酶法制備植源性生物活性肽及其生理活性的研究進展

孟 燁，昝麗霞，2，3，張文夷，高 寧，杜小平，4

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省四主體一聯合茶產業校企聯合研究中心，陜西 漢中 723000；3.陜西理工大學茶葉種植與加工研究所，陜西 漢中 723000；4.安康市富硒產品研發中心，陜西 安康 725028）

生物活性肽Bp（Bioactive peptides）是由2～20 個氨基酸組成的序列，分子量＜6 kDa，是源于蛋白質的功能性化合物[1]，其內含有人體自身無法合成的8種氨基酸，比例接近于FAO/WHO 的推薦模式，可供人體直接所吸收，具有抗氧化、降血壓、降血脂、增強免疫力等功能，有助于維持機體健康和預防慢性疾病[2]。Bp 來源主要分為內源性Bp 和外源性Bp，內源性Bp 是由組織內特異性蛋白水解酶作用于各種功能性組織蛋白而產生的，是許多哺乳動物調節系統的介質；外源性Bp 是指人體以外的肽類物質，主要從食物中獲取，在進入人體后先通過胃酸和胃蛋白酶將蛋白質分解成片段，然后在小腸中進一步分解為氨基酸和2～6個殘基的寡肽，再經特異的轉運系統進入小腸上皮細胞，從而釋放到血液中[3-4]。目前Bp 的制備方法有酶解法、微生物發酵法和化學水解法三大類，不同的制備方法得到的肽的純度、理化性質和功能活性不同，其中酶法制備的多肽易被人體消化吸收，且生產條件溫和、易控制，因此最為常用。

食品加工行業的發展產生了大量的副產品，如小麥經加工制粉后的副產物麥麩、大豆制油后的豆粕或茶飲品加工后的茶渣等，這些副產物中都含有較高的膳食纖維、多糖和蛋白等功能成分，若將其當成飼料或廢物處理，不僅資源浪費，還會對環境造成污染[5-7]，而利用酶解法可將食品加工行業的副產品制作成植物活性肽。因此，探討植物活性肽的制備技術十分重要。基于此，本文在介紹酶法制備植物活性肽傳統方法的基礎上，討論了酶法制備植物活性肽的技術改進，并對生物活性肽的生理活性研究最新進展進行了概述。

1 酶法制備植物活性肽的傳統方法

酶法水解是目前提取植物多肽最常用的方法，適用于大規模生產，具有高效、安全和酶解過程可調控性的優點。酶法水解常用的蛋白酶有堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，不同活性位點的蛋白酶對酶解速率、產物的生理活性及穩定性影響很大。如喬楊波等[8]用酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶分別對蠶豆蛋白進行酶解，發現胃蛋白酶水解產物的得率最高、菠蘿蛋白酶的酶解產物具有良好的降血糖活性，而酸性蛋白酶的酶解產物具有良好的清除DPPH自由基效果。

酶法水解具體流程為原料處理、酶解反應、分離純化和產品制備4步。原料處理是指清洗、破碎、浸泡等，目的是為了使材料成為更適合酶解的狀態；酶解反應是酶解過程的核心，不同的材料都有其不同的酶解工藝，包括但不限于酶解溫度、時間、酶用量等，反應結束要對其進行水浴滅酶處理；分離純化是酶解工藝的重要步驟,其目的是將酶解產物與原料分離開來，并去除雜質；產品制備是將分離純化后的酶進行濃縮、干燥、包裝制成產品等。

在分離純化過程中，Wasana Wongngam 等[9]就用超濾、粒徑排除層析和反相層析分離玉米蛋白粉酶解產物，共發現了KLPPVGYP、QLVELLR、DLLGCS、AGCGAAVGTLQ、LSNPY、DPNTY 和LDDGAAKYPY 7 個新多肽。

2 酶法制備植物活性肽的技術改進

2.1 超聲輔助蛋白酶解

超聲波是指頻率高于人類能聽到的聲音頻率范圍的機械波，頻率＞20 kHz，輸出源通常是一個振動體，并將機械振動轉化為超聲波能量，這些超聲波能量以波的形式在液體、固體和氣體等不同介質中傳播。在對水解材料進行超聲預處理或水解過程中使用高強度超聲時，超聲波的振動會通過影響液體中的氫鍵和疏水作用，間接地促使空化效應的產生。這些空化效應可能會進一步對蛋白質的疏水相互作用產生影響，導致蛋白質形態的改變，而這些改變可能更易于蛋白質特定位點被水解酶識別和結合，從而促進蛋白質的水解反應。Shanfen Huang 等[10]在玉米蛋白粉酶解時，引入了發散型超聲和能量聚集型超聲預處理方法，發現用頻率為40 kHz 的發散型超聲預處理1 h 比能量聚集型超聲預處理得到的產物ACE 抑制活性更高，苦味肽濃度更低。陳妍等[11]采用超聲聯合堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白，結果表明超聲處理增加了酶的速率常數，且產物具有較好的乳化活性和抗氧化活性。

2.2 微波輔助蛋白酶解

該法常常用于和蛋白酶一起提取植物多肽，當微波輻射通過樣品中的溶劑時，水分子之間的摩擦和碰撞開始加劇，溶劑中的溫度迅速升高，熱能會傳遞到蛋白質分子內部，其氫鍵、非共價鍵等結構會受到熱能的影響發生破壞，易于蛋白質裂解位點的暴露，從而導致蛋白質的快速分解[12]。于麗娜等[13]以冷榨花生蛋白粉為原料，優化了微波輔助酶解提取α-葡萄糖苷酶抑制肽的工藝，結果表明在微波功率為1 000 W、底物濃度9.77%、加酶量0.94%、溫度59 ℃、pH 值為9.0 的條件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高。Tian Shuangqi 等研究了微波輔助酶解制備的小麥胚芽多肽的理化性質和功能特性，表明微波輔助提高了體系反應速率，增加了多肽的產率和溶解度，且具有清除自由基的抗氧化功能。

2.3 高靜水壓輔助蛋白酶解

高靜水壓（HHP）輔助制備Bp，該法涉及對裝載液體或固體食品的軟包裝材料施加適宜壓力，誘導蛋白質展開，暴露出更多的活性位點，從而促進蛋白質的水解過程[14]。然而，加壓和減壓過程中會引發變形和復性等復雜的化學反應，這些反應可能導致蛋白質聚集或影響酶的活性和水解能力，而不能產生水解產物。Yu XinXin 等[15]在高壓靜水處理乳清蛋白對其結構的影響研究中就很好的證實了這一點，研究表明低壓下表面游離SH 含量沒有明顯變化，壓力上升到400～600 MPa時，表面游離SH 含量急劇增加，而在壓力超過300 MPa時，總游離SH 含量顯著下降，這說明了HHP 處理誘導的乳清蛋白結構改變可能涉及多種變性機制，包括展開和聚集。因此，HHP 參數及酶種類特性的不同都會對蛋白的水解度、Bp 的分子量分布極其功能特性具有一定影響。Muhammad Amer Nazir等[16]在不同高壓靜水條件下用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase 制備甘薯血管緊張素I 轉換酶抑制肽，在MW＜3 kDa 的肽段中，100 MPa 下Alcalase 制備的多肽比例最高，并從中鑒定出了5 個具有良好ACE 抑制活性的肽段。由于用HHP輔助蛋白酶解不需要使用高溫或有機溶劑等對環境有害的條件，降低了生產成本和廢物產生。已經發展為一種新穎、有效、環保的生物活性肽制備技術。

2.4 脈沖電場輔助蛋白酶解

脈沖電場輔助提取Bp 需要對樣品施加短時高強度的電場，使細胞膜發生電穿孔，促進細胞內外物質的交換，包括酶的進入和目標生物活性肽的釋放。同時極化蛋白質分子、破壞蛋白質四級結構中的非共價鍵來改變蛋白的構象，增強生物活性肽的產生[17]。脈沖電場參數的選擇會直接影響到電場對細胞膜的作用強度和持續時間，進而影響生物活性肽的釋放和提取效果。適當選擇和優化脈沖電場參數可以在不損害樣品的情況下提高生物活性肽的提取效率并增強多肽的活性。Zhang Shuyu 等[18]從松子蛋白中提取了RGAVLH 多肽，用脈沖電場處理松子肽RGAVLH，并與未處理的RGAVLH 相比，RGAVLH 的β-折疊結構發生了改變，暴露了活性位點，從而提高了免疫調節活性。Wang Ke等[19]以抗氧化活性為指標用響應面優化了脈沖電場處理10～30 kDa玉米肽的工藝條件，在電場強度15 kV/cm，脈沖頻率為2 000 Hz的條件下，樣品的結構和官能團都發生了改變，抗氧化活性提高了32.1%。

3 生物活性肽的生理活性

3.1 抗氧化

人體在代謝過程中會產生活性氧物質，活性氧的過量產生或清除能力不足可能導致氧化應激的累積，進而引發炎癥、細胞損傷、組織衰老和器官功能下降。目前，抗氧化劑能在一定程度上幫助中和活性氧并減少氧化應激的損害，但長期或過量使用抗氧化劑會帶來一些其他潛在危害。而生物活性肽中的氨基酸殘基能夠捕捉自由基，穩定其電子，從而保護細胞免受氧化損傷，因此，抗氧化肽作為天然抗氧化劑因其安全性高、吸收好、來源廣泛而備受關注。

Shi Hui 等[20]從牛蒡中分離鑒定出了D2-G1S-1 和G2-G1S-2 兩條多肽，均表現出強大的抗氧化活性，將其在秀麗隱桿線蟲進行體內實驗，結果表明這兩條肽段均能在不以降低生物體生長為代價的前提下延長氧化應激抗性，減少脂肪、ROS 和脂褐素的積累，并能通過調節IGF-1 信號延長線蟲的壽命。李琳等[21]研究了英國紅蕓豆抗氧化肽組分（BRKBPAPC）在斑馬魚體內的抗氧化作用，發現實驗組斑馬魚體內的CAT、SOD 等多種抗氧化活性酶活力都得到了顯著提高。高劑量的BRKBPAPC 還對AAPH 誘導的氧化應激起到到了改善作用。這些研究結果為抗氧化肽在食品、醫藥和化妝品等領域的開發研究提供了堅實的理論依據。

3.2 降血壓

近年來，心血管疾病的死亡率急劇上升，而高血壓期間血壓升高被確定為是與心血管疾病密切相關的因素，因此，改善高血壓成了降低心血管疾病相關死亡率的關鍵目標。人體內的腎素-血管緊張素系統（RSA）和激肽釋放酶-激肽系統（KKS）是調節血壓的主要途徑，其中血管緊張素轉換酶（ACE）是高血壓發病的主要介質，主要功能是將血管緊張素I（Ang-I）轉化為血管緊張素II（Ang-II）。Ang-II 能夠收縮血管，增加血管阻力，導致血壓升高[22]。而這些抗氧化肽肽對ACE 具有靶向作用，從而起到延緩血壓升高的作用。Lu Xiang等從大蒜蛋白中提取出兩條肽段（MGR 和HDCF）并在大鼠探究了兩條肽段對RAS 的調控機制，結果表明MGR 和HDCF 可以抑制ACE-AngII-AT1 軸的新生激活，從而減少Ang-I 和Ang-II 的過量產生和血壓升高。何海艷等[23]的研究表明，低于1 kDa 南瓜籽肽具有較好的降血壓活性，對大鼠灌胃6 h 后能有效的降低收縮壓21.42 mmHg左右，是一種良好的降血壓功能食品原料。

3.3 降血糖

降血糖肽與α-葡萄糖苷酶作用的實質是通過多肽分子對多糖與酶之間的結合產生競爭，降低酶與多糖之間的結合率。從而減少葡萄糖的降解，達到降低血糖的作用。馮雪等人將提取的桑葉多肽喂養代謝紊亂的大鼠，通過測量血糖含量證實了其具有良好的降血糖效果。趙婉宏等[24]用以玉米蛋白粉為原料提取分離出的不同超濾組分的玉米肽喂養斑馬魚，在斑馬魚組織中BCA 含量、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂蛋白的含量后發現＜1 ku 的組分對糖尿病斑馬魚糖脂指標改善效果最好，且該組分里具有調節血糖作用的亮氨酸和谷氨酸含量最高。

3.4 降尿酸

尿酸是人體內嘌呤代謝的產物，含量過高會導致痛風、腎臟疾病等各種疾病的發生。其產生機制是人體代謝產物中的次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶（XO）氧化為黃嘌呤，進而氧化為尿酸。降尿酸肽又稱為黃嘌呤氧化酶抑制肽，可以通過抑制XO 的活性來降低黃嘌呤的氧化速率，達到降低尿酸含量的目的。Li Qingyong等[25]從核桃粕中提取出了WMH 和DWMH 兩條新型降尿酸肽，DWMH 在大鼠體內與別嘌呤醇具有相似的降尿酸作用，且兩條肽能促進腎功能衰竭的改善。降尿酸肽的相關研究起步較晚，且大多集中在魚類，植源性食品中降尿酸肽的相關研究更是少之又少，這也為該領域的研究提供了機遇和挑戰。

3.5 降血脂

血脂是機體代謝的能量來源，但當機體代謝出現異常時會引起血脂含量升高，并伴隨多種并發癥。膽固醇在肝中降解產生的膽汁酸有助于脂質在腸道的吸收，而Bp 能與膽汁酸結合，進而有效減少膽固醇的吸收。白寶清等[26]使用堿性蛋白酶對紫蘇籽粕蛋白進行酶解，分離出3 個組分，用G2 組分灌胃高脂模型組小鼠，結果顯示小鼠體內的TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯）和LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）含量明顯降低，表明紫蘇籽粕活性肽G2具有降血脂的功效。周亭屹等[27]將酶解的西蘭花肽進行分離純化和細胞實驗篩選，將效果較好的凝膠分離組分G15-II 進行動物實驗，發現高劑量組肽段G15-II 能降低大鼠血液TC 和TG 含量水平，同時提高HDL-C含量，可見西蘭花肽具有明顯的輔助降血脂作用。

4 結語

植物是生物活性肽提取的天然寶庫，植源性生物活性肽因其特有的氨基酸組成將成為一類非常具有發展潛力的化合物。采用酶法制備植物多肽的好處不僅僅在于條件溫和、安全性高，更重要的是不同的酶解條件可以產生不同的植物功能多肽并具有不同的產品性質。而酶法制備技術的創新更是提高了小分子多肽的得率，能有效增強植物多肽的功能活性。目前，在植源性生物活性肽的研究中，制備技術、結構鑒定和活性測定的方法相對成熟，且主要集中在體外活性測定和細胞內活性研究，植物活性肽在體內的作用機制和人體臨床驗證實驗的研究還不夠，無法將其作為功能性食品和藥物進行商業化生產。未來的研究其功能活性和人類健康的關系上，提高生物活性肽的利用率。