兩個(gè)家蠶CPFL表皮蛋白基因的鑒定與表達(dá)分析

劉惠芬　華麗峰　劉文光　婁齊年　衣葵花　李云芝　郭光

摘要：昆蟲CPFL表皮蛋白是一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白。本研究通過生物信息學(xué)分析從家蠶基因組中鑒定出2個(gè)CPFL基因，命名為BmHCP1和BmHCP2。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)蛋白在羧基末端均具有CPFL表皮蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)序列YCW以及重復(fù)序列AAH、AAPA、AAPV。進(jìn)化樹分析顯示，2個(gè)蛋白與鱗翅目昆蟲藝神袖蝶（Heliconius erato）和柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）具有較高同源性。熒光定量PCR分析顯示，BmHCP1和BmHCP2存在組織、時(shí)相特異性表達(dá)，幼蟲期在頭部、中腸、表皮等組織中表達(dá)量較高；蛹期除翅原基、血淋巴、觸角和足等組織外均有較高表達(dá)量：成蟲期在足、觸角、翅原基、表皮等組織中表達(dá)量較高；蛹期在大多數(shù)組織的表達(dá)量明顯高于幼蟲期和成蟲期。研究結(jié)果為進(jìn)一步探明家蠶表皮蛋白基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：家蠶；CPFL表皮蛋白；序列分析；表達(dá)分析；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S881.2：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）03-0139-06

表皮對昆蟲適應(yīng)復(fù)雜多變的生存環(huán)境至關(guān)重要，具有皮膚和外骨骼的雙重作用，主要成分是幾丁質(zhì)和表皮蛋白。昆蟲表皮蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白，按照保守結(jié)構(gòu)域可分為12個(gè)家族，包括R&R、Tweedle、CPF和CPFL等。R＆R表皮蛋白家族最早由Rebers等發(fā)現(xiàn)，含有GCYAEGYPP保守結(jié)構(gòu)域，已公布的521種節(jié)肢動(dòng)物的表皮蛋白中，2/3以上具有該保守結(jié)構(gòu)域，并已證實(shí)其具有結(jié)合幾丁質(zhì)的作用。Tweedle表皮蛋白家族是研究果蠅（Drosophila melanogaster）表皮表型及形態(tài)發(fā)生機(jī)制時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的，該蛋白家族基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致果蠅表皮出現(xiàn)各種突變性狀。CPF是一類小的表皮蛋白家族，具有51個(gè)保守氨基酸的表皮蛋白基序，其保守結(jié)構(gòu)域是從黃粉蟲（Tenebrio mlitor）和東亞飛蝗（Locustamigratoria）的6個(gè)表皮蛋白序列中被識(shí)別JLH來的，另外，CPF表皮蛋白家族還具有保守的羧基端YGW、YAW、HGW序列。CPFL是一種具有類似于CPF保守基序的表皮蛋白家族，兩者相似性很高，有許多共同的保守基序，尤其是羧基端保守序列。昆蟲表皮蛋白基因的表達(dá)受環(huán)境、激素、轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)含子等因素共同影響，具有時(shí)相和組織特異性。昆蟲表皮蛋白及其編碼基因被認(rèn)為是研究昆蟲蛻皮和變態(tài)的調(diào)控機(jī)理、理解昆蟲發(fā)育期角質(zhì)層在生理生化及結(jié)構(gòu)上的修飾的重要靶標(biāo)。

Futahashi等研究發(fā)現(xiàn)，家蠶存在220個(gè)表皮蛋白基因，其中包括148個(gè)R&R、4個(gè)Tweeclle、1個(gè)CPF和4個(gè)CPFL表皮蛋白基因。梁九波在家蠶基因組中鑒定到255個(gè)表皮蛋白基因，同樣包含4個(gè)CPFL表皮蛋白基因。Futahashi等發(fā)現(xiàn)鳳蝶幼蟲中存在2個(gè)硬表皮蛋白基因，HCP1和HCP2（GenBank登錄號(hào)分別為AB264673、AB264675），與鳳蝶擬態(tài)特殊的突起結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究利用上述2個(gè)鳳蝶硬表皮蛋白基因序列，通過生物信息學(xué)分析，得到2個(gè)家蠶表皮蛋白基因（BmHCP1，BmHCP2），并在NCBI注冊，GenBank登錄號(hào)分別為FJ577507和FJ577508。同時(shí)，對這2個(gè)基因進(jìn)行時(shí)相和組織表達(dá)分析，以期為探明家蠶表皮蛋白基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試家蠶品種為JY-I，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶購自Pro-mega公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；DL8000 Plus DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司：引物合成和DNA測序委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nihgov/）公布的2條柑橘風(fēng)蝶硬表皮蛋白基因的序列（GenBank登錄號(hào)：AB264673，AB264675），進(jìn)行家蠶tBIASTx序列比對，得到EST序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行裝配并手工校正，獲得家蠶表皮蛋白基因序列，利用SignaIP 5.0（https：//serv-ices.healthtech.dtu.dk/service.php？SignaIP-5.0）在線工具對其信號(hào)肽進(jìn)行分析，利用ClustaIX1.83軟件（默認(rèn)設(shè)置）進(jìn)行多序列比對，利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR

利用TRIZol試劑盒提取家蠶不同發(fā)育時(shí)期、不同組織的總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度。以O(shè)ligo（dT）20V為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；反應(yīng)條件為30℃10min，42℃1h，70℃15min，4℃5min。根據(jù)1.3拼接得到的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以cDNA為模板（約相當(dāng)于10ng總RNA轉(zhuǎn)錄量）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min：55℃退火40s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)：72℃補(bǔ)延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測序檢測，詳細(xì)方法參照文獻(xiàn)[20-21]，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 Real-time PCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

參照1.4提取家蠶不同時(shí)期、不同組織的總RNA，取1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以所得cDNA為模板（約相當(dāng)于10ng總RNA轉(zhuǎn)錄量），以家蠶actinA3基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行Real-time PCR，每個(gè)樣本至少3次重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃20s，58℃20s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)：熔解曲線從55℃到95℃，每0.5℃讀取10s。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將包含日的基因及內(nèi)參基因片段克隆到pMD18-T載體上，測定質(zhì)粒濃度并按10s-104拷貝μL進(jìn)行梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行Real-time PCR。以所得Ct值對相應(yīng)拷貝數(shù)的對數(shù)值作圖，即得各個(gè)基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性方程v=ax+b。對Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行絕對定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算x值，則待測基因的拷貝數(shù)Y=10x。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmHCP1、BmHCP2序列號(hào)分析

利用2條柑橘鳳蝶硬表皮蛋白基因序列在NCBI中進(jìn)行家蠶tBIASTx序列比對，獲得2個(gè)家蠶表皮蛋白基因BmHCPl（CenBank：FJ577507）和BmHCP2（GenBank：FJ577508），均位于第23號(hào)染色體上，位置為NC_051380.1（10459128-10460263）和NC_051380.1（10437133-10438764），編碼區(qū)（CDS）序列長度分別為918bp和714bp，分別編碼305個(gè)和237個(gè)氨基酸。對其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）表明，2個(gè)基因編碼的蛋白在羧基末端均具有CPFL表皮蛋白典型的保守氨基酸序列YCW，且在其內(nèi)部有許多重復(fù)的短的片段：AAH、AAPA、AAPV等。用signaIP 5.0在線預(yù)測軟件對2個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽及其酶切位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，2個(gè)表皮蛋白均具有信號(hào)肽，酶切位點(diǎn)均位于第17個(gè)和18個(gè)氨基酸之間，分別是VRA-GG和ARA-GG。

2.2 幾種昆蟲CPFL蛋白氨基酸序列比對分析

將BmHCP1和BmHCP2蛋白羧基端序列與鞘翅日昆蟲蔗根象鼻蟲（Diaprepes abbreviatus），鱗翅目昆蟲柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）、藝神袖蝶（Heli-conius erato），雙翅目昆蟲岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti），直翅目昆蟲東亞飛蝗（Locusta migratoria）的CPFL表皮蛋白的羧基端序列（登錄號(hào)見表2）利用ClustaIX l.83軟件進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)上述幾個(gè)目昆蟲的CPFL蛋白羧基端具有較高保守性，除藝神袖蝶HeCPFL2外均含有YGW/YAW/HGW序列（圖2）。

2.3 CPFL蛋白家族系統(tǒng)發(fā)生分析

利用MEGA 6.0軟件將BmHCPI和BmHCP2蛋白序列與已知的鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目昆蟲的CPFL表皮蛋白序列進(jìn)行比對，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，2個(gè)家蠶表皮蛋白與鱗翅目昆蟲藝神袖蝶和柑橘鳳蝶的CPFL蛋白家族位于一個(gè)大的進(jìn)化分枝上，2個(gè)家蠶表皮蛋白并不在同一個(gè)亞進(jìn)化分支上（圖3）。

2.4 BmHCP1、BmHCP2的定量表達(dá)分析

對家蠶幼蟲（5齡第3天）、蛹（第3天）、成蟲（第2天）三個(gè)時(shí)期的頭部、表皮、脂肪體、絲腺、馬氏管、翅原基、精巢、卵巢、中腸、氣管叢、血淋巴、觸角等組織中BmHCP1和BmHCP2基因表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4、圖5）顯示，兩基因表達(dá)均存在時(shí)相和組織特異性，蛹期在大多數(shù)組織中的表達(dá)量明顯高于幼蟲期和成蟲期：幼蟲期Bm-HCP1在頭、中腸、表皮等組織中表達(dá)量相對較高，BmHCP2在頭、精巢、中腸等組織中表達(dá)量相對較高：蛹期除在翅原基、血淋巴、觸角和足中表達(dá)量較低外，在其他組織中表達(dá)量相對較高：成蟲期在翅原基、表皮、足、觸角等組織中表達(dá)量較高。幼蟲期多數(shù)組織中，BmHCP2的表達(dá)量明顯高于BmHCP1；蛹期多數(shù)組織中BmHCP1和BmHCP2表達(dá)量相當(dāng)：成蟲期觸角和足中BmHCP2的表達(dá)量明顯高于BmHCP1。

3 討論與結(jié)論

昆蟲的表皮由幾丁質(zhì)和表皮蛋白組成，隨著家蠶、按蚊、果蠅、蜜蜂和赤擬谷盜等昆蟲全基因組測序相繼完成，對表皮蛋白的研究也隨之展開。表皮蛋白是研究昆蟲蛻皮與變態(tài)調(diào)控機(jī)制的重要模型，受到越來越多的重視。本研究利用柑橘鳳蝶幼蟲硬表皮蛋白基因序列，通過生物信息學(xué)分析獲得了2個(gè)家蠶表皮蛋白基因BmHCP1和Bm-HCP2，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)均屬于CPFL蛋白家族。Futahashi等在家蠶表皮蛋白基因組研究中鑒定了4個(gè)編碼CPFL蛋白的基因，它們形成排列緊密的表皮蛋白串聯(lián)基因簇，其中BomrCPFL3（BR000420）和BomrCPFL4（BR000421）與本研究中發(fā)現(xiàn)的BmHCP1和BmHCP2僅有少數(shù)幾個(gè)氨基酸的差異，且BmHCP1和BmHCP2也串聯(lián)分布在同一條染色體上，進(jìn)一步確定BmHCP1和Bm-HCP2屬于CPFL蛋白家族基因。在昆蟲領(lǐng)域，家蠶、果蠅、按蚊等都具有眾多基因家族編碼表皮蛋白，其中對按蚊表皮蛋白基因研究的較為通透，它們同樣以排列緊密的串聯(lián)基因簇形式存在，其氨基酸序列幾乎完全一樣。

本研究對家蠶BmHCP1和BmHCP2基因進(jìn)行時(shí)相、組織表達(dá)分析，結(jié)果顯示，2個(gè)基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中存在特異性表達(dá)，且在蛹期的表達(dá)量明顯高于幼蟲和成蟲期。Fu-tahashi等在家蠶吐絲后發(fā)現(xiàn)了CPFL轉(zhuǎn)錄因子，推測其可能與家蠶蛹期硬表皮剛性結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)：還發(fā)現(xiàn)，即使是相同基因簇的相鄰表皮蛋白基因，也存在組織和時(shí)相特異性表達(dá)，這與本研究結(jié)果相似。

家蠶表皮蛋白基因BmCPG2、BmCPR2、Bm-CPR63等與鱗毛的構(gòu)建有關(guān)。赤擬谷盜表皮蛋白基因TcCPAP3-B缺失后，足的股骨-脛骨關(guān)節(jié)以及后足的股骨-脛骨關(guān)節(jié)和脛骨-跗骨關(guān)節(jié)變得剛硬并畸形，推測該基因可能參與足的構(gòu)建。2個(gè)鳳蝶硬表皮蛋白基因與其擬態(tài)特殊的突起結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，BmHCP1和BmHCP2在家蠶成蟲期翅、觸角及足中表達(dá)量較高，推測可能參與家蠶翅、觸角及足剛性結(jié)構(gòu)的形成，具體功能有待進(jìn)一步研究。

BmHCP1和BmHCP2的生物信息學(xué)分析及其時(shí)相、組織表達(dá)分析為家蠶表皮蛋白基因的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，今后可進(jìn)一步開展BmH-CP1和BmHCP2上游調(diào)控元件如核心啟動(dòng)子、起始子、基因表達(dá)調(diào)控元件以及調(diào)控模式等方面的研究。

基金項(xiàng)目：山東省蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（SDAIT-18-02，SDAIT-18-03）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2023C03）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系煙臺(tái)綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（CARS-18-SY208）