小地老虎AiHSP 19.3基因鑒定及其對高溫和殺蟲劑脅迫的響應

邵云飛 張今 王瑩瑩 江連強 劉蘇 仇騰騰 范子明 李茂業

摘要

小地老虎Agrotis?ipsilon是一種重要的農業害蟲。小分子熱激蛋白（sHSP）是細胞抵御外界脅迫的關鍵蛋白，本文旨在探索sHSP基因在小地老虎不同發育階段以及在高溫和殺蟲劑脅迫下的響應模式。使用同源檢索方法從小地老虎轉錄組中鑒定到了一個sHSP

基因的cDNA序列，命名為AiHSP19.3。通過RTPCR技術克隆該序列，利用實時熒光定量PCR技術分析AiHSP19.3基因在小地老虎不同發育階段和不同組織中的轉錄模式，并分析了該基因在高溫和殺蟲劑脅迫下的轉錄水平。結果表明，小地老虎AiHSP19.3基因的開放閱讀框為516?bp，編碼含171個氨基酸，分子量為19.3?kD的蛋白，具有sHSP典型的α晶狀體結構域（ACD）。在供試小地老虎的不同發育階段和3齡幼蟲組織中均能檢測到AiHSP19.3的轉錄，其中在6齡幼蟲和3齡幼蟲脂肪體內轉錄水平最高。小地老虎幼蟲經高溫和3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺及辛硫磷）處理后AiHSP19.3的轉錄水平顯著提高，表明該基因可能在響應高溫及殺蟲劑脅迫中起到重要作用。

關鍵詞

小地老虎;?小分子熱激蛋白;?高溫;?殺蟲劑;?轉錄模式

中圖分類號：

S?433.82

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023261

Identification?of?the?AiHSP19.3?gene?and?its?response?to?high?temperature?and?insecticide?stress?in?Agrotis?ipsilon

SHAO?Yunfei1#，?ZHANG?Jin1#，?WANG?Yingying1，?JIANG?Lianqiang2*，?LIU?Su1，QIU?Tengteng1，?FAN?Ziming3，?LI?Maoye1*

（1.?Key?Laboratory?of?Biology?and?Sustainable?Management?of?Plant?Diseases?and?Pests，?Anhui?Higher?Education?Institutes;

College?of?Plant?Protection，?Anhui?Agricultural?University，?Hefei?230036，?China;?2.?Liangshan?Branch?of?Sichuan?Tobacco

Corporation，?Xichang?615000，?China;?3.?Sinochem?Modern?Agriculture?（Ningxia）?Co.，?Ltd.，?Yinchuan?750021，?China）

Abstract

The?black?cutworm，?Agrotis?ipsilon，?is?an?important?agricultural?pest?insect.?Small?heat?shock?proteins?（sHSPs）?are?crucial?for?cellular?defense?against?external?stresses.?This?study?aims?to?explore?the?response?patterns?of?sHSP?gene?in?different?developmental?stages?of?A.ipsilon?and?under?high?temperature?and?insecticide?stresses.?A?cDNA?sequence?of?sHSP，?AiHSP19.3，?was?identified?from?the?A.ipsilon?transcriptome?using?homology?search?and?subsequently?cloned?by?RTPCR.?The?transcriptional?pattern?of?the?AiHSP19.3?gene?in?different?developmental?stages?and?tissues?of?A.ipsilon?was?analyzed?using?realtime?quantitative?PCR，?along?with?transcript?levels?under?high?temperature?and?insecticide?stresses.?The?results?showed?that?the?open?reading?frame?of?AiHSP19.3?was?516?bp，?encoding?a?protein?consisting?of?171?amino?acids?with?a?molecular?weight?of?19.3?kD.?AiHSP19.3?contained?an?αcrystallin?domain?（ACD），?a?hallmark?feature?of?sHSP.?Transcription?of?AiHSP19.3?was?detected?in?all?tested?developmental?stages?and?3rdinstar?larval?tissues，?with?the?highest?level?observed?in?the?6thinstar?larvae?and?fat?body?of?3rdinstar?larvae.?Transcription?levels?of?AiHSP19.3?significantly?increased?in?larvae?after?treatment?with?high?temperature?and?three?insecticides?（lambdacyhalothrin，?chlorantraniliprole，?and?phoxim），?indicating?that?this?gene?may?play?an?important?role?in?responding?to?high?temperature?and?insecticide?stresses.

Key?words

Agrotis?ipsilon;?small?heat?shock?protein;?high?temperature;?insecticides;?transcriptional?pattern

熱激蛋白（heat?shock?protein，HSP）也稱為熱休克蛋白，是一類普遍存在于生物體內的分子伴侶［1］。根據分子量大小、氨基酸序列和功能，HSP可分為HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白（small?heat?shock?protein，?sHSP）等不同家族［2］。sHSP于1974年從黑腹果蠅Drosophila?melanogaster中發現，分子量介于12～42?kD，結構較為保守，都含有N末端區域、C末端區域和C端延伸區3部分，且C末端區域通常具有一個α晶狀體結構域（αcrystallin?domain，?ACD）［3］。

在生物體內，sHSP是細胞抵御外界脅迫的關鍵蛋白，可以有效阻止細胞質中的其他蛋白質發生變性［4］。在昆蟲中，sHSP響應極端溫度、病原微生物和殺蟲劑等外界脅迫，增強昆蟲對環境的適應能力。例如，柞蠶Antheraea?pernyi?sHSP21在其抵御外界高溫脅迫時具有保護機體穩定的作用［5］;小菜蛾Plutella?xylostella?多個sHSP在響應高溫及農藥脅迫中發揮關鍵作用［6］。此外，昆蟲sHSP還能調節生長發育、生殖和滯育等［7］。

小地老虎Agrotis?ipsilon屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一種重要的遷飛性農業害蟲，對玉米、小麥、棉花和蔬菜等多種糧食和經濟作物造成嚴重危害［8］。小地老虎幼蟲白天藏于表土層，夜間取食幼苗，經常導致田間作物缺苗斷壟［9］。極端溫度是影響昆蟲個體生理和種群動態的重要因子［10］，高溫同樣會對小地老虎的發生與為害產生影響［11］。另一方面，當前對小地老虎的防治主要依賴化學農藥，其中高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷是3種常用的防治藥劑［1214］。在高溫和殺蟲劑脅迫下，小地老虎可能會通過調控sHSP基因的轉錄水平來增強蟲體抵御外界脅迫的能力。但截至目前，關于小地老虎sHSP基因及其響應外界脅迫的研究非常有限。

本研究針對小地老虎1個小分子熱激蛋白基因，對其編碼的蛋白質序列進行生物信息學分析，并研究高溫和3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷）處理后該基因轉錄水平的變化，以期為探明其在小地老虎響應高溫及殺蟲劑脅迫中的功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

本研究所用小地老虎為本實驗室飼養種群。1齡和2齡幼蟲飼喂大白菜，幼蟲進入3齡后轉移至玻璃指形管中（每管1頭），飼喂人工飼料直至化蛹。羽化的成蟲用10%（V/V）蜂蜜水飼養。幼蟲和成蟲的飼養條件均為溫度（25±1.0）℃，相對濕度（65±2）%，光周期L∥D=16?h∥8?h。選取1～6齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲進行后續試驗，其中1齡幼蟲50頭，其余齡期幼蟲、蛹和雌雄成蟲均取15頭。另取3齡幼蟲30頭，在冰上解剖獲得表皮、中腸、馬氏管和脂肪體等組織。樣本收集和組織解剖均設置3次生物學重復，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2?高溫處理

取生長狀況較為一致的小地老虎3齡幼蟲，置于潔凈的玻璃試管（11?cm×2.5?cm）中，每管1頭，置于25（對照）、32、35、38℃和41℃的恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）中處理1?h后立即放入液氮中冷凍，隨后轉入-80℃冰箱保存。每處理設3次生物學重復，每個重復包括20頭試蟲。

1.3?殺蟲劑處理

高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺購自上海阿拉丁公司;辛硫磷購自北京百靈威公司。3種藥劑純度均≥97%。配制3種殺蟲劑的LC50濃度藥液，用浸蟲法處理小地老虎3齡幼蟲，分別在處理后3、6、12、24?h和48?h收集存活試蟲，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱。以等量丙酮水溶液處理作為對照。每處理進行3次生物學重復，每個重復包含30頭試蟲。

1.4?AiHSP19.3克隆與序列分析

使用RNAiso?Plus試劑（寶生物，大連）提取各小地老虎樣本的總RNA，分別使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop?2000超微量分光光度計（Thermo?Fisher?Scientific，美國）檢測RNA完整性和濃度。使用Hifair?Ⅲ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?SuperMix?for?qPCR（gDNA?digester?plus，翌圣，上海）合成cDNA。

利用BioEdit軟件中的BLAST程序，以同為鱗翅目的云杉色卷蛾Choristoneura?fumiferana?sHSP序列為模板［15］，檢索已公布的小地老虎轉錄組［16］，得到1條編碼小地老虎sHSP的cDNA序列，命名為AiHSP19.3。據此設計基因特異性引物（表1），以小地老虎cDNA為模板擴增AiHSP19.3。PCR擴增體系（50?μL）：2×Taq?MasterMix（Dye）（康為，江蘇）25?μL，10?μmol/L上、下游引物各2?μL，cDNA模板1?μL，超純水20?μL。反應程序為：94℃?2?min;94℃?30?s，55℃?30?s，72℃?30?s，35個循環;72℃?2?min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化回收后連入pColdⅡ表達載體，送通用生物（安徽）股份有限公司測序。使用ORFfinder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測AiHSP19.3的開放閱讀框;使用ExPASy工具（web.expasy.org/compute_pi/）計算AiHSP19.3理論分子量和等電點;分別使用SignalP?5.0（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM?2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測信號肽和跨膜區;多序列聯配使用Clustal?Omega程序進行（www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/）;使用MEGA?11軟件的鄰近法（neighborjoining?method）構建系統進化樹，各進化分支的置信度采用bootstrap法進行1?000次重復檢驗［17］。

1.5?AiHSP19.3基因轉錄模式分析

利用實時熒光定量PCR分析AiHSP19.3的轉錄模式。所用引物見表1。以小地老虎核糖體蛋白（RpS3）和肌動蛋白（βactin）基因作為雙內參基因。熒光定量PCR反應體系（20?μL）：Hieff?qPCR?SYBR?Green?Master?Mix（翌圣，上海）10?μL，10?μmol/L上、下游引物各0.4?μL，cDNA?1?μL，超純水8.2?μL。擴增反應在CFX96型定量PCR儀（BioRad，美國）上進行，反應程序為：95℃?5?min;95℃?10?s，60℃?30?s，40個循環。試驗設3次生物學重復，使用Pfaffl方法［18］計算相對轉錄水平。

1.6?數據統計與分析

使用DPS?7.05軟件進行統計分析，其中不同發育歷期，不同組織，不同溫度和殺蟲劑不同處理時間之間AiHSP19.3轉錄水平的差異顯著性采用單因素方差分析（Oneway?ANOVA）和Duncan氏新復極差法進行檢驗，顯著性水平設為α=0.05。

2?結果與分析

2.1?AiHSP19.3基因序列及系統進化位置

從小地老虎轉錄組中鑒定到一個編碼小分子熱激蛋白的cDNA序列，命名為AiHSP19.3，該序列包含516?bp的開放閱讀框，編碼1個由171個氨基酸殘基組成的蛋白質。在線軟件預測表明，該蛋白理論分子量為19.3?kD，等電點為5.67。結構域分析表明AiHSP19.3具有可變的N末端區域（氨基酸殘基1－62），保守的α晶狀體結構域（氨基酸殘基63－141）和C末端區域（氨基酸殘基142－171），是一種典型的sHSP。AiHSP19.3氨基酸序列中未預測出信號肽序列和跨膜區，表明該蛋白位于胞質內。BLAST比對結果顯示，AiHSP19.3與草地貪夜蛾Spodoptera?frugiperda?SfHSP19.3（登錄號：XP_035456993.1;一致性90.06%）、黏蟲Mythimna?separata?MsHSP19.3（登錄號：ATN45241.1;一致性90.00%）和斜紋夜蛾Spodoptera?litura?SlHSP19.3（登錄號：XP_022837060.1;一致性89.47%）具有較高的氨基酸一致性。多序列聯配結果（圖1）表明，AiHSP19.3具有保守的α晶狀體結構域，且與其他昆蟲的sHSP序列具有較高的相似性。基于不同物種sHSP的氨基酸序列構建的系統進化樹顯示，AiHSP19.3與鱗翅目昆蟲sHSP聚為同一進化分支，且與草地貪夜蛾SfHSP19.3（登錄號：XP_035456993.1）親緣關系最近（圖2）。

2.2?AiHSP19.3時空轉錄模式

AiHSP19.3在所有齡期小地老虎樣本中均能檢測到轉錄（圖3a），在1齡和2齡幼蟲期轉錄水平最低，其后隨著齡期增加，轉錄水平逐漸升高，在6齡幼蟲期轉錄水平達到最大，且顯著高于其他發育階段（圖3a）。在蛹期和成蟲期，AiHSP19.3轉錄水平顯著下降（圖3a）。AiHSP19.3在小地老虎3齡幼蟲不同組織中也有不同程度的轉錄（F3，8=309.40，P=0.000?1），在脂肪體中的轉錄水平最高，且顯著高于其在體壁、馬氏管和中腸中的轉錄水平（圖3b）。

2.3?AiHSP19.3在高溫脅迫下的轉錄模式

高溫處理1?h對AiHSP19.3轉錄水平有顯著影響（F4，10=39.14，P=0.000?1）。其中，32℃處理誘導AiHSP19.3轉錄水平升高至對照組的1.97倍;35℃處理下AiHSP19.3轉錄水平上調最高，達到對照組的2.52倍。但當溫度繼續升高至38℃和41℃時，AiHSP19.3的轉錄水平開始下降，但仍顯著高于對照組（圖4）。

2.4?AiHSP19.3在殺蟲劑脅迫下的轉錄模式

3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷）LC50劑量處理均能誘導AiHSP19.3轉錄水平顯著上調（高效氯氟氰菊酯：F5，12=166.49，P=0.000?1;氯蟲苯甲酰胺：F5，12=77.31，P=0.000?1;辛硫磷：F5，12=120.29，P=0.000?1），AiHSP19.3轉錄水平分別在高效氯氟氰菊酯處理后12?h，氯蟲苯甲酰胺處理后3?h和辛硫磷處理后6?h達到最高（圖5）。同時觀察到，3種藥劑處理后，AiHSP19.3轉錄水平均呈現先上升后下降的趨勢，但始終高于對照組。

3?結論與討論

已有研究報道，昆蟲絕大多數sHSP含有1個α晶狀體結構域，該結構域在分子識別和分子伴侶功能方面具有重要作用，并且可作為sHSP的典型特征［1920］。本研究通過分析小地老虎AiHSP19.3序列，發現該基因編碼的蛋白質具有α晶狀體結構域，表明AiHSP19.3屬于典型的sHSP。AiHSP19.3序列的獲得為深入分析該基因響應外界脅迫的分子機制奠定了基礎。

前人研究表明，大部分昆蟲sHSP基因在其不同發育階段和不同組織中的轉錄水平均不相同。如棉鈴蟲Helicoverpa?armigera?sHSP22.0在4齡和5齡幼蟲期轉錄水平最高，而在蛹期和成蟲期轉錄水平極低［21］;煙草甲Lasioderma?serricorne?HSP21.7在血淋巴中的轉錄水平顯著高于其在表皮、中腸與脂肪體中的轉錄水平［22］。本研究在小地老虎不同發育階段均檢測到AiHSP19.3轉錄，但該基因在6齡幼蟲期的轉錄水平顯著高于其他齡期。sHSP基因在高齡幼蟲期大量轉錄的現象也普遍存在于其他昆蟲中，例如棉鈴蟲sHSP22.0和桃蚜Myzus?persicaes?HSP22.0均在高齡幼蟲個體中轉錄水平最高，以此增強其對外界脅迫的耐受性［21，23］。由此推測AiHSP19.3可能參與小地老虎高齡幼蟲抵御外界脅迫。通過組織特異性分析發現，AiHSP19.3在小地老虎3齡幼蟲脂肪體中的轉錄水平顯著高于其他組織。脂肪體不僅是昆蟲重要的代謝和貯能器官，還參與昆蟲生長、發育和生殖等過程［24］。推測AiHSP19.3在脂肪體中高轉錄可能與小地老虎sHSP合成、代謝調節及變態發育有關。

sHSP對高溫脅迫的響應是昆蟲適應外界溫度變化的重要保護機制［25］。本研究發現AiHSP19.3轉錄水平在高溫處理后均顯著上調。高溫脅迫引起昆蟲sHSP轉錄水平上調的現象在其他昆蟲中多有報道，例如腰帶長體繭蜂Macrocentrus?cingulum在受到高溫脅迫后其HSP23.8基因轉錄水平會顯著增加［26］;高溫脅迫下小菜蛾12個sHSP基因轉錄水平均顯著上調［6］。AiHSP19.3在高溫脅迫下轉錄水平顯著上調，表明它可能參與了小地老虎響應高溫脅迫的過程，在保護蟲體的正常生理活動中發揮重要作用。

除了極端高溫之外，殺蟲劑也是昆蟲重要的外界脅迫因子。昆蟲sHSP在響應殺蟲劑脅迫中的作用已有報道，白蛾周氏嚙小蜂Chouioia?cunea經蘇云金芽胞桿菌、阿維菌素、高效氯氰菊酯和滅幼脲4種農藥處理后其sHSP12.2基因轉錄水平均顯著增加［27］;此外，當草地貪夜蛾、中華按蚊Anopheles?sinensis和舞毒蛾Lymantria?dispar等昆蟲受到氯蟲苯甲酰胺、擬除蟲菊酯和甲萘威等藥劑脅迫后，sHSPs基因轉錄水平均顯著上調［2830］。本研究發現小地老虎幼蟲經LC50劑量高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷處理后AiHSP19.3基因轉錄水平均顯著上調，推測其細胞內可能會大量合成AiHSP19.3蛋白，進而增強小地老虎對殺蟲劑的防御能力。有研究表明，桃蚜和中華蜜蜂Apis?cerana?cerana在殺蟲劑處理后體內活性氧含量升高，產生氧化脅迫，sHSP隨之大量表達，以增強試蟲對活性氧的耐受性［23，31］。此外，本研究還發現3種殺蟲劑處理后，小地老虎AiHSP19.3基因轉錄水平達到最高的時間不同，這可能是由于試蟲在不同殺蟲劑脅迫下存在不同的反應機制，從而導致了響應時間上的差異。

綜上所述，本研究闡明了小地老虎AiHSP19.3的序列特征、系統進化關系和轉錄模式，發現高溫及3種殺蟲劑均能誘導AiHSP19.3基因轉錄水平顯著上調，表明AiHSP19.3可能參與了小地老虎高溫和殺蟲劑脅迫的過程。

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（責任編輯：楊明麗）