無菌水沖洗3次。用無菌剪刀將其根和莖剪成05?cm的小段，稱取組織10?g，依次用75%乙醇浸泡1?min，5%次氯酸鈉浸泡3?min，75%乙醇浸泡30?s，無菌水沖洗5～8次，最后加入5?mL無菌水，用滅菌研缽將組織研碎，將組織勻漿液用無菌水分別稀釋10倍和100倍，取兩種稀釋液各10、20?μL和100?μL涂布于NA培養基平板中，同時，吸取樣本處理時最后一次無菌水沖洗液100?μL涂布于NA培養基作為對照培養，若培養后無細菌生長，則說明表面消毒徹底。將培養皿置于28℃恒溫培養箱中培養24?h。挑取不同形態的內生細菌單菌落至2?mL?NA液體培養基中，28℃振蕩培養14?h;將菌液在NA平板中劃線培養，挑單菌落，觀察其菌體形態，經多次轉接得到純化菌株，并保存于-80℃低溫冰箱中。

1.2.2?云木香內生細菌16S?rRNA基因序列的分子鑒定

活化所分離的云木香內生細菌，采用細菌基因組提取試劑盒（天根，DP30202）提取菌株基因組DNA，采用16S?rRNA?通用引物27?F?和1492?R（27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′）進行PCR?擴增。PCR?反應程序為：94℃預變性5?min;94℃變性30?s，53℃退火45?s，72℃延伸1?min，35?個循環;72℃延伸10?min。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，根據比對結果初步判斷每個菌株所在屬，進而分析云木香內生細菌的多樣性和優勢菌屬。

1.2.3?篩選對大麗輪枝菌具有抑菌活性的內生細菌

云木香內生細菌對大麗輪枝菌的抑菌試驗采用平板對峙培養法。在大麗輪枝菌V991b的菌落邊緣打取6?mm菌餅，轉接到PDA平板后在25℃條件下黑暗培養2?d，用記號筆在距V991b菌落邊緣15?mm處標記4個點，分別在4個點處加5?μL內生菌菌液，25℃條件下黑暗培養5?d（大麗輪枝菌生長緩慢），以加5?μL無菌水作為空白對照，每處理3次重復。分別在大麗輪枝菌生長2?d和7?d時采用十字交叉法測量V991b的菌落直徑，計算兩者的差值得到5?d內大麗輪枝菌的菌落生長直徑，并按照下列公式計算抑菌率（PI）。

PI=（對照組大麗輪枝菌5?d內的菌落生長直徑-對峙組大麗輪枝菌5?d內的菌落生長直徑）/對照組大麗輪枝菌5?d內的菌落生長直徑×100%。

1.2.4?代表性菌株的形態鑒定和生理生化鑒定

將篩選獲得的具有抑菌活性的代表性菌株在NA平板中劃線，28℃培養16?h后觀察其培養性狀，記錄菌落的大小、顏色、形態、干燥程度等，挑取少許菌體進行革蘭氏染色，參照東秀珠等［14］的方法對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.5?代表性菌株系統發育樹構建

將篩選獲得菌株的16S?rRNA基因序列與GenBank數據庫中相關種屬的16S?rRNA基因序列進行比對分析，用MEGA?51建立系統發育樹。用鄰接法（neighborjoining?method）計算進化距離，采用Pdistance法和Kimura?twoparameter雙參數法構建系統進化樹，進化樹分支的置信度采用bootstrap法分析，重復次數為1?000次。

1.2.6?代表性菌株抑制棉花黃萎病的溫室試驗

將篩選獲得的云木香內生細菌菌株在NA平板上劃線活化16?h（28℃），挑取單菌落用NA液體培養基擴大培養，培養液10?000?r/min離心10?min，棄上清，沉淀用無菌水調整濃度至1×108?cfu/mL備用。將脫絨的常規感病棉花品種‘冀棉11的種子表面消毒后種入盛有營養基質的長方形塑料盒（長×寬×高=440?mm×290?mm×75?mm）中，每個塑料盒留苗30～40株。待棉苗長至2片真葉，用200?mL云木香內生細菌菌液對棉苗進行均勻的灌根處理，每個云木香內生菌菌株對應一個塑料盒，灌根處理3?d后進行大麗輪枝菌的接菌試驗。

大麗輪枝菌的接菌方法：大麗輪枝菌菌株V991b在PDA平板中25℃培養10?d后，用無菌水洗下孢子并過濾，調整孢子濃度至5×106個/mL備用。將棉苗從營養基質中拔出，用自來水輕輕沖洗根部表面，用大麗輪枝菌的孢子懸浮液浸根處理5?min。以先用200?mL無菌水灌根再用大麗輪枝菌的孢子懸浮液浸根作為陽性對照。以均用無菌水處理作為陰性對照。浸根后將每個內生菌菌株處理棉苗和對應的營養基質移栽到一次性塑料缽（直徑×高=70?mm×100?mm）中，一個缽中移栽3～4株棉苗，每處理包括3個重復，1個重復10株棉苗。溫室溫度保持在25～28℃，隔天澆1次水，保持合適的濕度。接種后15、20、25、30?d按5級標準調查和記載發病嚴重度［15］，計算病情指數（DI）和防效，以第30天調查結果為最終評價指標。

DI=∑（各級病株數×相應級值）調查總株數×4×100；

防效=?［（對照病情指數-菌株處理病情指數）/對照病情指數］×100%。

1.3?數據分析

采用IBM?SPSS?Statistics?220軟件進行統計分析。處理間差異采用方差分析（ANOVA）和Duncan氏新復極差法進行檢驗。

2?結果與分析

2.1?云木香內生細菌的分離和鑒定

從云木香的根部和莖部共分離到41株內生細菌菌株，其中從根部分離28株，從莖部分離13株。利用PCR擴增技術獲得41個菌株的16S?rRNA基因序列，測序結果在NCBI數據庫上進行同源性比對，比對結果顯示，有20株與假單胞菌屬Pseudomonas的一致性在99%以上，14株與拉恩氏菌屬Rahnella的一致性在99%以上，3株與沙雷氏菌屬Serratia一致性在99%以上，2株與腸桿菌屬Enterobacter的一致性在99%以上，1株與哈夫尼亞菌屬Hafnia的一致性在99%以上，1株與芽胞桿菌屬Bacillus的一致性在99%以上（表1）。結果表明，云木香內生細菌表現出較為豐富的多樣性，假單胞菌屬和拉恩氏菌屬是云木香內生菌的優勢菌屬。41個菌株中，只有1株是屬于芽胞桿菌門Bacillota的芽胞桿菌綱，而其他40個菌株均屬于變形菌門的γ變形菌綱。

2.2?云木香內生細菌對大麗輪枝菌的抑菌效果

通過對峙培養方法對分離出的41株云木香內生菌進行篩選，獲得12株對大麗輪枝菌具有顯著拮抗作用的菌株（表2，圖1）。其中6株來自根部，6株來自莖部。它們對大麗輪枝菌抑菌率為177%～633%，其中菌株S213的抑菌效果最好（表2）。

1）?表中數據為平均值±標準差。同列不同字母表示經鄧肯氏新復極差法檢驗處理間在005水平上差異顯著。

Data?in?the?table?are?mean±standard?deviation.?Different?letters?in?the?same?column?indicate?significant?differences?at?005?level?based?on?Duncans?new?multiple?range?test.

2.3?對大麗輪枝菌有抑菌活性的菌株的形態和生理生化特性

12株對大麗輪枝菌有抑菌活性的菌株，其菌落形態特征及生理生化特征見表3和表4。菌株R113，R14，R213，R210，S16，R16，S12接觸酶試驗陽性，均能分解利用檸檬酸鹽、丙二酸和明膠，為葡萄糖氧化發酵型，甲基紅試驗和VP試驗陰性，產淀粉酶，屬革蘭氏陰性菌;菌株S213，?S216、R21、S211和S17接觸酶試驗陽性，能分解檸檬酸鹽和丙二酸，不能分解明膠，為葡萄糖氧化發酵型，甲基紅試驗陰性，VP試驗陽性，產淀粉酶，屬革蘭氏陰性菌。

2.4?對大麗輪枝菌有抑菌活性的菌株的分子鑒定

經16S?rRNA基因序列的擴增、測序和比對分析得到12株云木香內生細菌菌株的16S?rRNA基因序列，在NCBI網站上與相關菌屬進行序列比對，

結果顯示，7個菌株R113，R14，R213，R210，S16，R16，S12與假單胞菌屬菌株的序列最相似，2個菌株S211和S17與拉恩氏菌屬菌株的序列最相似，3個菌株S213、S216和R21與沙雷氏菌屬菌株的序列最相似（表5）。

2.5?對大麗輪枝菌有抑菌活性菌株基于16S?rRNA序列的系統發育樹

將12株內生細菌菌株與參考菌株的16S?rRNA序列進行比對分析，用MEGA?510軟件構建系統發育樹，結果如圖2所示。菌株S211和菌株S17與Rahnella?aquatilis及R.aceris的遺傳關系最近，結合細菌的形態特征和生理生化特征，將菌株S211和菌株S17鑒定為拉恩氏菌屬Rahnella?spp.。菌株R14，R213，R210，S16，R16和R113聚于同一分支，與Pseudomonas?koreensis，Pseudomonas?putida及Pseudomonas?chlororaphis的遺傳關系最接近；菌株S12與Pseudomonas?grimontii的遺傳關系最近，因此，菌株R14，R213，R210，S16，R16和R113被鑒定為假單胞菌屬Pseudomonas?spp.，菌株S12被鑒定為Pseudomonas?grimontii。菌株S213，R21和S216與Serratia?sp.的遺傳距離最接近，它們被鑒定為沙雷氏菌屬Serratia?spp.。

2.6?對大麗輪枝菌有抑菌活性菌株對棉花黃萎病的溫室防效

溫室試驗結果（表6）顯示，菌株Pseudomonas?sp.?R16、Pseudomonas?sp.?S12和Pseudomonas?sp.?R113的溫室防效較好，均能達到55%以上，其中菌株Pseudomonas?sp.?R16的防效最好，達到638%。與抑菌試驗的結果進行比較發現，溫室防效與室內平板抑菌效果并不是正相關，菌株Pseudomonas?sp.?R16的防效最好，但是其對大麗輪枝菌的平板抑制率只有235%。菌株Serratia?sp.?S213的平板抑制效果最好，但其溫室防效為465%，低于上述3種假單胞菌。

3?結論與討論

在植物病害的防治中，化學農藥的使用帶來了對生態環境的污染和農藥殘留等眾多問題，生物防治被認為是一種極具應用前景的防治手段。藥用植物內生菌是一種天然的菌種資源，很多藥用植物內生菌能夠產生生物堿、甾體、萜類等抗菌和抗氧化類的代謝產物，對植物生長和植物病害的防治具有積極作用，因此，藥用植物內生菌作為生防因子的開發和利用具有重要的科學價值和廣泛的應用前景。

云木香是一種重要的中草藥。本研究從云木香的根部和莖部分離出41株內生細菌，分屬于6個屬，說明云木香內生菌具有較為豐富的多樣性。其中假單胞菌屬和拉恩氏菌屬是優勢菌屬，分別占比488%和341%，這兩個屬在云木香的根部和莖部都能分離到。文獻記載與藥用植物相關的內生細菌共有11目88屬。最常見的屬為芽胞桿菌屬、泛菌屬Pantoea和假單胞菌屬［16］。很多內生細菌具有生物學功能，如鏈霉菌能夠促進植物的生長發育［17］，芽胞桿菌、假單胞菌和類芽胞桿菌Paenibacillus可以增強藥用植物的抗性和代謝［18］。黃小茜等［7］從葛根組織中分離得到223個菌株，這些菌株隸屬于2門4綱10科19屬，其中芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬Agrobacterium、腸桿菌屬是葛根內生細菌的優勢菌群。張敏等［19］發現，芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬和沙雷氏菌屬Serratia是甘草內生細菌的主要優勢種群。假單胞菌屬是它們共同的優勢菌屬。假單胞菌屬有200多個種，廣泛存在于自然界的土壤、水、動植物體內，該屬細菌既是植物致病菌，也是重要的生防菌［20］。本研究中從云木香的根部和莖部所分離的菌的種類也存在一定的差異，例如，腸桿菌屬和芽胞桿菌屬僅從云木香的根部分離得到，而哈夫尼亞菌屬僅從云木香的莖部分離得到。據報道，不同植物的內生細菌種類存在差異，同一植物的不同部位內生細菌的種類也存在差異。Mcinroy等［21］從生長期的棉花‘DES119的根部和莖部分離到了36個種，棉花根部的優勢菌屬有沙雷氏菌Serratia?spp.、放射性農桿菌Agrobacterium?radiobacter和伯克霍爾德氏菌Burkholderia?solanacearum，棉花莖部的優勢菌有巨型芽胞桿菌Bacillus?megaterium和短小芽胞桿菌Bacillus?pumilus。當然，這種差異可能與分離的菌株數量有關，增加內生菌的分離數量更能體現不同組織的菌株多樣性。

本研究中，我們通過室內篩選從41株云木香內生細菌中獲得12株對大麗輪枝菌具有抑制作用的菌株，并評估了這些菌株對棉花黃萎病的溫室防效，發現室內抑菌作用最好的3個菌株分別是1株沙雷氏菌和2株拉恩氏菌，而溫室防效最好的3個菌株均為假單胞菌，其中菌株Pseudomonas?sp.?R16的防效最好，能夠達到638%。利用假單胞菌對由大麗輪枝菌引起的黃萎病進行生物防治有較為廣泛的報道，如熒光假單胞菌Pseudomonas?fluorescens?PICF7［2223］或惡臭假單胞菌Pseudomonas?putida?PICP5［24］對不同作物如棉花［25］、橄欖［26］、茄子［27］和馬鈴薯［28］等作物上的黃萎病均具有很好的防效。這些菌株通過拮抗作用、競爭作用、重寄生作用以及誘導抗性等多種機制發揮其防效。從結果我們也可以看出，室內抑菌活性和溫室防效的結果并不是完全吻合的，其可能原因在于菌株對棉花黃萎病的防效機制不只是拮抗作用，還通過其他的機制抑制棉花黃萎病菌的生長和繁殖，或者通過多種機制共同發揮作用。未來，我們將篩選防效穩定的菌株開展進一步的機制和應用研究。

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（責任編輯：楊明麗）