長鏈非編碼RNA煙酰胺核苷酸轉氫酶-反義RNA1在肺癌發生發展中的作用研究進展

熊常州，韓坤余，劉 寧，馬 帥，牛華濤

(1.成都中醫藥大學臨床醫學院,四川 成都 610075;2.云南中醫藥大學第一臨床醫學院,云南 昆明 650021;3.云南省腫瘤醫院神經外科,云南 昆明 650118)

原發性肺癌(以下簡稱肺癌)是目前全球致死率最高的惡性腫瘤,可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)2大類,其中NSCLC約占80%～85%,包括腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等組織學亞型,其余為SCLC[1]。2020年全球約2 206 771例新發肺癌患者(占癌癥發病總數的11.4%),1 796 144例死亡患者(占癌癥死亡總數的18.0%)[2]。肺癌也是我國近30 a來發病率增長最快的惡性腫瘤[1],同時也是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤[3]。盡管手術、放射治療、化學治療、分子靶向治療和免疫治療等在肺癌的治療中取得了一定進展,但其預后仍不容樂觀。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)為無明顯蛋白質編碼能力的轉錄子,長度超過200個核苷酸[4-5],參與調控基因表達、細胞周期、細胞凋亡、染色質重塑和表觀遺傳修飾等生理過程[6]。lncRNA在肺癌的發生發展中占據著重要地位,也是肺癌的重要治療靶點。有研究表明,lncRNA UCC可以特異性地結合miR-143-3p,在NSCLC細胞中充當miR-143-3p的“海綿”,通過吸收miR-143-3p誘導SBY-BOX轉錄因子5(SRY-related high mobility group box 5,SOX5)的表達,在NSCLC中促進上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),進而在體外和體內誘導NSCLC細胞的增殖和遷移[7]。煙酰胺核苷酸轉氫酶-反義RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1,NNT-AS1)作為近年來新發現的lncRNA分子,其表達與NSCLC的EMT、增殖、遷移及侵襲有關[8],并能夠通過miR-1236-3p/自噬相關基因7(autophagy-related gene 7,ATG7)軸影響NSCLC細胞對順鉑的敏感性[9],或為肺癌的治療提供了新靶點及預后標志物。本文就lncRNA NNT-AS1在肺癌發生發展中的作用研究進展進行綜述。

1 LncRNA NNT-AS1簡介

隨著高通量測序技術的發展,lncRNA被發現是包含一類異質的基因間轉錄子、增強子RNA(enhancer RNA,eRNA)及與其他基因重疊的有義或反義轉錄子[10],其作用引起了越來越多學者的關注。LncRNA的功能主要包括在順式中調控局部染色質或基因表達;其次是在反式中離開轉錄位點調控染色質狀態和基因表達,影響核結構和組織,與蛋白質和(或)其他 RNA 分子相互作用[11]。研究發現,多種lncRNA與惡性腫瘤密切相關,其腫瘤特異性及在循環體液(血漿和尿液)中的穩定性為腫瘤的診斷、治療及預后提供了新的基礎[12]。

NNT-AS1作為近年來新發現的lncRNA分子,主要分布在細胞質中,位于5p12染色體區域中,有3個外顯子。研究發現,NNT-AS1失調與腫瘤之間存在潛在的相關性,在肺癌[13-14]、結腸癌[15]、胃癌[16]、肝癌[17]、膽管癌[18]等多種惡性腫瘤中均呈異常表達。NNT-AS1可以通過誘導腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移以及抑制細胞凋亡等機制對惡性腫瘤起促進作用。一項薈萃分析發現,NNT-AS1的高表達與腫瘤患者不良的生存結局顯著相關,建議將其作為腫瘤進展中的預后標志物[19]。

2 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的致癌機制

EMT是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程,其在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和多種纖維化疾病中發揮著重要作用[20]。E-鈣黏素蛋白是上皮標志物,波形蛋白、N-鈣黏素蛋白、蝸牛家族轉錄抑制子2是間充質標志物,它們均是惡性腫瘤EMT過程中至關重要的幾種蛋白。NNT-AS1的高表達可以導致E-鈣黏素蛋白水平顯著降低,N-鈣黏素蛋白和波形蛋白水平顯著升高,進而促進腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲及EMT[21-22]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路是促進腫瘤血管形成、腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞侵襲和轉移的重要信號通路,NNT-AS1可以通過活化MAPK/ERK信號通路,促使Ras作用因子(Ras interaction/interference 1,Rin1)、波形蛋白表達水平、ERK1/2活化程度升高及E-鈣黏素蛋白表達水平下降來促進腫瘤的發生[15]。陳曉等[23]研究發現,NNT-AS1在肺癌組織、細胞中均呈高表達,通過在A549和95D細胞中敲低NNT-AS1可以抑制肺癌細胞增殖和集落形成能力,促進癌細胞凋亡。Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在許多惡性腫瘤中充當致癌基因,在肺癌等實體腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用[24-26]。NNT-AS1還可以通過調節miR-22-3p和YAP1介導的ERK途徑促進NSCLC進展。敲低NNT-AS1可以顯著提高E-鈣黏素蛋白水平,降低N-鈣黏素蛋白和波形蛋白水平,進而阻礙NSCLC進展[8]。以上研究結果均提示,NNT-AS1作為一種致癌因子可促進肺癌的發生及發展。

3 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的作用

3.1 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的作用信號通路

LncRNA NNT-AS1通過miR-3666/E2F2、miR-22-3p/YAP1、miR-22/FOXM1、miR-1236-3p/ATG7、miR-129-5p、MAPK/Slug等多個信號通路參與肺癌的發生和發展。

miR-3666/E2F2信號通路:E2F2 3′UTR-WT(E2F2)作為致癌基因,通過充當miRlet-7a或miR-99a32,33的靶點來促進肺癌的發展。研究證實,相對于正常組織,肺癌組織中NNT-AS1的表達增加,miR-3666在肺癌組織和細胞中呈低表達,E2F2的表達會隨著miR-3666表達的降低而增強,NNT-AS1通過在肺癌細胞中“海綿化”miR-3666調節E2F2的表達,從而參與肺癌的發展[27]。

miR-22-3p/YAP1信號通路:HE等[8]研究發現,NSCLC細胞中NNT-AS1呈高表達,miR-22-3p在NSCLC細胞中的表達明顯降低,NNT-AS1通過“海綿化”miR-22-3p、調節YAP1和YAP1介導的ERK通路促進NSCLC細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。

miR-22/FOXM1信號通路:通過實驗證實,在肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)組織和細胞系中NNT-AS1和叉頭框蛋白M1(forkhead box protein M1,FOXM1)的表達升高,但miR-22的表達水平下降。NNT-AS1通過“海綿化”miR-22誘導LUSC細胞凋亡,miR-22過表達可通過靶向FOXM1抑制LUSC細胞轉移,NNT-AS1可以通過“海綿化”miR-22間接調節FOXM1的表達,從而影響LUSC的發生發展[13]。

miR-1236-3p/ATG7信號通路:研究發現,在肺癌細胞中NNT-AS1和自噬相關基因7(autophagy associated gene 7,ATG7)均呈高表達,miR-1236-3p呈低表達[9]。NNT-AS1能夠靶向肺癌順鉑耐藥細胞中miR-1236-3p,ATG7的表達與肺癌組織中的miR-1236-3p水平呈負相關,ATG7在順鉑耐藥肺癌細胞中由miR-1236-3p和NNT-AS1共同調控,NNT-AS1/miR-1236-3p/ATG7軸可以參與調控肺癌細胞對順鉑的耐藥性。

miR-129-5p信號通路: miR-129-5p在肺癌組織中的表達與NNT-AS1的表達呈負相關,miR-129-5p可以與NNT-AS1的3′-UTR位點結合,NNT-AS1可以通過“海綿化”肺癌中的miR-129-5p,作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)發揮促進肺癌細胞增殖和侵襲的作用,而miR-129-5p抑制劑可以改善NNT-AS1下調引起的肺癌細胞增殖和侵襲[14]。

MAPK/Slug信號通路:CAI等[28]研究發現,與非耐藥肺癌組織相比,耐藥NSCLC組織中NNT-AS1的表達上調,而在敲低NNT-AS1后,耐藥細胞的增殖能力明顯受到抑制,耐藥細胞的集落數隨著順鉑濃度的增加而降低,其機制為NNT-AS1可以通過調控MAPK/Slug信號通路介導NSCLC細胞的順鉑耐藥性。

3.2 LncRNA NNT-AS1參與肺癌的增殖、轉移

LncRNA的異常表達在NSCLC的進展和轉移中起關鍵作用,其作為ceRNA,可與miRNA相互作用、與靶蛋白結合、參與不同信號通路的轉導,通過影響EMT的進展和癌癥干細胞(cancer stem cell,CSC)的性質來發揮其調控NSCLC轉移的功能[29]。NNT-AS1作為一種新發現的致癌性lncRNA,其表達與肺癌患者腫瘤分期和淋巴結轉移有關[14],NNT-AS1可以通過“海綿化”NSCLC中的miR-129-5p、miR-3666、miR-22調控YAP1、FOXM1、ERK等靶點或通路促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT[27、8、13]。

陳曉等[23]通過集落形成實驗在NNT-AS1敲低的A549細胞中觀察到約62個集落,對照組A549細胞中觀察到約135個集落;細胞增殖實驗中,在A549細胞NNT-AS1被敲低的第4天,A549細胞的增殖率分別降低了8%和16%。該研究在95D細胞中也觀察到了同樣的結果。說明敲低NNT-AS1可以抑制A549和95D細胞的增殖及集落形成能力,NNT-AS1表達水平與腫瘤大小和TNM分期相關。

3.3 LncRNA NNT-AS1與肺癌細胞的順鉑耐藥性

順鉑是治療實體腫瘤最常用的化學治療藥物之一,但其易產生耐藥性而導致化學治療失敗,是導致腫瘤復發和進展的重要原因[30]。NNT-AS1參與調控肺癌細胞對順鉑的耐藥性,WANG等[9]研究發現,對順鉑耐藥的肺癌組織和細胞中NNT-AS1呈高表達水平,敲低NNT-AS1可增強肺癌細胞對順鉑的敏感性,這表明NNT-AS1在肺癌細胞中的高表達可能會影響肺癌細胞的耐藥性。其機制可能為:NNT-AS1通過“海綿化”miR-1236-3p來調控順鉑耐藥肺癌細胞中ATG7的表達,進而影響肺癌細胞的順鉑耐藥性。CAI等[28]研究得出了類似的結果,但NNT-AS1影響肺癌細胞耐藥的機制及靶點有所不同,該研究發現,敲低NNT-AS1可以通過抑制MAPK/Slug信號通路影響NSCLC細胞的順鉑耐藥性。MAPK/Slug信號通路是促進NSCLC細胞順鉑耐藥性的重要通路,在腫瘤化學治療耐藥中起著重要作用[31]。MAPK、Slug廣泛參與癌細胞周期進程、細胞凋亡、細胞遷移/侵襲[32-33],Slug可以抑制E-鈣黏素蛋白表達,增加波形蛋白表達,誘導NSCLC的EMT,隨著Slug表達的增加,肺癌組織的惡性程度和轉移率增加[34]。

3.4 LncRNA NNT-AS1與肺癌預后

NNT-AS1的表達水平與腫瘤患者的預后相關,多項研究表明,NNT-AS1的高表達是胃癌[16]、結直腸癌[15]、肝細胞癌[17]等腫瘤預后不良的重要因素。NNT-AS1的表達與總生存期、無病生存期(disease free survival,DFS)呈負相關,與腫瘤分期、淋巴結轉移及浸潤深度等臨床病理特征呈正相關,而與其他臨床特征(包括年齡和性別)無相關性,且NNT-AS1的高表達與不良的生存結局顯著相關,可以作為腫瘤預后的潛在標志物[19]。

在肺癌的研究中也得到了同樣的結論,較高的NNT-AS1表達與肺癌患者預后不良密切相關,WANG等[9]研究發現,高表達的NNT-AS1和ATG7以及低水平的miR-1236-3p在肺癌細胞對順鉑耐藥性的發生和進展中發揮了關鍵作用。因此,敲低NNT-AS1可以促進細胞凋亡,抑制細胞增殖、遷移、侵襲,增加耐藥細胞的敏感性,NNT-AS1在肺癌治療中可能提供靶標和預后標志物。

4 結論

目前的研究表明,lncRNA NNT-AS1的異常表達是肺癌獨立的預后標志物,NNT-AS1在肺癌中呈高表達,并通過miR-3666/E2F2、miR-22-3p/YAP1、miR-22/FOXM1、miR-1236-3p/ATG7、miR-129-5p、MAPK/Slug等信號通路調節復雜的ceRNA網絡,從而在肺癌的發生發展中發揮重要作用。NNT-AS1通過多個信號通路參與肺癌細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲。此外,NNT-AS1還參與介導肺癌細胞的順鉑耐藥性,敲低NNT-AS1可以增強肺癌細胞對順鉑的敏感性。

NNT-AS1作為新發現的lncRNA,在肺癌中的作用研究取得了一定進展,但仍有很多不足,如目前研究較少,且多數研究樣本量小;調控NNT-AS1的上游分子機制尚不明確;NNT-AS1表達的臨界值尚無統一共識;關于NNT-AS1表達水平與預后結局的關系(如總生存期、無進展生存期、DFS)的數據較少等,這些問題仍需要后續的研究來解決。總之,NNT-AS1的高表達與肺癌的不良生存結局和較差的臨床病理特征顯著相關,這可能為肺癌提供新的治療靶點及預后標志物,并為克服肺癌的順鉑耐藥性提供了新的思路。