不同蔬菜種植對蝦菜共生系統中微生物群落結構的影響

任思齊 應趙晗 吳昕睿 李明 賀文芳 田磊 徐勇斌 程霄玲 鄭善堅

摘要 ［目的］研究蕹菜、甘薯、枸杞對蝦菜共生系統中微生物群落結構的影響。［方法］通過高通量測序技術分析種植不同蔬菜的蝦菜共生系統中微生物群落組成，并檢測該系統中的硝酸鹽、磷酸鹽指標。［結果］不同蝦菜共生系統中水體微生物共同的OTU數目為450種，其中，枸杞組（LM）的OTU數目最多，為852種，且Shannon-Wiener指數和Simpson指數最高；蕹菜組（IF）對硝酸鹽、磷酸鹽去除率分別達65.70%和67.57%，且與其他組群落結構差異顯著（P<0.05）。在門水平上，不同系統中水體的優勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、Patescibacteria；在屬水平上，不同系統中的優勢菌群為紅球菌屬（Rhodococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）。［結論］甘薯和枸杞更有利于維持水環境的穩定，蕹菜對硝酸鹽、磷酸鹽去除效果更好。

關鍵詞 蝦菜共生；蔬菜種植；微生物；群落結構；高通量測序

中圖分類號 S182；S917.1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）10-0103-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.022

Effects of Different Vegetable Cultivation on the Microbial Community Structure in Shrimp-vegetable Symbiotic System

REN Si-qi1，2，YING Zhao-han1，WU Xin-rui1 et al

（1. College of Bioscience， Zhejiang Normal University， Jinhua，Zhejiang 321004;2. Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province， Jinhua，Zhejiang 321004）

Abstract ［Objective］ To study the effects of Ipomoea aquatica， Ipomoea batatas and Lycium chinense on the microbial community structure in shrimp-vegetable symbiotic system.［Method］The composition of microbial community in shrimp-vegetable symbiotic system growing different vegetables was analyzed by high-throughput sequencing technique， and the indexes of nitrate and phosphate in the system were detected. ［Result］The number of OTU shared by microorganisms in different shrimp-vegetable symbiotic systems was 450 species，among them， the number of OTU in Lycium chinense group （LM） was the highest （852 species）， and the Shannon-Wiener index and Simpson index were the highest. The removal rates of nitrate and phosphate in Ipomoea aquatica （IF） were 65.70% and 67.57%， respectively， and the community structure was significantly different from other groups （P<0.05）. At the gate level， the dominant flora in different systems were Proteobacteria， Actinobacteria and Patescibacteria.At the genus level，while the dominant flora in different systems were Rhodococcus， Acinetobacter and Glutamicibacter. ［Conclusion］Ipomoea batatas and Lycium chinense were more beneficial to maintain the stability of water environment， and Ipomoea aquatica was more effective in removing nitrate and phosphate.

Key words Shrimp-vegetable symbiosis;Vegetable cultivation;Microorganism;Community structure;High-throughput sequencing

基金項目 金華市重點研發項目（2021-2-017）；浙江省重點研發項目（2020C02014）。

作者簡介 任思齊（1998—），男，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：水生動物生態學。

*通信作者，教授，碩士，碩士生導師，從事水生生物學研究。

收稿日期 2023-08-01；修回日期 2023-08-24

蝦菜共生系統是基于魚菜共生系統的一種新發展，利用養殖系統中的對蝦排泄物（包括顆粒廢物固體和溶解的營養物質）作為營養介質，種植可食用蔬菜［1］，系統中的微生物群落可降解對蝦排泄物，有助于植物吸收，并降低水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽等含氮、高磷營養鹽，從而改善養殖水質，使對蝦養殖系統處于穩定狀態。因此，蝦菜共生系統在水資源循環利用、養殖廢棄物高效處理等方面具有明顯的優勢［2-3］。總體來說，與傳統農業相比，蝦菜共生系統很好地利用蝦-菜-菌之間的互作關系，減少了碳排放和水污染。近年來隨著分子生物學的發展，尤其是高通量測序技術的研發及應用，使該技術能夠較準確地定性和定量分析微生物的多樣性和豐度，有利于精準了解蝦菜共生模式下的微生物群落結構［4-9］。

凡納濱對蝦（Penaeus vanmamei）是一種生長快、適應性強的養殖品種，總體上認為5‰以上的鹽度對蝦的生長和成活率相對較好。在生產實踐表明，蕹菜（Ipomoea aquatica Forssk.）、甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam.］和枸杞（Lycium chinense Mill.）3種植物都可在蝦菜共生系統中具有較好的生長優勢。研究表明，室內對蝦循環水養殖對養殖水體水質具有良好的調節效果，可有效控制養殖水體 COD、NH+4-N和NO-2-N濃度，具有較強的可行性［3，10-12］，且在魚菜共生模式下，蕹菜對水體氮磷處理及微生物群落變化的研究頗多，該模式對保持根際微生物在提高蔬菜對環境脅迫的抗逆性上有重要作用，能有效促進植物的生長［13-15］。甘薯和枸杞也是常見的經濟作物且這2種作物具有較高的藥用價值［16］。但現有研究都缺乏不同植物對蝦菜共生系統中水體微生物多樣性的相關研究。因此，該研究在以凡納濱對蝦為養殖對象的蝦菜共生系統中，探究栽培蕹菜、甘薯、枸杞3種植物對水體微生物多樣性的影響，以期為蝦菜共生系統微生物的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

基于蝦菜共生系統設計試驗裝置，裝置包括養殖缸和種植槽兩部分。養殖缸長30.0 cm、寬21.0 cm、高24.5 cm，養殖缸上方嵌套種植槽，種植槽長30 cm、寬21 cm、高12 cm。種植槽進水管口接10 cm長的200目發酵過濾袋，用于破碎顆粒有機物。種植槽填埋10 cm厚的陶粒和火山石，蔬菜種植在陶粒上。水泵抽取養殖水經發酵過濾袋過濾后，水溶性有機物經陶粒生物降解，產生的營養鹽被蔬菜吸收后，經溢流口流回養殖區。

試驗周期21 d，試驗所選蔬菜蕹菜、甘薯、枸杞均為人工栽培的幼苗，根系生長健全。分別選取植株大小相似的菜苗進行試驗，試驗分別為蕹菜組（IF）、甘薯組（IL）和枸杞組（LM）。每個種植槽栽植12株，設置3個平行組。并同時設置空白組（CK）。試驗缸放置5.5 L養殖水，養殖水取自蝦菜共生養殖基地（水體鹽度為5‰、pH 8.17、硝酸鹽0.37 mg/L、磷酸鹽5.35 mg/L、氨氮0.12 mg/L、亞硝酸鹽0.06 mg/L）。由于對蝦在生長過程中會吸收離子元素和排出代謝廢物等，因此，為排除對蝦這一因素對系統的干擾，該系統采用蔬菜養殖區和水循環區進行試驗。

1.2 樣品采集

用孔徑0.22 μm的醋酸纖維素濾膜（Merk Millipore，USA）對試驗前后的水樣進行真空抽濾，濾膜裝入滅菌后的離心管，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。利用 Ezup柱式細菌基因組 DNA 提取試劑盒采取水樣DNA（上海生工生物工程股份有限公司），對提取后的 DNA 經瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量和完整性后，進行提取基因組DNA，用帶有barcode的特異引物擴增16S rDNA的V3～V4區。

1.3 Illumina Miseq測序

引物序列為341F（CCTACGGGN-GGCWGCAG-3′）和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT-5′）。 將純化后的擴增產物連接測序接頭并構建測序文庫，最后送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行Illumina上機測序。

1.4 數據分析

將測序獲得的raw reads進行低質量reads過濾（FASTP軟件），并進行Tags拼接（FLASH軟件）、Tags過濾、OTU聚類（USEARCH軟件的UPARSE算法）和Tags去嵌合體（USEARCH軟件的UCHIME算法）；使用Qiime軟件進行Alpha多樣性分析；以相關系數絕對值>0.5且P<0.05為閾值，篩選展示滿足條件的結果，繪制物種豐度柱狀圖；使用R語言vegan包進行維恩圖分析；使用R語言GUniFrac包，基于OTU序列進化樹和OTU豐度表，計算weighted unifrac距離指數；使用 FAPROTAX（functional annotation of prokaryotic taxa）軟件，結合 SILVA的物種注釋并整合原核功能數據庫，構建 “物種-生態功能分類”的關系網絡。

2 結果與分析

2.1 樣品測序質量及復雜度分析

該試驗共得到12個樣品（對照組CK-3在收集樣品時被污染，以11個樣本進行展開分析）。從11個樣品中得到的平均原始序列為112 854條，構建OTU分類信息單元且獲得注釋信息的平均Tags數為83 782條，有效率達到74.24%。測序樣品檢測到OTU平均數（相似度大于97%）為765種（表1）。

稀釋曲線可直接反映測序數據量的完整性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。對樣品進行多次隨機抽樣，構建稀釋曲線如圖1a所示，在隨機抽取的測序數量大于40 000種時，曲線趨于平緩，表明測序數量漸進合理。當測序數量≥60 000種時，微生物群落OTU數目表現為LM>CK>IL>IF。樣品相對豐度稀釋曲線（圖1b）直觀地反映了樣品中物種的豐富度和均勻度。LM組在水平方向上的跨度較大，表明枸杞組水體微生物的豐富度較高；而CK組在垂直方向上曲線的跨度較小，表明其水體微生物的均勻程度相對較低。

2.2 微生物群落組成分析

將培養21 d后的3個組與CK組初始水樣微生物進行對比，根據物種注釋結果，選取各樣品豐度排名前10的物種，以門（Phylum）、屬（Genus）水平為例繪制物種相對豐度圖（圖2）。

在門水平上，有以下10種相對豐度較大的物種，分別是Dependentiae、彎曲桿菌門（Epsilonbacteraeota）、衣原體門（Chlamydiae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Patescibacteria、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）。從門分類水平上細菌相對豐度變化趨勢分析，初始水體門級微生物分布如CK所示，其優勢菌門為變形菌門（71.17%）、擬桿菌門（13.70%）、厚壁菌門（9.54%）。經過21 d的培養，蕹菜組（IF）水體的優勢菌門為變形菌門（59.15%）、放線菌門（18.95%）、Patescibacteria（15.77%）；甘薯組（IL）水體的優勢菌門為放線菌門（47.12%）、變形菌門（38.23%）、擬桿菌門（4.73%）；枸杞組（LM）水體的優勢菌門為變形菌門（39.85%）、放線菌門（32.41%）、Patescibacteria（16.41%）。

在屬水平上，有以下10種相對豐度較大的物種，分別是分枝桿菌屬（Mycobacterium）、檸檬酸桿菌屬（Limnobacter）、NS3a_marine_group、甲基過苜蓿屬（Methyloversatilis）、紅桿菌屬（Rhodobacter）、類節桿菌屬（Paenarthrobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）。從屬分類水平上細菌相對豐度變化趨勢分析，初始水體屬級微生物分布如CK所示，其優勢菌屬為紅桿菌屬（8.03%）、葡萄球菌屬（5.98%）。同樣經過21 d的培養，蕹菜組（IF）水體的優勢菌屬為不動桿菌屬（23.06%）、谷氨酸桿菌屬（7.19%）、紅球菌屬（5.84%）；甘薯組（IL）水體的優勢菌屬為紅球菌屬（38.17%）、不動桿菌屬（11.96%）、類節桿菌屬（5.04%）；枸杞組（LM）水體的優勢菌屬為紅球菌屬（19.57%）、不動桿菌屬（13.01%）、谷氨酸桿菌屬（9.78%）。紅球菌屬、不動桿菌屬雖在各樣品中均存在，因其環境因子的變化導致其所占比例存在明顯差異，說明水體微生物的組成受到環境的影響。

根據OTU數目及屬水平聚類分析結果和研究需求，將所有樣品進行均一化處理，基于各組之間共有和特有的OTU數目繪制Upset圖（圖3）。從圖3可以看出不同樣品OTU數目組成相似性及重疊情況，LM組OTU數目最多，為852種，IL組最少，為787種；3組共有的OTU數目為450種，不同樣品中特有OTU數目表現為IF組最高（269種），LM組次之（234種），IL組最少（184種）。屬水平上，3組共有的OTU數目為159種，IF組特有的OTU數目為39種，IL組和LM組分別為24和20種。IF組2個水平的特有OTU數目均最高。

2.3 微生物多樣性分析

Alpha多樣性主要關注樣品中微生物群落多樣性［17］，通過該分析方法來反映樣品中微生物群落的多樣性和豐富度。從表2可以看出，4個水樣微生物的Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson多樣性指數排序均為LM>IF>IL>CK，表明枸杞組根系水樣中微生物群落多樣性相對較高。Chao1指數和ACE指數分別用于估算樣品中所含OTU數目和物種組成的豐富度、均勻度。枸杞組（LM）的Chao1指數最高，與實測的OTU數目相吻合，表明枸杞組（LM）細菌種類數量最多、群落豐度也最高。CK組的ACE指數最高，與實測的OTU數目最低有所偏差，可能是由于一些物種比其他物種更容易被檢測到，從而出現物種豐富偏差，導致ACE指數偏高。

該研究中這2種指數的變化趨勢除CK組外大體一致，均表現為枸杞組（LM）最大、蕹菜組（IF）最低，表明前者中含有的OTU數目最多，即微生物種類數量和豐度最高，而后者最低。

偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA）經常用來處理分類和判別問題，對3組蔬菜相似度進行比較。基于OTU水平的PLS-DA排序結果見圖4，第1主成分（t1）為44.5%，第2主成分（t2）為28.9%。不同分組樣本使用不同顏色表示，樣本組成越相似，樣本在圖形上的距離越近，IL組和LM組都在第一象限，CK組在第二象限，IF組在第三象限，可見甘薯組（IL）和枸杞組（LM）差異最小。

2.4 聚類分析

為了進一步得到不同樣品間群落結構差異，基于Weighted Unifrac距離并對OTU進行多序列比對構建非加權組平均聚類樹（UPGMA），結果如圖5所示，甘薯組（IL）與枸杞組（LM）相似度最高，與PLS-DA分析結果相同。

2.5 功能預測

根據FAPROTAX［18］預測出水樣中生態功能的相對豐度，結果發現（圖6），整體細菌群落功能注釋相對豐度較高，不同組別之間細菌群落功能注釋相對豐度相差較大。蕹菜組（IF）中細菌群落功能注釋相對豐度最高，主要體現在硝酸鹽反硝化作用（nitrate_denitrification）、亞硝酸鹽反硝化作用（nitrite_denitrification）、硝化作用（nitrification）、氮的吸收（nitrogen_respiration）等功能上。甘薯組（IL）中細菌群落功能注釋相對豐度最低，化合異化作用（chemoheterotrophy）、硝酸鹽還原（nitrate_reduction）、尿素降解（ureolysis）等具有相對較高的豐度。枸杞組（LM）中細菌群落功能注釋相對豐度較高，其中纖維素分解（cellulolysis）、光自養（photoautotrophy）、含氧光合作用（oxygenic_photoautotrophy）等豐度較高。

2.7 水質變化

為期21 d試驗，各系統的環境較為穩定［水溫（27.3±1.0）℃、溶解氧（5.54±0.50）mg/L、pH 8.17±0.04、亞硝酸鹽（0.06±0.02）mg/L、氨氮（0.12±0.05）mg/L］。水質變化情況如圖7所示，3種蔬菜對養殖水體的硝酸鹽、磷酸鹽的去除均有較好的效果。蕹菜組（IF）、甘薯組（IL）、枸杞組（LM）對硝酸鹽的去除率分別為65.70%、46.18%、40.09%，該結果與“2.6”功能分析結果相同，蕹菜組的去除率顯著高于甘薯組和枸杞組（P<0.05）。水體磷酸鹽濃度在試驗時間內總體保持持續下降的趨勢，蕹菜組、甘薯組、枸杞組對水體磷酸鹽的去除率分別達到67.57%、50.00%、52.70%，蕹菜組對水體中磷酸鹽的去除率顯著高于其他蔬菜組（P<0.05）。

3 討論

3.1 微生物群落組成分析

門水平上的物種豐度圖顯示，對照組（CK）的優勢菌群為變形菌門和擬桿菌門，但整體菌群分布不均勻，變形菌門占絕對優勢。與對照組（CK）相比，試驗組水體的總體菌群分布更為均勻，優勢菌門為變形菌門和放線菌門。變形菌門是一種多功能細菌，能夠去除氮和磷，降解有機物和減少化學需氧量，高比例變形菌門對于系統脫氮具有重要作用［19-20］；有研究發現擬桿菌門對于降解養殖水體中可溶性有機物具有重要作用［19，21-22］。有研究表明，放線菌門可降解有機物，包括淀粉、蛋白質等大分子，并產生抗生素等抗菌物質［23］。該試驗養殖池中放線桿菌門的增加有助于產生抗菌物質，甘薯組（IL）的放線菌門豐度明顯高于其他兩組，因此甘薯更有益于蝦菜共生池的穩定。試驗組的變形菌門豐度有所降低，其原因可能為養殖池中對蝦排出的氮磷廢物及代謝有機物殘留，導致原池中對照組（CK）的變形桿菌較多，但經過蔬菜培養池后，水體中的氮磷和有機物減少，從而使變形菌門減少。

屬水平上的物種豐度圖顯示，對照組（CK）中的優勢菌屬為紅桿菌屬和葡萄球菌屬，其他菌屬所占比例較少。與對照組（CK）相比，試驗組的水體菌屬變化差異較大，紅球菌屬和谷氨酸桿菌屬的占比大幅提高，其中枸杞組（LM）總體菌屬分布最為均勻。紅桿菌屬細菌被認定是新型的抗逆防病的益生菌資源和水產養殖動物腸道的核心定殖菌群［24］，紅桿菌屬歸于放線菌門（Actinobacteria），有較強抗性，可適應高鹽分環境［25］，同時，紅桿菌屬是污染物微生物降解的最為關鍵的類群之一［26］。甘薯組（IL）和枸杞組（LM）的優勢菌屬均為紅球菌屬（分別占38.17%和19.57%）。紅球菌是一類革蘭氏陽性菌，屬放線菌門（Actinobacteria），可分解代謝多種芳香族化合物［27-28］。紅球菌屬被認為是有前途的持久性污染物生物降解劑［29］，且可以產生大量的水解酶和氧化酶，從而充分利用環境污染物中的碳源進行生物降解［30-31］，紅球菌屬還可以對部分水生細菌病原體表現出顯著的抑制活性［32］。因此，在蝦菜共生系統的養殖過程中，紅球菌屬在處理污染物以及對抗病原菌方面具有重要的作用，而甘薯和枸杞對維持水環境穩定有明顯的效果。與對照組（CK）相比，試驗組中紅桿菌屬明顯減少，是由于在蝦菜共生系統中，對蝦在養殖過程中會排出鹽分等代謝物，但在試驗組中，排除了對蝦因素對試驗干擾，故不會排出這些代謝物，從而導致紅桿菌屬相對減少。

3.2 水質條件與微生物多樣性的關系

FAPROTAX生態功能預測圖及水質結果顯示，蕹菜組（IF）的微生物組成對硝酸鹽、亞硝酸鹽的反硝化作用及氮的吸收豐度較高，且對硝酸鹽和磷酸鹽的去除率達65.70%和67.57%。大量的研究表明，蕹菜對魚池、蝦池的氮有較好的凈化效果［33-34］，是對重污染河道凈化處理的優良生物材料之一［35］。蕹菜的生長有利于凈化水質，消除富營養化［12］。蕹菜因其具有生長快、繁殖力強、對水體中氮磷去除效果好等優點［36-37］，已被廣泛應用于養殖水體中營養物的去除效果研究。蕹菜對水質影響的研究頗多，相較于枸杞和甘薯的研究甚少，枸杞在中國傳統醫學中占有重要地位，在中國作為食物和草藥已有幾千年的歷史［38-39］。枸杞是一種極具藥用價值的蔬菜且對磷酸鹽吸收較好，是蝦菜共生池的模式下一種極具潛力的蔬菜品種。

Upset圖、多樣性指數結果顯示，枸杞組（LM）OUT數目最多且Shannon-Wiener指數最高，明顯高于其他試驗組；但蕹菜組（IF）特有OTU數目最高（269種），枸杞組（LM）次之（234種）。現有研究表明，種植基質中微生物組成多樣性越高、群落結構越復雜，越能促進植物的生長，單一細菌與真菌菌群對植物生長甚至產生抑制作用［40］。微生物的豐度和多樣性隨水體營養水平的變化而變化［41］，并能顯著影響微生物群落功能［42］。在蝦菜共生池中配不同面積的不同蔬菜不僅可對氮、磷等含量起到有效控制，也可以對微生物多樣性起到促進作用，蔬菜的富集對消除水體富營養化有重要意義。根據水質及多樣性情況，推測蕹菜對硝酸鹽、磷酸鹽去除效果好與其特有OTU數目有關。

4 結論

該研究基于Illumina高通量測序技術，通過對系統養殖水體的細菌16S rDNA基因序列的測定，探討了不同水培蔬菜的微生物組成及其多樣性，并對其功能分析進行了相關研究。結果表明，枸杞組（LM）的OTU數目、Shannon-Wiener指數和Simpson指數最高，表明枸杞養殖的水體生物多樣性豐富；蕹菜組（IF）對硝酸鹽、磷酸鹽去除率分別達65.70%和67.57%，對水體的凈化效果較好。不同系統水體中門水平上的優勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、Patescibacteria；屬水平優勢菌群為紅球菌屬（Rhodococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）。各組間水體的微生物組成差異較大，甘薯和枸杞的組成接近且功能類似，兩者對水環境的穩定起到更顯著的作用。從水質凈化角度來看，蕹菜對硝酸鹽、磷酸鹽有更強的凈化能力，是蝦菜共生系統中優良的選擇。

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