單細胞RNA測序及其在肺癌診療中的應用進展*

全 念 綜述,陳 奎,郭銘靜,張立群 審校

陸軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科,重慶 400037

肺癌是最常見的癌癥之一,也是癌癥相關死亡的主要原因,每年約有200萬新發病例和176萬死亡病例[1]。據我國國家癌癥中心統計,2016年我國肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位,其中新發病例約82.8萬,死亡病例約65.7萬[2]。肺癌的5年生存率僅為22.9%,部分原因是大多數患者在初診時已發展為晚期肺癌[3]。因此,早診斷、早治療是降低原發性肺癌患者死亡率的有效措施[4]。肺癌是一種具有廣泛臨床病理特征的異質性疾病,目前對其了解尚不足[1,5]。低劑量計算機體層成像(LDCT)對早期發現小結節具有較高敏感性,可將死亡率降低20%;然而,LDCT的使用仍然受到高假陽性率、輻射暴露和高成本的限制[6]。臨床診斷需要組織活檢以確定腫瘤組織學和分期,然而收集組織活檢的操作具有一定的局限性和風險[4]。

單細胞RNA測序(scRNA-seq)自2009年首次報道以來,以單細胞分辨率分析轉錄組數據,scRNA-seq正在成為人類癌癥研究中使用的有力工具[7-8]。該技術提供單個腫瘤細胞的生物學信息,分析腫瘤內表達異質性的決定因素,并確定腫瘤疾病形成的分子基礎[9]。本文從scRNA-seq技術的應用現狀、肺癌異質性、腫瘤微環境、生物標志物、治療和耐藥性等方面綜述其在肺癌診療中的應用進展,并提出scRNA-seq技術的主要發展方向。

1 scRNA-seq技術概述

scRNA-seq主要包括單細胞分離、裂解、逆轉錄、cDNA擴增、文庫制備、測序和數據分析等7個步驟[10]。單細胞分離是scRNA-seq的限制步驟,文庫制備也是提高scRNA-seq研究通量的關鍵因素[11]。可用于分離單個細胞的方法包括梯度稀釋、毛細管移液、激光捕獲顯微切割、微流控分離、熒光激活細胞分選、磁性激活細胞分選[12],其中微流控分離平臺因其高通量和低成本而成為主流方法[13]。

一般來說,scRNA-seq分析方案可分為全長轉錄本測序方法和3′/5′末端轉錄本測序方法[14]。全長轉錄本測序方法有Quartz-Seq、Smart-Seq和Smart-Seq2等,3′/5′末端轉錄本測序方法有STRT-Seq、CEL-Seq、MARS-Seq、Drop-Seq和InDrop等[12]。基于微流控和Drop-Seq的商用平臺10×Genomics Chromium是使用最廣泛的平臺,具有高靈敏度和低技術噪聲等優勢[15]。

2 scRNA-seq在肺癌中診療的應用

scRNA-seq技術可以從腫瘤異質性、腫瘤微環境、細胞發育分化和細胞通訊等生物學方面對肺癌進行更深入地研究和理解,從而輔助肺癌診斷、肺癌發生、發展及轉移、肺癌耐藥和治療及肺癌監測和預后。然而,scRNA-seq預先把組織分解成單細胞懸液,會破壞組織的空間結構,從而丟失了空間和組織信息。為了彌補此缺陷,基于scRNA-seq的空間轉錄組測序(SRT)應運而生,并且SRT被《Nature Methods》評為2020年年度技術[16]。本部分擬從肺癌異質性、腫瘤微環境、肺癌監測,以及肺癌耐藥和治療等方面綜述其重要進展。

2.1scRNA-seq與肺癌異質性 腫瘤異質性是惡性腫瘤的關鍵特征,也是癌癥治療和研究的重大障礙[17]。因此,迫切需要開發新方法,以精確檢測腫瘤異質性的分子機制。MA等[18]分析了來自肺腺癌(LUAD)患者和細胞系的scRNA-seq數據,以表征免疫反應相關基因的腫瘤內異質性,并證明了它們對免疫治療療效的潛在影響。干擾素γ(IFN-γ)信號通路基因與單個癌細胞中的其他基因(如MHCⅡ)異質表達和共調控。細胞系中IFN-γ信號通路中基因的下調對應于獲得性抗性表型。此外,對兩組腫瘤限制性抗原的分析揭示了它們在單細胞中表達的異質性。HE等[19]對來自7個攜帶EGFR突變的Ⅰ/Ⅱ期LUAD樣品和5個腫瘤鄰近肺組織的共125 674個細胞進行了scRNA-seq;通過擬時序分析發現,ELF3是晚期腫瘤細胞中上調最多的基因之一,提示ELF3可能是LUAD未來藥物發現的治療靶點。TIAN等[20]對來自11例小細胞肺癌(SCLC)患者原發腫瘤和匹配正常鄰近組織(NATs)的約5 000個細胞進行了高精度單細胞轉錄組學分析,揭示了SCLC中關鍵轉錄因子的腫瘤內異質性,以及相關的基因表達模式和功能。非神經內分泌腫瘤與SCLC炎癥基因特征和免疫細胞浸潤增加相關。ZHANG等[21]建立了一個多組學圖譜,整合了來自多個LUAD和肺鱗癌(LUSC)患者的52個scRNA-seq和2 342個公共傳統RNA測序數據。LUAD和LUSC含有在肺泡Ⅱ型細胞(AT2)和基底細胞的亞簇中選擇性地擴增,高百分比的成纖維細胞和AT2導致LUAD和LUSC的存活率低,這表明細胞組合在預測肺癌預后不良方面的潛在作用,包括亞群標記AQP5和KPNA2在內的10個基因的過表達進一步表明了其功能及作用,為肺癌的早期診斷和治療提供了潛在的靶點。

2.2scRNA-seq與腫瘤微環境 TME由成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞和免疫細胞等基質細胞組成,在腫瘤的發生、進展和轉移中起著至關重要的作用[19,22]。LAVIN等[23]通過多重組織成像,以及腫瘤、非受累肺和血液的配對單細胞分析18例LUAD患者,發現Ⅰ期肺腺癌病變已經有明顯改變的T細胞和NK細胞區室。為確定LUAD中臨床相關的微環境和癌癥特征,BISCHOFF等[24]將scRNA-seq應用于10個LUAD組織和10個正常對照組織,該研究揭示了反映組織學分級和致癌途徑活性的異質癌細胞轉錄組,以及兩種不同的微環境模式:CP2E模式和N3MC模式。免疫激活的CP2E微環境由癌癥相關肌成纖維細胞、促炎單核細胞來源的巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞和耗竭的CD8+T細胞組成,預后不佳。相比之下,惰性N3MC微環境的特征是正常樣肌成纖維細胞、非炎癥性單核細胞來源的巨噬細胞、NK細胞、髓樣樹突狀細胞和常規T細胞,并且預后良好。為闡明非小細胞肺癌(NSCLC)中腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的亞群組成和功能異質性,YANG等[25]利用scRNA-seq技術結合ssGSEA分析、擬時序分析和場景分析對早期吸煙NSCLC患者進行了分析,在NSCLC患者的TME中發現了2種普遍存在的免疫抑制性TAM:CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞。CCL18+巨噬細胞通過抑制炎癥因子的產生發揮免疫抑制作用,并表現出高水平的脂肪酸氧化磷酸化代謝。相反,SPP1+巨噬細胞的主要代謝途徑是糖酵解,糖酵解通過促進血管生成和基質重塑促進腫瘤轉移。WANG等[26]對40個腫瘤樣品和19例NSCLC患者的匹配的鄰近正常組織的72 475個免疫細胞進行了scRNA-seq,并繪制了系統的免疫細胞轉錄組圖譜。基于TCGA對不同的細胞組成、差異表達基因(DEG)、細胞-細胞相互作用、擬時序軌跡、轉錄因子和預后因子進行聯合分析,揭示了細胞毒性和效應性T細胞、NK細胞,以及不同的功能性巨噬細胞(Mφ)亞型在LUAD和LUSC之間免疫微環境異質性中的中心作用。Mφ的優勢亞型在LUAD為FABP4-Mφ,在LUSC為SPP1-Mφ。LAMBRECHTS等[27]對5例NSCLC患者的84 341個基質細胞進行了scRNA-seq,并鑒定了52種基質細胞亞型,包括不同類型的腫瘤相關成纖維細胞、內皮細胞和迄今為止被認為是同質的腫瘤浸潤免疫細胞。CLARKE等[28]對肺癌患者腫瘤和正常肺組織中的組織駐留記憶T細胞(TRM)和非TRM細胞進行了單細胞和傳統轉錄組分析,與表達PD-1的非TRM細胞相比,腫瘤中表達PD-1的TRM細胞被克隆擴增和富集,用于與細胞增殖和細胞毒性相關的轉錄本。這一特征在共表達PD-1和TIM-3的TRM細胞亞群中更為突出,該PD-1+TIM-3+TRM細胞亞群在PD-1抑制劑應答者和細胞毒性T細胞反應幅度更大的腫瘤中富集。為了在NSCLC患者中繪制由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞組成的TIM,ZILIONIS等[29]的研究應用scRNA-seq發現了25種TIM亞群,其中大多數在患者中同時表達,在比較人類和小鼠之間的TIM時,發現樹突狀細胞和單核細胞之間亞群結構的近乎完全一致,中性粒細胞亞群偏保守,以及巨噬細胞具有物種差異。

LU等[30]使用scRNA-seq分析了肺磨玻璃結節腺癌(GGN-ADC)和實體腺癌(SADC)各5例患者的60 459個細胞。GGN-ADC癌細胞中與細胞增殖相關的信號通路下調,基質細胞在GGN-ADC和SADC中具有不同的影響。在GGN-ADC中,血管生成的信號通路下調,成纖維細胞低表達膠原蛋白,免疫細胞更加活躍。與SADC相比,癌細胞和TME共同促進了GGN-ADC的生長。XING等[31]對16個亞實體結節(SSN)樣本、6個相鄰的正常肺組織(nLung)和9個伴有淋巴結轉移的原發性LUAD(mLUAD)樣本進行了scRNA-seq分析。細胞毒性NK T細胞在SSN的TME中占主導地位,SSN中的惡性細胞經歷強烈的代謝重編程和免疫應激。在SSN中,內皮細胞的亞群組成與mLUAD相似,而成纖維細胞的亞型分布更像nLung,表明內皮細胞在腫瘤發生的早期起著關鍵作用。LIU等[32]分析來自4個純毛玻璃結節(GGN)、4個實性結節(SN)和4個正常組織的76 762個細胞的單細胞轉錄組譜,發現NK和CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫隨著LUAD的進展而逐漸減弱, B細胞介導的體液免疫在SN中更活躍。在從GGN到SN的進展過程中,一些特殊上皮細胞的增殖能力增加。此外,基質細胞和M2巨噬細胞可以幫助LUAD的進展。

2.3scRNA-seq與肺癌監測 大約60%的肺癌患者在最初診斷時具有遠處轉移,這是肺癌高病死率的主要原因[4]。所以,肺癌的早期診斷對治療至關重要。KIM等[33]用scRNA-seq對34例早期LUAD患者分析原發性肺腫瘤和正常肺組織中CXCL1、CXCL2和CXCR2的mRNA,以及相關的表觀遺傳調節因子miR-532-5p、miR-1266-3p和miR-3163進行了定量檢測,最終發現趨化因子mRNA與miR-532-5p和miR-1266-3p在早期原發性LUAD中呈負相關,特別需要指出的是,miR-532-5p可在相應LUAD的血漿中定量;該研究證實了趨化因子基因mRNA和相應microRNA的數量差異可用作表征肺癌的分子標記。KIM等[34]對44例患者的208 506個正常組織或早期至轉移期癌癥細胞進行了scRNA-seq,確定了一種偏離正常分化軌跡并主導LUAD進展和轉移期的癌細胞tS2亞型,TCGA數據庫分析證實tS2標記基因表達高表達的患者總體存活率較差。腫瘤、基質細胞和免疫細胞之間活躍的細胞群動力學和分子相互作用提供了促腫瘤和免疫抑制的微環境。TME中的mo-Mac亞群具有免疫激活和調節的雙重功能,向T細胞提供刺激和抑制信號,所以可以靶向mo-Mac,以重新定向免疫激活。ZHANG等[35]對2例肺腺癌PDX病例的原發和腦轉移腫瘤組織中分離的腫瘤細胞進行基因差異表達分析(GSE69405),通過維恩圖鑒定了肺腺癌腦轉移的4個關鍵基因,包括CKAP4、SERPINA1、SDC2和GNG11。

JIN等[36]利用LUAD的scRNA-seq數據構建了5個基因(IDH2、ADRB2、SFTPC、CCDC69和CCND2)預后風險模型,風險評分與腫瘤浸潤免疫細胞和腫瘤基因組異常之間存在相關性,具有較高風險評分的患者具有明顯較低的免疫治療應答率。XU等[37]利用LUAD單細胞數據集GSE149655構建了基于10個基因(CCL20、CP、HLA-DRB5、RHOV、CYP4B1、BASP1、ACSL4、GNG7、CCDC50和SPATS2)的預后風險模型,評分越高預后越差。其中,HLA-DRB5表達與LUAD風險呈負相關,CCDC50表達與LUAD風險呈正相關。

2.4scRNA-seq與肺癌耐藥和治療 靶向癌癥治療的最大障礙是耐藥性的必然出現[38]。所以,對肺癌耐藥機制應進行更深入的研究。MAYNARD等[5]對30例使用靶向治療前和靶向治療期間轉移性肺癌患者的49個活檢樣本進行scRNA-seq,闡明了單個腫瘤樣品中豐富的突變和轉錄多樣性,以及治療期間癌細胞轉錄譜和TME組成的動態變化,揭示了纖溶酶原激活級聯反應在較差臨床結果和靶向治療耐藥性的臨床相關性和潛在作用。殘余疾病(RD)治療后存活的癌細胞表達了肺泡再生細胞特征,表明治療誘導了原始細胞狀態轉變,而治療中進行性疾病(PD)的癌細胞上調了尿蛋白、纖溶酶原和縫隙連接通路。RD和免疫抑制細胞狀態下存在活性T淋巴細胞和減少的巨噬細胞,以PD為特征,證明癌癥和腫瘤微環境細胞表現出顯著的治療誘導的可塑性。ZHONG等[39]對Pembrolizumab治療前后肺癌患者的外周血單個核細胞進行scRNA-seq,泛素介導的蛋白水解、細胞周期、自然殺傷細胞介導的細胞毒性被鑒定為NKG7+NK T細胞中的PD-1阻斷反應途徑,凋亡Th1和Th2細胞分化被認為是Pembrolizumab影響NK T細胞的途徑。在基因水平上,在TCGA數據集驗證后,ID2、PIK3CD、UQCR10、MATK、MZB1、IL7R和TRGC2與PD-1表達呈顯著相關性,這可作為PD-L1陰性LUSC患者的預測標志物,這些患者可受益于Pembrolizumab。HE等[22]分析了LUAD3個代表性單細胞RNA-seq數據集中晝夜節律破壞(CRD)在腫瘤中作用,結果顯示高CRD評分與LUAD患者的不良預后,以及包括化療和酪氨酸激酶抑制劑治療在內的抗癌治療的耐藥性顯著相關,其機制是CRD參與了惡性細胞作為持續細胞的轉化,從而導致耐藥性。對這些機制的更好理解可能會為將“基于生物鐘的抗癌方法”納入精準醫學的治療方案提供新的可能性。

3 總結與展望

scRNA-seq技術以其高分辨率的特點為肺癌研究提供了新的研究手段,對肺癌的異質性、腫瘤微環境、早期診斷、侵襲和轉移及治療和耐藥等方面進行了探索,提升了對肺癌的認識。此外,scRNA-seq與基因組、表觀遺傳組、蛋白組、代謝組、空間轉錄組學技術聯合分析可以對肺癌組織進行更加深入和立體地分析,可以提供更加全面、完整的數據,加深腫瘤學家對肺癌發生、發展、治療等的認識,為精準化和個體化治療提供更為準確地指導。當然,scRNA-seq技術在降低成本、優化檢測過程,提升易用性和可及性,優化單細胞懸液的制備,提高擴增時覆蓋率、降低錯配率和減少噪音率,提高細胞捕獲效率和測序深度,優化生物信息學算法等方面仍有改進空間。

總之,在促進scRNA-seq技術進步的同時,把其與其他組學或生物學技術相結合將進一步推進肺癌的研究及治療。