左歸降糖舒心方調控TLR4/NF-κB通路抑制糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化的機制研究

〔摘要〕 目的 基于Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路探討左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR小鼠心肌纖維化及炎癥因子的影響。方法 以8周齡雄性MKR小鼠為實驗對象，采用高脂飲食聯合腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）40 mg/kg構建糖尿病心肌病模型，隨機分為中藥高劑量組[33.67 g/（kg·d）左歸降糖舒心方2 g/mL]、中藥低劑量組[16.84 g/（kg·d）左歸降糖舒心方2 g/mL]、西藥聯合組[0.23 g/（kg·d）二甲雙胍聯合1.5 mg/（kg·d）依那普利]和模型組（等容量蒸餾水）；另設FVB小鼠為空白對照組（等容量蒸餾水）。每組10只，連續給藥8周后取材。收集尾靜脈血液檢測空腹血糖水平；采用HE、Masson染色觀察心肌病理改變，電鏡觀察心肌組織超微結構變化；采用ELISA檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）含量；采用Western blot法檢測TLR4、NF-κB p56、p-NF-κB p56/NF-κB p56蛋白表達情況；RT-qPCR及Western blot檢測小鼠心肌組織Ⅰ型膠原（collagen type I，Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，Collagen Ⅲ）及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達水平。結果 與空白對照組比較，模型組小鼠空腹血糖及血清中TNF-α、IL-1β含量增高（Plt;0.01）；心肌細胞結構紊亂，膠原含量增加，心肌細胞重度退行性變；心肌組織中TLR4、NF-κB p56、p-NF-κB p56/NF-κB p56蛋白表達上調（Plt;0.01），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA及蛋白表達增加（Plt;0.05，Plt;0.01），中藥高劑量組小鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達增加（Plt;0.01）。與模型組比較，中藥高、低劑量組和西藥聯合組小鼠空腹血糖及血清中TNF-α、IL-1β含量均降低（Plt;0.01）；心肌結構改善，膠原沉積減少；心肌組織中TLR4、NF-κB p56、p-NF-κB p56/NF-κB p56蛋白表達下調（Plt;0.01），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA蛋白及mRNA表達下調（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組小鼠空腹血糖及血清中TNF-α、IL-1β含量均升高（Plt;0.01），心肌結構無明顯改善，膠原沉積無顯著減少；心肌組織中TLR4、NF-κB p56、p-NF-κB p56/NF-κB p56蛋白表達上調（Plt;0.01），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA蛋白及mRNA表達上調（Plt;0.01）。結論 左歸降糖舒心方能抑制心肌炎性反應、改善心肌細胞結構，其作用機制可能與調控TLR4/NF-κB通路、下調細胞炎癥因子表達、抑制心肌纖維化有關。

〔關鍵詞〕 左歸降糖舒心方；心肌纖維化；炎性反應；TLR4/NF-κB通路；MKR鼠；糖尿病

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.003

Mechanism of Zuogui Jiangtang Shuxin Formula in inhibiting

myocardial fibrosis in mice with diabetic cardiomyopathy by

regulating TLR4/NF-κB pathway

HUANG Juan1， WANG Yiyang2， XIAO Fan2， LIU Xiu2， YU Rong2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Shuxin Formula （ZGJTSXF） on myocardial fibrosis and inflammatory factors in MKR mice with diabetic cardiomyopathy （DCM） based on the Toll-like receptor 4 （TLR4）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway. Methods Male MKR mice aged 8 weeks were used as experimental subjects. A diabetic cardiomyopathy model was established using a high-fat diet combined with intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ） 40 mg/kg. The mice were randomized into high- [33.67 g/（kg·d）] and low-dose [16.84 g/（kg·d）] ZGJTSXF groups （containing raw medicinals 2 g/mL）， western medicine combination group [metformin 0.23 g/（kg·d） combined with enalapril 1.5 mg/（kg·d）]， and model group （equal volume of distilled water）; additionally， FVB mice were set as the blank control group （equal volume of distilled water）. Each group consisted of 10 mice and samples were collected after 8 weeks of continuous medication. Tail vein blood was collected to test fasting blood glucose levels. Myocardial pathological changes were observed using HE and Masson's trichrome staining， and ultrastructural changes in the myocardial tissue were examined with electron microscopy. ELISA was used to measure the content of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin 1β （IL-1β） of the mice serum. Western blot was used to check the protein expressions of TLR4， NF-κB p56， and p-NF-κB p56/NF-κB p56. RT-qPCR and Western blot were employed to measure the expression levels of collagen type Ⅰ （Collagen Ⅰ）， collagen type Ⅲ （Collagen Ⅲ）， and α-smooth muscle actin （α-SMA） in the myocardial tissue of mice. Results Compared with the blank control group， the model group showed increased fasting blood glucose and serum levels of TNF-α and IL-1β （Plt;0.01）， accompanied by myocardial cell structural disorder， increased collagen content， and severe myocardial cell degeneration; the protein expressions of TLR4， NF-κB p56， and p-NF-κB p56/NF-κB p56 were upregulated in the myocardial tissue （Plt;0.01）， and the mRNA and protein expression levels of Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， and α-SMA were elevated （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the high- and low-dose ZGJTSXF groups and the western medicine combination group showed reductions in fasting blood glucose and serum levels of TNF-α and IL-1β （Plt;0.01）， improved myocardial structure， and decreased collagen deposition; the protein expressions of TLR4， NF-κB p56， and p-NF-κB p56/NF-κB p56 were downregulated in the myocardial tissue （Plt;0.01）， as well as the protein and mRNA expressions of Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， and α-SMA （Plt;0.01）. Compared with the western medicine combination group， the low-dose ZGJTSXF group exhibited increased fasting blood glucose and serum levels of TNF-α and IL-1β （Plt;0.01）， with no noticeable improvement in myocardial structure and no obvious reduction in collagen deposition; the protein expressions of TLR4， NF-κB p56， and p-NF-κB p56/NF-κB p56 were upregulated in the myocardial tissue （Plt;0.01）， along with increased protein and mRNA expressions of Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， and α-SMA （Plt;0.01）. Conclusion ZGJTSXF may inhibit myocardial inflammatory response and improve myocardial cell structure. Its mechanism of action may be related to the regulation of TLR4/NF-κB pathway， down-regulation of cellular inflammatory factor expression， and inhibition of myocardial fibrosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Zuogui Jiangtang Shuxin Formula; myocardial fibrosis; inflammatory response; Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway; MKR mice; diabetes

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是一種臨床常見的獨立于冠心病及高血壓的特異性心肌病，是糖尿病患者的重要致死原因之一[1-2]。近年來研究發現，心肌成纖維細胞過度增殖導致膠原纖維過度沉積，引起心肌纖維化及心肌重構，影響DCM進程和預后[3-5]。炎癥因子可誘導成纖維細胞異常增殖分化，而炎癥導致的級聯損傷效應可誘導細胞凋亡及焦亡，在損傷修復的過程中，形成心肌纖維化，而纖維化進程又可進一步促進多種炎性因子如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等釋放，誘導心肌缺血的發生[6]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為與炎癥反應關系密切的信號通路，參與許多炎癥性疾病的發生與發展[7]，也介導心肌炎癥的發生與發展[8]。TLR4/NF-κB通路通過調節炎癥反應影響DCM心肌纖維化，因此，針對該通路的靶向抑制成為防治DCM的研究關注點[9]。DCM歸屬于中醫學“消渴”并發“胸痹”“心痛”等范疇，本課題組認為“虛、毒、瘀”是2型糖尿病及其慢性并發癥發生發展的關鍵中醫病機，采用滋陰益氣、活血解毒的左歸降糖舒心方治療糖尿病心血管疾病取得顯著療效[10]。結合前期實驗研究，左歸降糖舒心方可明顯改善DCM模型小鼠的心肌纖維化、促進抗凋亡因子B細胞淋巴瘤-2（B-cell leukemia/lymphoma-2，Bcl-2）的表達、抑制促凋亡因子相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）和胱天蛋白酶-9表達，從而抑制心肌細胞損傷，但其具體作用機制尚不明確[11]。本實驗從調控TLR4/NF-κB通路角度出發，探討其與DCM中炎癥機制及心肌纖維化的關聯性，并以左歸降糖舒心方進行干預，為臨床診療DCM尋找新的治療靶點和治療藥物。

1 材料

1.1" 實驗動物

8周齡MKR轉基因糖尿病小鼠，體質量20～25 g，自美國國立衛生研究院引進后自然交配繁殖用于實驗研究[SYXK（湘）2019-0009]；FVB小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0003。動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗動物中心（倫理審批編號ZYFY20210728），溫度（24±2） ℃，濕度50%±10%，12 h/12 h人工光照/黑暗循環。

1.2" 藥物

左歸降糖舒心方組成：人參18 g，黃芪18 g，麥冬12 g，山茱萸12 g，生地黃15 g，黃連6 g，丹參9 g，葛根12 g，山楂9 g。中藥均采購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房，由湖南中醫藥大學藥學院吳勇軍副教授鑒定為正品。制備方法：藥材浸泡0.5 h，8倍量水煎煮1 h，過濾保留藥液；6倍水煮1 h，合并2次濾液，于旋轉蒸發儀濃縮至含生藥量為2 g/mL的藥液，置于4 ℃冰箱備用。

鹽酸二甲雙胍片（浙江亞太藥業股份有限公司，國藥準字：H33020106，批號：1170522，規格：0.25 g/片）；馬來酸依那普利片（江蘇制藥股份有限公司，國藥準字：H32026568，批號：17061412，規格：5 mg/片）。

1.3" 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司，批號：S17049）；Trizol總RNA抽提試劑（美國Life Technogies公司，批號：251804）；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-02323M1、JM-02415M2）；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗NF-κB p56單克隆抗體、兔抗p-NF-κB p56單克隆抗體、兔抗Ⅰ型膠原（collagen type I，Collagen Ⅰ）單克隆抗體、兔抗Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，Collagen Ⅲ）單克隆抗體、兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab13556、ab207297、ab239882、ab270993、ab184993、ab124964）。

電泳儀、轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40D）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）；化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；酶標儀（美國BioTek公司，型號：ELx800）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDoc XRS+）。

2 方法

2.1" 模型建立、分組及給藥

8周齡MKR小鼠采用高脂飼料喂養，FVB小鼠予以普通飼料喂養。4周后對MKR小鼠進行STZ腹腔注射以加速成模，實驗前一天禁食不禁水8 h。將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.0），按40 mg/kg劑量行腹腔注射，1次/d，連續3 d。STZ注射后第3天測小鼠空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L提示2型糖尿病制備成功。繼續高脂喂養4周后觀察小鼠心肌組織內膠原含量明顯增多且膠原纖維粗大、排列紊亂，肌纖維斷裂且有炎癥細胞浸潤，提示DCM模型制備成功[12]。

50只MKR小鼠造模，造模過程中死亡4只。造模成功46只，隨機選取40只分為模型組、西藥聯合組、中藥高劑量組及中藥低劑量組，每組10只。另取10只FVB小鼠為空白對照組。

按人和動物體表面積[13]的等效劑量系數折算法，選用60 kg成人用量換算，其中中藥高劑量組以左歸降糖舒心方33.67 g/（kg·d）灌胃；中藥低劑量組以左歸降糖舒心方16.84 g/（kg·d）灌胃；西藥聯合組予二甲雙胍0.23 g/（kg·d）聯合依那普利1.5 mg/（kg·d）灌胃。空白對照組、模型組以等體積蒸餾水灌胃。給藥均持續8周，每天1次。

2.2" 血糖水平檢測

按照分組干預8周后，收集小鼠尾靜脈血液，用血糖儀檢測空腹血糖水平。

2.3" 光鏡下觀察小鼠心肌組織病理形態

取心肌組織，多聚甲醛固定，經脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水、染色、貼片，采用HE及Masson染色，觀察心肌組織形態結構及膠原含量。

2.4" 透射電鏡觀察心肌組織結構

取心肌組織置于裝有電鏡固定液的培養皿中，用手術刀切割成1 mm3的小組織塊。再將切割好的小組織塊轉移至裝有新的電鏡固定液的EP管內繼續固定；0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗3次，每次15 min。采用0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h，0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗3次，每次15 min。將組織依次于30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇中脫水，每次20 min，100%丙酮脫水兩次，每次15 min。以丙酮∶812包埋劑=1∶1比例于37 ℃滲透2～4 h，以丙酮∶812包埋劑=1∶2比例于37 ℃滲透過夜，純812包埋劑37 ℃包埋5～8 h；將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。超薄切片機切取60～80 nm超薄切片樹脂塊，150目芳華膜銅網撈片。銅網于2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min；70%乙醇清洗3次；超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避開二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網切片放入銅網盒內室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.5" ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β含量

實驗步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，標準品加樣后，設空白孔、待測樣品孔。于待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，每孔加入酶標試劑100 μL，封板后置于37 ℃溫育60 min。棄去液體，甩干后每孔加入洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次后拍干。各孔先后加入顯色劑50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，于450 nm波長依序測量各孔的吸光度，于酶標儀下進行TNF-α、IL-1β含量檢測。

2.6" Western blot法檢測TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及α-SMA蛋白表達

剪取適量心肌組織，用冰預冷PBS洗組織，加入300 μL RIPA裂解液，于生物樣品均質儀中反復研磨，根據蛋白定量的結果，于第一孔點入蛋白標準品2 μL，其他每孔上樣10 μL已變性蛋白；開始電泳，電泳恒定電壓75 V，時間為130 min，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳；電泳結束后電轉移至硝酸纖維素膜，4 ℃封閉過夜，封閉后加入TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、Collagen Ⅲ（1∶1 000）、α-SMA（1∶2 000）一抗，室溫孵育30 min。再加入HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000）、山羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗，室溫孵育90 min。使用ECL化學發光液與膜孵育1 min，在暗盒內與X射線膠片曝光20 min，顯影沖洗。采用Quantity One專業灰度分析軟件進行數據分析。

2.7" RT-qPCR檢測Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA表達

取新鮮的心臟組織50 mg，充分研磨均勻后加入Trizol總RNA抽提試劑1 mL，冰浴勻漿，按說明書提取總RNA，每組取總RNA 1 μg逆轉錄成cDNA，按照實驗指導書進行PCR反應。PCR反應條件為95 ℃預變性60 s，95 ℃變性20 s，60 ℃退火60 s，進行40個循環。以GAPDH為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，引物序列見表1。

2.8" 統計學方法

采用SPSS 22.0進行統計處理。計量資料符合正態分布和方差齊性者，用“ｘ±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗；不符合正態性和方差齊性者用Tamhane's T2檢驗。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠血糖的影響

與空白對照組相比，模型組、中藥低劑量組小鼠空腹血糖升高（Plt;0.01）。與模型組相比，各用藥組小鼠血糖降低（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組小鼠血糖升高（Plt;0.01）。詳見表2。

3.2" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠心肌組織病理形態的影響

HE染色、Masson染色結果顯示，空白對照組小鼠心肌細胞形態正常，心肌間隙緊密，細胞間膠原沉積較少，未見明顯炎性浸潤；模型組小鼠心肌細胞肥大增粗，細胞質、細胞核分離，細胞間隙增大，可見較多炎性浸潤，心肌纖維排列紊亂，膠原含量明顯增加。與模型組比較，各藥物組心肌細胞與心肌纖維排列均有不同程度改善，膠原沉積及炎性浸潤明顯減少，細胞排列較整齊，纖維相對完整，其中，以中藥高劑量組及西藥聯合組改善較為明顯。詳見圖1。

3.3" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠心肌組織超微結構的影響

空白對照組見心肌細胞輕度退行性變，胞內基質溶解、略顯稀疏，肌原纖維絲結構排列緊密；細胞核呈不規則形，核膜完整，核周隙未見增寬，染色質均勻；線粒體大小不均、異形，多數膜完整，Z線、H帶結構尚可、清晰，局部斷裂。模型組心肌細胞重度退行性變，可見胞內基質大面積溶解、稀疏，細胞器減少、散亂分布，肌纖維大面積斷裂、退化，肌原纖維絲結構排列紊亂、稀疏。各藥物組心肌細胞中度退行性病變，細胞器減少、分布不均，肌纖維局部斷裂、退化，肌原纖維絲結構排列緊密、融合，肌節結構多見溶解、不對稱，明暗帶結構模糊，細胞核呈不規則形，核膜完整，核周隙未見增寬，染色質不均、少量凝集，其中，以中藥高劑量組及西藥聯合組改善狀態更為明顯。詳見圖2。

3.4" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

與空白對照組相比，其余各組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量增加（Plt;0.01）。與模型組相比，各用藥組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量降低（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組TNF-α、IL-1β含量增加（Plt;0.01）。詳見表3。

3.5" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達的影響

與空白對照組相比，其余各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達增加（Plt;0.01）。與模型組相比，各用藥組TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達降低（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達增加（Plt;0.01）。詳見圖3、表4。

3.6" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及α-SMA蛋白表達的影響

與空白對照組相比，模型組、中藥低劑量組及西藥聯合組小鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及α-SMA蛋白表達增加（Plt;0.05，Plt;0.01），中藥高劑量組小鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達增加（Plt;0.01）。與模型組相比，各用藥組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及α-SMA蛋白表達降低（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及α-SMA蛋白表達增加（Plt;0.01）。詳見圖4、表5。

3.7" 左歸降糖舒心方對DCM小鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA表達的影響

與空白對照組比較，其余各組心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA表達量增加（Plt;0.01）。與模型組比較，各用藥組小鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA表達量下降（Plt;0.01）。與西藥聯合組比較，中藥低劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA表達量增加（Plt;0.01）。詳見表6。

4 討論

據最新國際糖尿病聯盟的數據統計，全球約有4.25億糖尿病患者，且呈現逐年上升的趨勢，預計到2045年將達到7億人[14]，糖尿病心血管并發癥是糖尿病患者的主要死亡原因[15-16]。在DCM的發生發展過程中，持續糖脂代謝紊亂和活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度釋放觸發炎癥反應。TLR4可識別并激活機體的免疫細胞，促使炎癥介質及趨化因子釋放，同時活化經典的下游炎癥信號轉錄因子NF-κB，從而上調下游IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的表達[17-19]。炎癥的級聯反應可引起血管內皮細胞損傷、心肌細胞凋亡等病理狀態，影響心臟收縮功能[20]。正常狀態下，細胞外基質中存在Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的合成，促使心肌細胞排列整齊、保持心室壁強度，從而維持心肌組織結構的完整性[21-22]。研究發現，TLR4/NF-κB信號通路可調節基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶組織抑制物水平，降低蛋白水解酶含量，引起膠原在細胞外基質沉積[23]。同時Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的異常合成及比例失常可引起成纖維細胞增殖活化[24-26]。在炎癥因子的持續介導下，α-SMA表達上調，促進纖維連接蛋白和纖維狀膠原蛋白合成，激活心肌成纖維細胞的異常增殖及心肌纖維化過程，進一步引起心室重塑，最終誘發慢性心力衰竭[27]。

DCM的臨床表現歸屬于中醫學“消渴”并發“胸痹”“心痛”等范疇。中醫學認為，DCM病因病機為先天稟賦不足，后天失于調攝、勞累過度、久病耗傷、年老體衰，傷及于脾腎，脾主運化轉輸功能失司，腎主封藏失常，機體氣機運化失常，臟腑氣血陰陽失調，導致氣滯、血瘀、痰濁閉阻心脈，久而久之，損及心陽，可成心衰。在課題組前期研究的基礎上，依據DCM的基本病因病機，治法以“滋陰益氣以固本，活血解毒以治標”為要，故實驗中選擇左歸降糖舒心方進行干預[28-29]。方中黃芪、人參、山茱萸益氣健脾補腎，生地黃、麥冬、葛根清熱養陰生津，丹參活血化瘀，黃連清熱解毒，山楂行氣散瘀，諸藥合用，共奏滋陰益氣、活血解毒之功效，藥味功效切合DCM病因病機。

本研究使用的MKR小鼠為良好的2型糖尿病模型鼠，其具有骨骼肌特異性胰島素樣生長因子-1受體功能缺失特性[30]，同時，采用STZ及高脂飼料喂養促進DCM模型的構建。研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血糖水平明顯增高；HE染色及Masson染色顯示心肌細胞肥大增粗，結構紊亂，間隙增大，可見明顯炎性浸潤，局部出現變性壞死；膠原含量明顯增加，膠原纖維粗大；小鼠心肌組織中α-SMA、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ mRNA及蛋白表達增加，心肌纖維化病理改變明顯；小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β含量及心肌組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達顯著增加，提示DCM模型小鼠炎癥因子大量釋放；心肌組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達顯著增加，TLR4/NF-κB通路激活，并參與了DCM心肌炎癥反應。左歸降糖舒心方干預8周后，小鼠心肌組織的病理變化有明顯改善，炎性浸潤及膠原沉積明顯減少；血清中TNF-α、IL-1β含量降低，小鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達降低，表明左歸降糖舒心方可抑制TLR4/NF-κB通路激活，降低炎癥因子水平，抑制炎癥損傷。同時，Western blot及RT-qPCR分析結果進一步表明，左歸降糖舒心方可能通過抑制α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達，干預心肌纖維化的進程。

綜上所述，本研究探究了左歸降糖舒心方對MKR小鼠心肌纖維化及炎癥反應的作用及調控機制。結果顯示，左歸降糖舒心方可有效抑制TLR4/NF-κB通路，下調炎癥因子及α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達，減少膠原蛋白的沉積，抑制心肌細胞炎癥反應及纖維化過程，發揮干預DCM的作用。但關于中藥的最佳用藥劑量及靶向調節機制尚不明確，有待進一步研究分析。

參考文獻

[1] KNAPP M， TU X， WU R X. Vascular endothelial dysfunction， a major mediator in diabetic cardiomyopathy[J]. Acta Pharmacologica Sinica， 2019， 40（1）： 1-8.

[2] 李汶珊， 易曉利， 卜獻春，等. 滋膵通脈飲對糖尿病心肌病大鼠糖脂代謝及氧化應激的影響[J]. 中醫藥導報， 2023， 29（1）： 12-18.

[3] TAN Y， ZHANG Z G， ZHENG C， et al. Mechanisms of diabetic cardiomyopathy and potential therapeutic strategies： Preclinical and clinical evidence[J]. Nature Reviews Cardiology， 2020， 17（9）： 585-607.

[4] KHAN S， AHMAD S S， KAMAL M A. Diabetic cardiomyopathy： From mechanism to management in a nutshell[J]. Endocrine， Metabolic amp; Immune Disorders Drug Targets， 2021， 21（2）： 268-281.

[5] NAKAMURA K， MIYOSHI T， YOSHIDA M， et al. Pathophysiology and treatment of diabetic cardiomyopathy and heart failure in patients with diabetes mellitus[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（7）： 3587.

[6] LUO W， LIN K， HUA J Y， et al. Schisandrin B attenuates diabetic cardiomyopathy by targeting MyD88 and inhibiting MyD88-dependent inflammation[J]. Advanced Science， 2022， 9（31）： e2202590.

[7] 孫麗萍， 徐文娟. 中藥內服外熨對肝腎虧虛型膝骨關節炎患者炎性致痛因子、TLR4及NF-κB水平的影響[J]. 湖北中醫藥大學學報， 2023， 25（6）： 80-82.

[8] YOUSSEF M E， ABDELRAZEK H M， MOUSTAFA Y M. Cardioprotective role of GTS-21 by attenuating the TLR4/NF-κB pathway in streptozotocin-induced diabetic cardiomyopathy in rats[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology， 2021， 394（1）： 11-31.

[9] ZHAO J Y， LIU B， LI C. Knockdown of long noncoding RNA GAS5 protects human cardiomyocyte-like AC16 cells against high glucose-induced inflammation by inhibiting miR-21-5p-mediated TLR4/NF-κB signaling[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Ph？鄄

armacology， 2020， 393（8）： 1541-1547.

[10] HUANG Y L， XIANG Q， ZOU J J， et al. Zuogui Jiangtang Shuxin formula Ameliorates diabetic cardiomyopathy mice via modulating gut-heart axis[J]. Frontiers in Endocrinology， 2023， 14： 1106812.

[11] 蘇麗清， 喻" 嶸， 吳勇軍， 等. 左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠心肌細胞損傷和凋亡的影響[J]. 世界科學技術： 中醫藥現代化， 2022， 24（2）： 554-562.

[12] 史留陽， 譚丹妮， 劉" 秀， 等. 白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯對糖尿病心肌病MKR小鼠心肌細胞焦亡的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（4）： 591-597.

[13] NAIR A， MORSY M A， JACOB S. Dose translation between laboratory animals and human in preclinical and clinical phases of drug development[J]. Drug Development Research， 2018， 79（8）： 373-382.

[14] AVAGIMYAN A， POPOV S， SHALNOVA S. The pathophysiological basis of diabetic cardiomyopathy development[J]. Current Problems in Cardiology， 2022， 47（9）： 101156.

[15] WANG H C， WANG L J， HU F L， et al. Neuregulin-4 attenuates diabetic cardiomyopathy by regulating autophagy via the AMPK/mTOR signalling pathway[J]. Cardiovascular Diabetology， 2022， 21（1）： 205.

[16] CHEN D D， GENG Y， DENG Z W， et al. Inhibition of TLR4 alleviates heat stroke-induced cardiomyocyte injury by down-regulating inflammation and ferroptosis[J]. Molecules， 2023， 28（5）： 2297.

[17] PAN L F， NIU Z Q， GAO Y X， et al. Silencing of CREB inhibits HDAC2/TLR4/NF-κB cascade to relieve severe acute pancreatitis-induced myocardial injury[J]. Inflammation， 2021， 44（4）： 1565-1580.

[18] DU H B， DING L Q， ZENG T， et al. LncRNA SNHG15 modulates ischemia-reperfusion injury in human AC16 cardiomyocytes depending on the regulation of the miR-335-3p/TLR4/NF-κB pathway[J]. International Heart Journal， 2022， 63（3）： 578-590.

[19] AKSEH S， NEMATI M， ZAMANI-GHAREHCHAMANI E， et al. Amnion membrane proteins attenuate LPS-induced inflammation and apoptosis by inhibiting TLR4/NF-κB pathway and repressing microRNA-155 in rat H9c2 cells[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology， 2021， 43（4）： 487-494.

[20] ZHOU T， XIANG D K， LI S N， et al. MicroRNA-495 ameliorates cardiac microvascular endothelial cell injury and inflammatory reaction by suppressing the NLRP3 inflammasome signaling pathway[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2018， 49（2）： 798-815.

[21] 熊霞軍， 胡思遠， 鐘森杰， 等. 基于miR-378探討丹紅注射液干預壓力超負荷心力衰竭大鼠心肌纖維化機制[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（3）： 383-390.

[22] PENG C， ZHANG Y X， LANG X Y， et al. Role of mitochondrial metabolic disorder and immune infiltration in diabetic cardiomyopathy： New insights from bioinformatics analysis[J]. Journal of Translational Medicine， 2023， 21（1）： 66.

[23] YANAN S， BOHAN L， SHUAIFENG S， et al. Inhibition of Mogroside IIIE on isoproterenol-induced myocardial fibrosis through the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences， 2023， 26（1）： 114-120.

[24] ZHANG M， SUI W H， XING Y Q， et al. Angiotensin IV attenuates diabetic cardiomyopathy via suppressing FoxO1-induced excessive autophagy， apoptosis and fibrosis[J]. Theranostics， 2021， 11（18）： 8624-8639.

[25] LI C G， ZHANG J， XUE M， et al. SGLT2 inhibition with empagliflozin attenuates myocardial oxidative stress and fibrosis in diabetic mice heart[J]. Cardiovascular Diabetology， 2019， 18（1）： 15.

[26] 易麗貞， 楊" 俊， 謝" 濤， 等. 隔藥餅灸對動脈粥樣硬化易損斑塊兔腹主動脈TLR2、TLR4、NF-κB表達的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2021， 41（3）： 364-369.

[27] ZHANG X Q， QU H Y， YANG T， et al. Astragaloside IV attenuate MI-induced myocardial fibrosis and cardiac remodeling by inhibiting ROS/caspase-1/GSDMD signaling pathway[J]. Cell Cycle， 2022， 21（21）： 2309-2322.

[28] 廖心悅， 向" 琴， 皺駿駒， 等. 左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠Foxo1/β-MHC的影響[J]. 時珍國醫國藥， 2023， 34（6）： 1302-1305.

[29] 田" 娜， 喻" 嶸， 張薇薇， 等. 左歸降糖舒心方調控自噬對糖尿病轉基因MKR鼠心肌損傷的影響[J]. 中國中醫基礎醫學雜志， 2023， 29（5）： 747-752.

[30] 喻" 嶸， 成細華， 胡" 偉， 等. 骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1及胰島素雙受體功能缺失所致小鼠2型糖尿病[J]. 中國糖尿病雜志， 2008（7）： 438-440.

（本文編輯" 周" 旦）

〔收稿日期〕2023-11-01

〔基金項目〕國家自然科學基金面上項目（82074400）；湖南省重點研發計劃項目（2020SK2101）；湖南省教育廳科研項目（20K094）；湖南省自然科學醫衛行業聯合基金項目（2024JJ9436）。

〔通信作者〕*喻" 嶸，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：yuron@21cn.com。