通宣理肺片微生物限度檢查方法適用性驗證

【摘 要】 目的：按照《中華人民共和國藥典》2020年版對通宣理肺片進行微生物限度檢查方法適用性試驗研究并建立其方法。方法：本研究依據《中國藥典》2020年版四部通則1105及1106，對通宣理肺片進行計數方法和控制菌檢查方法的適用性試驗。結果：通宣理肺片采用傾注法1∶100稀釋級驗證需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，回收率在0.5～2范圍內；采用常規法驗證大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌，檢出陽性菌，陰性對照未檢出。結論：本次驗證方法可作為通宣理肺片微生物限度的檢查方法。

【關鍵詞】 通宣理肺片；微生物限度檢查；計數方法；適用性試驗

【中圖分類號】R917"" 【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）09-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409008

Applicability Validation of Microbial Limit Test for Tongxuan Lifei Tablet

LI Na CHEN Cheng TANG Xinzong*

Yunnan Yunhe Pharmaceutical Co. Ltd.， Gejiu 661000，China

Abstract：Objective To establish a microbial limit test and the applicability test for Tongxuan Lifei Tablet based on Chinese Pharmacopoeia in 2020. Methods The applicability of counting method and controlling bacteria methodwere testedaccording to Chinese Pharmacopoeia in 2020 （Part IV） General Principles 1105 and 1106.Results The Tongxuan Lifei Tablet was validated by pouring method at 1∶100 dilution level for total aerobic bacteria， total molds and yeasts. Besides， the recoveries were in the range of 0.5～2. The conventional method was used to validate the Escherichia coli， bile salt-resistant gram-negative bacteria and Salmonella， and the positive bacteria were detected， while the negative control was not detected. Conclusion Thisvalidated method can be used as a method for checking the microbial limit of Tongxuan Lifei Tablet.

Keywords：Tongxuan Lifei Tablet;Microbial Limit Test;Counting Method;Applicability Test

通宣理肺片收載于《中國藥典》（2020版一部）［1］，由紫蘇葉、前胡、桔梗、苦杏仁、麻黃等11味中藥材組合而成的中成藥。用于解表散寒、宣肺止咳、發熱、鼻塞流涕、頭痛、咳嗽、無汗、肢體痠痛。微生物限度檢查是保證藥品質量和用藥安全有效的重要措施和手段［2］，為驗證檢查方法的可行性和有效性，本試驗根據《中國藥典》（2020版四部）對通宣理肺片微生物限度檢查法進行驗證，確保其微生物限度檢查質量安全性達到要求，也為該藥品的質量分析提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HH-S2S數顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）；SHH-500L生化培養箱（重慶永生實驗儀器廠）；DF-204電熱鼓風干燥箱（北京二龍路第一金屬廠）；XG1脈動真空滅菌柜（山東新華醫療器械股份有限公司）；SW-CJ-2FD雙人潔凈工作臺（蘇州智凈凈化設備有限公司）；BHC-1300ⅡA2生物安全柜（阿爾泰實驗室設備北京有限公司）；TENLIN-C勻漿儀（江蘇天翎儀器有限公司）；FA1604電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 培養基 胰酪大豆胨液體培養基（批號200903）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號200901）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號2011092）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號2010092）、麥康凱液體培養基（批號200301）、麥康凱瓊脂培養基（批號181023）、腸道菌增菌液體培養基（批號181225）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號181218）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號181016）、RV沙門增菌液體培養基（批號181220），均來自北京三藥科技開發公司。

1.3 菌種 枯草芽孢桿菌（批號20190511）、金黃色葡萄球菌（批號20180018）、銅綠假單胞菌（批號20190219）、大腸埃希菌（批號20180018）、黑曲霉（批號20190604）、白色念珠菌（批號20190529）、乙型副傷寒沙門菌（批號20190224），均來自山東拓普生物技術工程有限公司。

1.4 樣品 通宣理肺片（批號210102，云南云河藥業股份有限公司）。

2 方法

2.1 菌液的制備 分別將銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌接種于胰酪大豆胨液體培養基中，33℃培養18～24 h；白色念珠菌接種在沙氏葡萄糖液體培養基中，23 ℃培養2～3 d；以上培養物用無菌NaCl溶液（0.9%）10倍稀釋至10-4～10-7的菌懸液。將黑曲霉的新鮮培養物接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，23 ℃培養5～7 d，取5 mL無菌NaCl（0.9%）溶液洗脫孢子并將孢子懸液過濾至無菌試管內，取無菌NaCl（0.9%）溶液10倍稀釋為10-3的孢子懸液，待活菌計數用。

2.2 供試液的制備 取10 g樣品放入勻漿杯中，加100 mL胰酪大豆胨液體培養基混勻成1∶10的供試液。再繼續用胰酪大豆胨液體培養基逐級稀釋。

2.3 計數方法適用性試驗

2.3.1 傾注法

2.3.1.1 試驗組 各取1∶10、1∶100、1∶1000的供試液25 mL，分別加入0.2 mL銅綠假單胞菌10-5菌懸液；各30 mL分別加入0.2 mL白色念珠菌10-3菌懸液；各30 mL分別加入0.2 mL金黃色葡萄球菌10-5菌懸液；各30 mL分別加入0.2 mL枯草芽孢桿菌10-4菌懸液；各35 mL分別加入0.2 mL黑曲霉10-3的菌懸液；制成含菌量＜100cfu/mL的供試液，每株菌平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，33 ℃培養3 d（每天觀察計數）。

取1∶10、1∶100、1∶1000的供試液：各35 mL分別加入0.2 mL黑曲霉10-3的菌懸液；各30 mL加入0.2 mL白色念珠菌10-3菌懸液，制成含菌量＜100 cfu/mL的供試液，每株菌平行制備2個平皿，傾注到沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，23 ℃培養5 d（每天觀察計數）。

2.3.1.2 供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作，傾注至胰酪大豆胨瓊脂培養基上，33 ℃培養5 d；傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，23 ℃培養7 d，每天觀察計數。

2.3.1.3 菌液對照組 取相應稀釋液替代供試液按試驗組操作加入試驗菌液，取1 mL注入平皿內（每株菌制備2皿），傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，33 ℃培養3 d；傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，23 ℃培養5 d（每天觀察計數）。

2.3.1.4 微生物回收計算

比值=試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數菌液對照組平均菌落數

2.3.2 薄膜過濾法

2.3.2.1 試驗組 取1 mL制備好的供試液（1∶10）加入放有100 mL pH7.0蛋白胨緩沖液中直接過濾，用200 mLpH7.0蛋白胨緩沖液分兩次沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中加入＜100 cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，抽濾后將濾膜取出，菌面朝上，貼在胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，培養后計數。枯草芽孢桿菌同法制備。

2.3.2.2 供試品對照組 不加菌懸液，其余同試驗組操作。

2.3.2.3 菌液對照組 不加供試液，其余同試驗組操作。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗

2.4.1 大腸埃希菌試驗組 取10 mL供試液（1∶10）接種到100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入0.2 mL大腸埃希菌10-6試驗菌懸液，33 ℃培養22 h，取1 mL該培養物接種到100 mL麥康凱液體培養基中，43 ℃培養48 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，33 ℃培養48 h。

2.4.2 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗組 取10 mL1∶10、1∶100、1∶1000的均勻供試液，23 ℃下培養約2 h。各取1 mL預培養物分別接種至10 mL腸道菌增菌液體培養基中，每個稀釋級制備2管，分別加入銅綠假單胞菌10-6和＜100 cfu的大腸埃希菌10-6試驗菌液，33 ℃培養48 h，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，33 ℃培養24 h。

2.4.3 沙門菌試驗組 0.5 mL懸液，33 ℃培養20 h。取0.1 mL培養物接種至10 mLRV沙門增菌液體培養基中，33 ℃培養20 h。取少量RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，33 ℃培養48 h。

2.4.4 供試品組 除不加入菌液外，照相應控制菌試驗組檢查方法檢查。

2.4.5 陽性對照組 以稀釋液代替供試液，加入＜100cfu的相應控制菌液照相應控制菌檢查方法檢查，結果應檢出相應控制菌。

2.4.6 陰性對照組 以稀釋液代替供試液，照相應控制菌檢查方法檢查，結果應無菌生長。

3 結果

3.1 微生物限度計數方法的適用性

3.1.1 傾注法 按照“2.3.1方法”進行計數檢查，采用傾注法對本品進行適用性試驗，結果如表1、圖1所示。

該試驗在1∶10稀釋級條件下，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌被抑制，比值低于0.5，說明傾注法不適用于通宣理肺片的需氧菌總數計數檢查，應用其他方法以消除供試品的抑菌活性；霉菌和酵母菌總數采用傾注法檢查時1∶10稀釋級，各菌株比值均在0.5～2范圍內，可直接采用傾注法檢測。

而從表1、圖1可知，采用傾注法檢查需氧菌時1∶100稀釋級各菌株比值均在0.5～2范圍內，符合計數方法適用性試驗要求，故可用1∶100稀釋級供試液作為最低稀釋級供試液進行通宣理肺片的需氧菌總數計數檢查。

3.1.2 薄膜過濾法 按照“2.3.2方法”進行計數檢查，采用薄膜過濾法對本品進行適用性試驗，結果如表2、圖2所示。

采用薄膜過濾法進行計數方法適用性試驗時，供試液過濾后導致濾膜顏色太深，影響計數，故薄膜過濾法不適合于通宣理肺片的微生物限度計數檢查。

3.2 控制菌檢查方法的適用性 按照“2.4方法”，選擇大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌為試驗菌種，采用常規法進行適用性試驗，結果如表3、圖3所示。

本試驗按常規法對控制菌進行檢查時，試驗組和陽性對照組檢出相應控制菌，供試品組和陰性對照組無菌落生長，符合控制菌檢查方法適用性試驗要求。

4 討論

4.1 微生物限度計數方法的適用性驗證結果分析 根據“3.1微生物限度計數方法的適用性”驗證結果，通宣理肺片中霉菌和酵母菌可直接用1∶10傾注法進行方法適用性驗證，而金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌用1∶10傾注法進行方法適用性驗證，回收率無法達到藥典要求，需稀釋至1∶100回收率才能達到2020版《中國藥典》的要求（0.5～2），且陰性對照組無菌落生長，說明該方法簡便、有效、可行；在本研究中，需氧菌稀釋倍數比霉菌和酵母菌稀釋倍數高，但對應的白色念珠菌在胰酶大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖培養基中的回收比值差別不大，這可能與培養溫度、培養時間等因素相關。此外，還可能與培養基的pH值相關。薄膜過濾法檢查時，通宣理肺片的供試液過濾后濾膜顏色過深影響計數，所以在微生物限度檢測時無法采用該方法進行檢測。

4.2 控制菌檢查方法的適用性驗證結果分析 根據“3.2控制菌檢查方法的適用性”驗證結果，采用常規法驗證大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌，結果得到試驗組和陽性對照組中均檢出這三種菌，而供試品組和陰性對照組未檢出，符合《中國藥典》2020年版四部非無菌產品微生物限度控制菌檢查法的要求。

綜上所述，在微生物檢查方法驗證通過后， 應嚴格按驗證確立的方法進行供試品的微生物檢查［3］，同時為了促進我國藥品微生物限度檢查工作的快速發展，應全面提升企業藥品微生物實驗室的能力與管理水平［4］。在微生物檢測中，檢查方法干擾因素較多，如培養溫度、培養時間、培養基pH值等，需在檢測時排除干擾，此外在檢測時還需要考慮藥品本身是否具有抗菌作用，再做進一步的方法驗證。本研究通過一系列實驗，成功摸索出了通宣理肺片的微生物限度控制方法，即供試品通宣理肺片在計數檢測時，需氧菌需采用1∶100稀釋級供試液作為最低稀釋級進行檢測，而霉菌和酵母菌直接采用傾注法檢測，控制菌檢查方法可采用常規法進行檢測，采用這些驗證后的方法檢測出的微生物限度符合2020版《中國藥典》的規定，所以在處方、生產工藝和檢測環境一定的情況下，此驗證后的方法可以用于通宣理肺片的微生物限度檢查。

參考文獻

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2020.

［2］陳慧潔，郭華榮，顧崇梅.兩種中藥制劑微生物限度檢查方法驗證［J］.中獸醫醫藥雜志，2022，41（1）：68-72.

［3］陳健梅.微生物檢查方法驗證及其影響因素分析［J］.中國醫藥導報，2008，（12）：66-68.

［4］胡昌勤.藥品微生物控制體系建設現狀與展望［J］.中國現代應用藥學，2021，38（5）：513-519.

（收稿日期：2023-08-02 編輯：劉 斌）

基金項目：

作者簡介：

李娜（1986—），女，漢族，本科，工程師，研究方向為中藥質量標準研究以及中成藥開發研究。E-mail：443704209@qq.com

通信作者：

唐新宗（1983—），男，漢族，碩士，高級工程師，研究方向為中藥質量標準研究以及中成藥開發研究。E-mail：yntxz2001@163.com