病毒載體遺傳毒性評價方法研究進展

何偉偉，周長慧，鄭明嵐，李嫚琪，崔文騰，方雅勵，王曉煒，常艷

（1.中國醫藥工業研究總院，上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203；2.國家藥品監督管理局藥品審評檢查長三角分中心，上海 201203；3.深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057）

近年來，基因治療在遺傳疾病和罕見病領域取得顯著成果，越來越多基于病毒載體的基因治療產品被監管機構批準上市。如何安全有效地將外源基因導入體外細胞或體內組織，是安全高效實現基因治療的關鍵。目前主流的基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又可分為整合型病毒載體和非整合型病毒載體。整合型病毒載體包括逆轉錄病毒載體和慢病毒（lentivirus，LV）載體等；非整合型病毒載體包括腺病毒載體和腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體等。AAV和LV載體在目前臨床試驗中應用較為廣泛［1］。

病毒載體因其自身優勢在基因治療中表現突出，但也暴露了相關安全問題，如遺傳毒性。病毒載體介導的遺傳毒性是由炎癥、隨機插入干擾正?；颉⒃┗虻募せ詈筒迦胪蛔兊葘е碌模?-3］。通常表現為基因表達失調，甚至導致克隆擴增和腫瘤發生［4-5］。載體介導的遺傳毒性可受病毒類型、整合位點和靶細胞類型的影響，不同載體具有不同細胞特異性整合傾向［6］。國際人用藥品注冊技術協調會（International Conference on Harmonization，ICH）指南S2（R1）中描述了傳統的遺傳毒性標準組合試驗，該試驗存在局限于檢測DNA損傷或突變及只能得到短期結果的缺點［2］，因此不適用于評估載體介導的遺傳毒性。面對復雜多變的病毒載體整合特點及可能引發的相關安全問題，對病毒載體進行潛在遺傳毒性風險評估勢在必行。本文對目前應用廣泛的AAV 和LV 載體的生物學特性和整合途徑進行簡介，對已有的病毒載體介導的遺傳毒性評價方法進行綜述，并對建立準確快速的病毒載體介導的遺傳毒性的評價體系進行展望，以期為后續研究提供參考。

1 AAV和LV載體

1.1 AAV載體

AAV 屬于細小病毒科依賴病毒屬，是一類微小、無被膜的線性單鏈DNA 病毒［7］，同時也是一種缺陷型病毒，需要輔助病毒的存在才能感染宿主細胞，產生新病毒顆粒。無輔助病毒存在時，野生型AAV（wild type-AAV，WT-AAV）只能整合到19號染色體長臂上，形成潛伏感染，隨宿主細胞染色體復制而復制［7-8］。與WT-AAV 不同，重組AAV（recombination AAV，rAAV）載體通常是將WT-AAV 中的rep基因和cap基因用目的基因所取代，只保留AAV 基因組兩端的2 個反向重復序列。rAAV 作為基因治療載體，通過在載體上移除rep與cap消除其整合能力，因此缺乏rep介導的主動整合，在宿主細胞中主要形成反向重復序列融合片段，稱為環狀連接游離體或游離串聯體［9］。rAAV 載體能同時感染分裂期和靜止期細胞，在未分裂細胞中，這些rAAV 載體基因組在宿主細胞生命周期中保持完整；在分裂細胞中，游離DNA 不隨宿主細胞DNA 復制，rAAV 載體的DNA 通過細胞分裂而丟失［10-11］。然而，rAAV 載體仍能以低頻率隨機整合到靶細胞基因組中，可能是宿主細胞DNA修飾酶介導了該整合過程，同時造成了潛在的遺傳毒性風險［9］。

多數研究發現，rAAV 載體整合有2種方式。一種是隨機整合，發生在DNA 損傷位點的非同源位置，通過非同源末端與宿主基因組連接發生整合；另一種是靶向整合，通過同源重組發生在特定位點［12］。rAAV 載體的整合位點通常位于活性轉錄單元和相關注釋附近，整合事件發生在CpG 島和富含GC 片段的頻率逐步增加，這與活性轉錄有關［13-14］。但不同物種間也存在整合位點偏好性，如新生小鼠的整合“熱點”包括Rian 位點、白蛋白和甲胎蛋白［15］；犬的整合“熱點”有早期生長反應基因、細胞周期蛋白D1 基因、雙特異性磷酸酶1 基因和白蛋白［14］；非人靈長類動物和人類肝細胞相關研究也報道了白蛋白中的多個rAAV整合事件［16-17］。rAAV載體之所以能作為基因治療載體，是因其在人類中的低遺傳毒性特征，且無直接證據表明rAAV載體可在人類中介導宿主的遺傳毒性。目前普遍認為，rAAV載體基因組仍然主要以附加體的形式存在于宿主細胞核［18］。

1.2 LV載體

LV 是逆轉錄病毒的一個屬，為二倍體RNA 病毒，因其潛伏期長而被稱為LV［1］。LV 的基因組整合過程首先從整合酶識別病毒的長末端重復序列開始，此時整合酶將宿主細胞的DNA 切斷，產生的黏性末端與病毒的DNA 相連接。整合進去的前病毒DNA 會轉錄出病毒蛋白的mRNA 和病毒基因組RNA，二者在宿主細胞的細胞質中包裝成完整病毒顆粒，并以出芽方式釋放到細胞外［19-21］。人類免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）載體是應用最早、最廣泛的LV 載體，因其轉運外源基因穩定且高效而成為基因轉導常用的載體工具。研究表明，HIV 載體更傾向于整合到轉錄活躍基因的內含子中下游區域［22］，對轉錄活躍基因的轉錄單位有一定偏好性，但不包括轉錄起始單位［23-25］。LV載體整合位點的偏好性還會隨轉導細胞的活性狀態而變化，如HIV 均可整合在靜息狀態和激活狀態的CD4+T 細胞的活性轉錄單元中，但激活狀態的CD4+T 細胞的整合位點更常見于基因密集、CpG 島密集和G/C 堿基富集的基因組區域［26］。分裂和非分裂的嚙齒動物細胞之間的整合也有區別，相較于非分裂細胞，自失活（self inactivating，SIN）載體在分裂細胞中的整合優先發生在基因編碼區域［27］。此外，對發生HIV 整合的靶DNA 上的核小體進行結構分析表明，核小體表面的向外DNA主凹槽有利于整合的發生，由此可以誘導原癌基因（如Evi1和B-Raf）激活［2］。LV 載體在基因治療中表現出高效性和安全性，但隨機整合的特性仍會引發難以預料的插入突變。因此，第1 代～第4 代LV 載體通過改造包膜蛋白、去除輔助蛋白、添加土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件，以及開發SIN 載體和整合缺陷LV（integration-deficient LV）等方式，有效減少載體整合且提高病毒載體滴度［28］。

2 病毒載體介導的遺傳毒性評價方法

以病毒載體為遞送載體的基因治療產品，由于復雜的生物組成和特殊的作用機制，介導的遺傳毒性區別于傳統的遺傳毒性，主要為整合插入導致細胞發生基因突變、基因失活/激活或癌變的風險，因此其安全性評價不能完全采用化學藥的傳統毒理學方法［2-4］。全基因組分析、整合位點分析、核型分析和評估轉化潛力試驗等方法能夠從不同角度對病毒載體介導的遺傳毒性進行評價，具有針對性、高效性、準確性等特點。

2.1 脫靶修飾的全基因組分析

近年來，CRISPR/Cas9 系統已成為醫學領域最具潛力的基因編輯工具。CRISPR/Cas9 系統的特異性主要取決于單鏈導向RNA（single guide RNA，sgRNA）的識別序列。由于設計的sgRNA 可能會與非靶點DNA序列形成錯配，導致非預期的基因突變效應，該效應稱為脫靶效應。CRISPR/Cas9 技術在被廣泛應用的同時，發生脫靶效應的頻率也在增加［29］。CRISPR/Cas9 系統需要結合有效的體內遞送方式才可能最終轉化為臨床疾病治療工具。目前可借助病毒載體或非病毒載體進行遞送，其中AAV載體最為安全。AAV載體能感染分裂和非分裂細胞，并具有低免疫原性、高組織特異性、高轉導效率等優勢［30］。理想的基因編輯遞送工具應兼具瞬時和高效的特點，以確保治療的安全性和有效性。而AAV載體作為CRISPR/Cas9系統的遞送載體，進入細胞后可支持CRISPR/Cas9 系統持續表達Cas 蛋白；相較于瞬時表達，sgRNA 介導的脫靶概率將增大，加之AAV 載體可整合進宿主基因組的潛在風險，將進一步放大sgRNA介導的脫靶效應，造成不同程度的遺傳毒性風險。全基因組測序技術是對某物種基因組進行測序得到其基因組序列的方法，分為體內全基因組脫靶分析方法和體外全基因組脫靶分析方法，已由第1 代測序技術發展到第3 代，目前已經成為分析脫靶效應的主流方法，其中全基因組無偏雙鏈斷裂點測序（genomewide，unbiased identification of double strand breaks enabled by sequencing）和基因組環化測序（circularization forinvitroreporting of cleavage effects by sequencing）代表了迄今為止最具可擴展性和易于復制的方法［31］。與傳統方法相比，該方法具有更加全面、精準、高效等優勢［32］，不足之處在于成本高、產量低，需要復雜的生物信息學知識，且對數據存儲和處理有巨大的計算需求。

2.2 基因組DNA的整合位點分析

整合位點分析可精確定位基因組中的插入，為評估縱向修飾基因和移植細胞群的克隆性提供了一種工具，該技術已成為整合載體系統以確定安全性和追蹤整合位點的主要基準。最初病毒載體整合位點分析經TaqMan 實時熒光定量PCR 分離擴增，用獲得的擴增產物進行分子雜交實驗來分析整合位點特征［33］。由于PCR與測序技術的快速發展，操作復雜、靈敏度低的分子雜交技術逐漸被取代，下一代測序（next-generation sequencing）逐漸成為主流的整合位點分析技術。根據PCR技術路線的不同，主要有反向PCR、連接介導型PCR（ligation-mediated-PCR，LM-PCR）和線性擴增介導型PCR（linear amplification mediated-PCR，LAM-PCR）。

2.2.1 反向PCR

反向PCR 技術可對已知DNA 片段相鄰的未知序列進行擴增和研究。此方法在分子生物學研究中應用廣泛，可檢測病毒、轉座子等在基因組中的整合位點和克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移文庫等［34］。首先使用限制性核酸內切酶將宿主DNA打斷，然后對病毒載體末端重復序列設計反向引物并進行擴增，從而在連接酶的作用下已知序列（末端重復序列）與整合位點兩翼的未知序列形成環狀結構，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析判斷其相對分子質量后，可進行TA 克?。═A cloning）及測序，獲得病毒載體整合位點特征［35］。反向PCR的主要優勢在于簡單快速，但其連接酶成環效率較低，導致使用范圍受限。

2.2.2 連接介導型PCR

LM-PCR 主要通過4 個步驟來實現［36］：①模板DNA 的片段化處理；②針對病毒載體末端重復序列設計引物；③模板片段與接頭連接；④進行PCR擴增反應。擴增產物通過測序后即可揭示病毒載體整合位點特征。LM-PCR 具有靈敏度較高、使用通用引物擴增均衡、對模板質量要求低和產物產量高等優勢，同時也存在操作步驟相對繁瑣、面對復雜模板時易丟失片段等缺點［37-39］。使用限制性內切酶對模板DNA進行片段化處理，存在酶切偏好的局限性，因此LM-PCR 的衍生體，即剪切延伸引物標簽選擇（shearing extension primer tag selection，S-EPTS）/LM-PCR 被開發，其使用超聲打斷法對模板DNA進行片段化處理，隨機打斷的的方式克服了酶切的偏好性，使得擴增效果大幅提高［40］。

Cristina 等［41］使用一種介導人CD18 的LV 載體，對白細胞黏附缺陷癥Ⅰ型進行基因治療，并使用S-EPTS/LM-PCR 進行整合位點分析。整合位點分析在Genewerk 實驗室（德國）進行，模板DNA用量為500 ng進行擴增，并使用超聲剪切儀剪切至中位長度400～500 bp。使用長末端重復序列特異性的生物素化引物對剪切的DNA 進行延伸。擴增產物通過磁珠捕獲富集，然后連接到包括分子條形碼在內的連接盒上。連接產物經2輪指數PCR擴增后采用MiSeq技術（Illumina平臺）進行深度測序，最終在對應的樣本中檢測到10個最顯著的插入位點。

2.2.3 線性擴增介導型PCR

LAM-PCR 與LM-PCR 不同之處在于，在模板DNA 的片段化處理前引入線性擴增，即對目標序列（載體-基因組連接部分）設計特異性引物并進行生物素化標記，通過磁珠固相選擇去除非目標DNA序列，保留的目標序列則被進行初始預擴增（100個循環）。該步驟使得LAM-PCR 的靈敏度和特異性大幅提高，是目前識別位于已知DNA 附近的未知DNA 的最敏感方法［42］。LAM-PCR 同樣受到酶切偏好的限制。為此開發了一種LAM-PCR 的變體，稱為非限制性LAM-PCR，可繞過限制性消化，從而消除整合位點的酶切偏好性，有利于對宿主基因組中的原病毒位置進行全面分析［43］。

Helen 等［44］使用LAM-PCR 對轉導整合缺陷LV 的平滑肌細胞DNA 進行擴增。磁珠捕獲生物素化的單鏈線性PCR 產物后，進行了雙鏈DNA 合成。得到的雙鏈片段分別用Tsp509Ⅰ或MseⅠ酶切，連接盒接頭連接后進行2輪指數擴增。對所得到的LAM-PCR 擴增產物進行深度測序并使用局部同源性搜索工具（basic local alignment search tool，BLAT）與人類基因組序列進行比對，最終分析了共同插入位點的傾向性。

2.2.4 靶向富集測序

靶向富集測序是一種捕獲基因組特定區域DNA 并進行深度測序的方法［45］，其關鍵在于靶向富集。當前高通量測序的靶向富集方法主要有2種［46］：①雜交捕獲法，主要利用探針雜交富集目標片段，適用于基因組目標區域的全面檢測，但依賴于成百上千個寡核苷酸探針的設計、復雜的微陣列芯片制造和較長的雜交時間；②多重PCR 擴增法，其核心是引物設計，先通過PCR 擴增富集目標片段，再進行文庫構建，適用于研究的目標區域相對較小，對于拷貝數較低的模板DNA，可產生足夠數量用于測序的擴增子，這種方法能明顯提高效率，節約時間，降低經濟成本；不足之處在于存在引物互相干擾和非特異性擴增等問題［45］。CRISPR/Cas9 靶向富集方法的出現彌補了上述2 種靶向富集方法的不足，該方法具有無PCR 擴增、保留堿基修飾信息、實現高測序深度、低錯誤率和低成本的長讀長測序等優點［47］。靶向富集測序在評估病毒載體介導的遺傳毒性時，能夠捕獲和測序載體基因組，并確定載體拷貝數；可以對一個給定的載體進行廣泛的驗證，對載體基因組進行定量分析，揭示整合位點的整體克隆性并闡明每個細胞和載體基因組拷貝的整合頻率。

2.3 核型分析

病毒載體與宿主基因組發生整合，尤其當整合發生在基因組不穩定區域，如衛星DNA 序列、回文序列和CpG 島，則更容易自發斷裂，導致缺失、插入和易位等［48］。因此，精準確定目的基因在宿主染色體上的位置成為重中之重。核型分析技術為檢測克隆性異常相關核型及可能的染色體重排提供了可能。傳統的染色體核型分析技術是診斷染色體疾病的金標準，但該方法存在診斷周期長、易培養失敗、操作過程繁瑣復雜、對技術人員要求較高等局限［49］。核型分析對染色體的輕微結構異常不能做出明確診斷，尤其是對具有相似條紋或相似片段的染色體易位的診斷有一定難度；而熒光原位雜交技術可很好克服該局限性，能夠分析一部分染色體顯帶技術不易分辨的異常［50］。光譜染色體自動核型分析技術是在熒光原位雜交技術基礎上發展起來的，對染色體結構異常能作出快速而準確的診斷，更可以揭示常規分析方法難以識別的染色體易位、重排和一些未知來源的標記染色體［51］。

2.4 評估細胞轉化潛力實驗

病毒載體基因組插入到宿主基因組可干擾宿主細胞鄰近基因的轉錄/轉錄后活性，病毒載體中的啟動子或增強子能使癌基因或腫瘤抑制基因表達失調，并引起插入突變導致細胞轉化［3］。軟瓊脂克隆形成實驗是研究細胞惡性轉化的常用方法，也是體外細胞轉化的金標準檢測方法，缺點是不適合進行高通量篩選［52-53］。低附著生長實驗是一種快速且可定量的細胞轉化檢測方法，彌補了軟瓊脂克隆形成實驗的不足［54］。此外，還開發了體外永生化法［55-56］，能夠檢測由于病毒載體插入導致原代小鼠骨髓細胞中原癌基因Evi1表達水平的上調，但耗時較長；還有白細胞介素2 細胞增殖實驗［57］和白細胞介素3非依賴性突變體選擇法［6］，以及利用Cdkn2a-/-易感腫瘤小鼠模型進行體內實驗，以檢測病毒載體介導的插入誘變，但這些試驗既耗時又昂貴［58-59］。

3 結語

我國國家藥品監督管理局頒布的《基因治療產品非臨床研究與評價技術指導原則》中指出，基因治療產品將遺傳物質轉移到宿主細胞內或整合到宿主基因組中或對宿主基因組進行編輯，存在潛在的遺傳毒性風險。目前對于判斷細胞基因組插入/修飾是否會產生遺傳毒性、是否最終會發生癌變依然缺乏系統的認知［60］。目前的遺傳毒性檢測策略在很大程度上依賴于檢測相對較短的暴露后對DNA 的影響（損傷或突變）和突變的表達期，但病毒載體介導的插入誘變，可能需要較長時間才能在患者中顯現出來。雖然小鼠中常見的整合位點顯示與人類癌基因和腫瘤抑制基因有顯著重疊［59］，但仍應考慮檢測不太常見的插入位點的范圍。此外，Bokhoven 等［6］提出病毒載體介導的遺傳毒性評估方法需要具備可定量、可再現并能檢測基因功能的獲得/缺失、確定整合位點等。因此，已有的遺傳毒性評價方法需要不斷優化，以評估病毒載體介導的遺傳毒性。這些優化包括使用受體群體來源的細胞來避免疾病和（或）年齡因素的影響，以及使用可能增強體外模型的體內相關性并支持長期培養的3D 模型［2，7］。同時，在此基礎上進行新方法開發與創新。期待能不斷拓寬且加深對病毒載體的認識，對其有清晰的、系統的認知，從而經過科學、慎重、嚴謹的綜合考慮，開發通用型的病毒載體介導的遺傳毒性評價方法，建立完整的病毒載體介導的遺傳毒性評價體系，以用于早期、準確、快速地評價病毒載體介導的遺傳毒性。