肺心湯通過調控AMPK/mTOR信號通路抑制自噬對低氧性肺動脈高壓大鼠的保護作用

〔摘要〕 目的 探究肺心湯通過調控腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路對低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）大鼠的治療作用及機制。方法 36只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、西地那非組以及肺心湯低、中、高劑量組。除正常組外，將其余5組置于氧氣濃度為10.0%±0.5%的低氧艙內造模28 d，每天8 h，造模同時灌胃給藥。4周后檢測大鼠心肺血流動力學指標[右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），右心室肥厚指數（right ventricular hypertrophy index，RVHI），肺動脈加速時間/肺動脈射血時間（pulmonary acceleration time/pulmonary ejection time，PAT/PET）、三尖瓣環收縮期位移（tricuspid annulus plane systolic excursion，TAPSE）、右心室前壁厚度（right ventricular anterior wall thickness，RVAWT）]；HE染色法檢測肺動脈重塑；免疫熒光法檢測α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白共定位表達；透射電鏡觀察自噬溶酶體的數量；免疫組織化學法檢測肺組織中p-AMPK、p-mTOR、微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）、Beclin1和p62蛋白陽性表達。結果 與正常組相比，模型組大鼠RVSP、RVHI及RVAWT顯著升高（Plt;0.01），PAT/PET和TAPSE顯著降低（P＜0.01）；肺小動脈壁明顯增厚，管腔狹窄，肺小動脈管壁厚度占血管直徑的百分比（the percentage of wall thickness of pulmonary arterioles to vascular diameter， WT%）顯著升高（P＜0.01）；α-SMA和PCNA共定位表達顯著增加；自噬溶酶體數量增加；肺組織中p-AMPK、LC3B和Beclin1蛋白陽性表達上調（P＜0.01），p-mTOR及p62蛋白陽性表達下調（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠RVSP、RVHI及RVAWT 顯著下降（P＜0.01），PAT/PET、TAPSE顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；肺小動脈壁增厚程度減輕，WT%顯著降低（P＜0.01）；α-SMA和PCNA共定位表達減少；自噬溶酶體數量減少；肺組織中p-AMPK、LC3B和Beclin1蛋白陽性表達顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），p-mTOR及p62蛋白陽性表達顯著上調（P＜0.01）。與西地那非組相比，肺心湯低、中劑量組TAPSE降低（P＜0.01）；肺心湯低、中劑量組肺動脈中膜增厚程度增加，WT%增加（P＜0.01）；肺心湯低、中劑量組p-AMPK蛋白陽性表達升高（P＜0.01），肺心湯高劑量組p-AMPK蛋白陽性表達降低（P＜0.05）；肺心湯低劑量組p-mTOR蛋白陽性表達降低（P＜0.01）。結論 肺心湯可能通過下調AMPK/mTOR信號通路抑制自噬，發揮改善HPH的作用。

〔關鍵詞〕 肺心湯；低氧性肺動脈高壓；腺苷酸活化蛋白激酶；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；自噬

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.005

Protective effects of Feixin Decoction on rats with hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting autophagy through regulating AMPK/mTOR signaling pathway

ZHANG Chao1，2， YI Jian2，3， DING Rongzhen1，2， WAN Jiajing1，2， TAN Junlan1，2， WANG Feiying1，2，

ZHOU Lingling1，2， SONG Lan2，5， DAI Aiguo1，2，4*

1. Respiratory Disease Laboratory， School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Vascular Biology and Translational Medicine， Education Department of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Medical Innovation Experiment Center， The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410021， China; 4. Department of Respiratory Medicine， The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410021， China; 5. School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the therapeutic efficacy and mechanism of Feixin Decoction （FXD） on hypoxic pulmonary hypertension （HPH） rats through regulating adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway. Methods Thirty-six SD rats were randomized into control group， model group， sildenafil group and low-， medium-， high-dose FXD groups. Except control group， the remaining five groups were placed in a hypoxic chamber with an oxygen concentration of 10%±0.5% for modeling， 8 hours per day for 28 d， with simultaneous intragastric administration. After 4 weeks， the rat cardiopulmonary hemodynamic indexes [right ventricular systolic pressure （RVSP）， right ventricular hypertrophy index （RVHI）， the ratio of pulmonary acceleration time to pulmonary ejection time （PAT/PET）， tricuspid annulus plane systolic excursion （TAPSE）， right ventricular anterior wall thickness （RVAWT）] were determined. Pulmonary artery remodeling was checked by HE staining; the co-localization of α-smooth muscle actin （α-SMA） and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） was examined by immunofluorescence assay; the number of autolysosomes was observed by transmission electron microscope （TEM）; the positive expressions of p-AMPK， p-mTOR， microtubule-associated protein 1 light chain 3B （LC3B）， Beclin1， and p62 in the lung tissue were measured by immunohistochemical assay. Results Compared with the control group， in the model group， RVSP， RVHI， and RVAWT were significantly increased （Plt;0.01）， while PAT/PET and TAPSE were significantly decreased （Plt;0.01）; the wall of the pulmonary arterioles was markedly thickened and the lumina narrowed， with a significant increase in the percentage of wall thickness of pulmonary arterioles to vascular diameter， WT% （Plt;0.01）; the co-localization of α-SMA and PCNA was significantly enhanced （Plt;0.01）; the number of autolysosomes was increased; the protein positive expressions of p-AMPK， LC3B， and Beclin1 in the lung tissue were up-regulated （Plt;0.01）， while those of p-mTOR and p62 were down-regulated （Plt;0.01）. Compared with the model group， in all medication groups， RVSP， RVHI， and RVAWT were significantly decreased （Plt;0.01）， while PAT/PET and TAPSE were significantly increased （Plt;0.05， Plt;0.01）; the thickness of the pulmonary arterioles was reduced with a significant reduction in WT% （Plt;0.01）; the co-localization of α-SMA and PCNA was significantly reduced; the number of autolysosomes decreased; the protein positive expressions of p-AMPK， LC3B， and Beclin1 in the lung tissue were significantly down-regulated （Plt;0.05， Plt;0.01）， while those of p-mTOR and p62 were significantly up-regulated （Plt;0.01）. Compared with the sildenafil group， TAPSE decreased in the low- and medium-dose FXD groups （Plt;0.01）; the degree of pulmonary arterial intima-media thickening was increased and the WT% was higher in the low- and medium-dose FXD groups （Plt;0.01）; the protein positive expression of p-AMPK was elevated in the low- and medium-dose FXD groups （Plt;0.01）， while that was reduced in the high-dose FXD group （Plt;0.05）; the protein positive expression of p-mTOR was decreased in the low-dose FXD group （Plt;0.01）. Conclusion FXD may play a role in ameliorating hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting autophagy through down-regulation of the AMPK/mTOR signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Feixin Decoction; hypoxic pulmonary hypertension; adenosine monophosphate-activated protein kinase; mamm alian target of rapamycin; autophagy

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種嚴重的肺血管疾病，以肺動脈壓力和肺血管阻力逐漸升高為主要特征，引起肺血管持續性收縮、血管重塑以及右心室肥厚，最終導致右心衰竭和死亡[1]。低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）以肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）異常增殖所致的肺血管重塑為主要病理特征。肺血管重塑的特點是血管內膜/中膜層增厚，主要是由于PASMC的過度增殖、遷移和抗凋亡，造成動脈功能性僵化，導致肺血管血流動力學改變。HPH屬于第三類PH，即低氧或肺部疾病引起的PH[2]。臨床上，HPH尚缺乏有效治療手段，亟待開發新的藥物及靶點。自噬是細胞內受損細胞器和蛋白質降解的生物學過程，主要由溶酶體依賴途徑介導[3]。新近研究表明，肺血管細胞自噬增加可促進肺血管重塑，引起HPH病程演變[4]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是介導自噬的經典信號通路，該通路在HPH嚙齒類動物模型肺組織中顯著激活，并促進PASMC增殖[5]。因此，通過靶向調控AMPK/mTOR信號通路抑制自噬有望成為HPH的有效治療手段。

肺心湯是針對HPH“宗氣虧虛導致的水、痰、瘀互結”這一核心病機所創立的經驗方，且本課題組前期臨床研究已經證實，肺心湯可改善肺心病患者咳嗽、咯痰、氣喘、心悸、氣短、水腫等癥狀[6]。此外，肺心湯能有效改善HPH大鼠肺血管重塑及右心肥厚[7]。因此，結合前期研究基礎，本實驗以慢性低氧復制HPH大鼠模型，探討肺心湯通過調控AMPK/mTOR信號通路對HPH大鼠的治療作用及機制，旨在為肺心湯的臨床應用提供理論與實驗依據。

1 材料

1.1" 動物

36只SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：430727221102935243，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學動物中心，室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，通風，照明晝夜規律，適應性飼養1周，大鼠自由飲水進食。本實驗已通過湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理審批號：ZYFY2021-1008-57。

1.2" 藥液制備

肺心湯由生黃芪（18 g）、白參（6 g）、制附子（4 g）、葶藶子（10 g）、茯苓（15 g）、白術（12 g）、桃仁（10 g）、紅花（10 g）、赤芍（10 g）、車前子（15 g）、麥冬（12 g）、知母（9 g）組成，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》規定，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院龍紅萍副研究員鑒定合格。按傳統水提法濃縮成生藥含量分別為0.585、1.17、2.34 g·mL-1的藥液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3" 藥品與試劑

枸櫞酸西地那非片（輝瑞制藥有限公司，批號：EW4378）；α-SMA抗體、p62抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號依次為BM0002、BA2849）；LC3B抗體、PCNA抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號依次為18725-1-AP、10205-2-AP）；p-AMPK抗體、p-mTOR抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號依次為bs-12972R、bs-3495R）；山羊抗小鼠IgG Hamp;L（HRP）、山羊抗兔IgG Hamp;L（HRP）（英國Abcam公司，批號依次為Ab6789、Ab205718）；電鏡固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1102）。

1.4" 主要儀器

YCP-160D型動物實驗箱（長沙華曉電子科技有限公司）；V702001型小動物麻醉機（美國MIDMARK公司）；MP160型生理信號采集系統（美國Biopac公司），FTH-1918 B-E118型壓力傳感器（美國Transonic公司）；VINNO 6 LAB型B超機（飛依諾科技股份有限公司）；JT-12J型脫水機、JB-L5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；正置熒光顯微鏡（奧林巴斯有限公司）。

2 方法

2.1" 動物分組、造模及給藥

將36只SD大鼠采用隨機數字法分為6組：正常組、模型組、陽性藥物（西地那非）組（0.025 g·kg-1）以及肺心湯低、中、高劑量組（5.85、11.7、23.4 g·kg-1），每組6只。采用常壓間斷缺氧法，構建HPH大鼠模型[8]。通過動態充入N2使艙內氧氣濃度維持在（10%±0.5%），艙內放入鈉石灰和無水氯化鈣吸收艙內二氧化碳和水蒸氣，每天缺氧8 h，持續28 d。以70 kg成人的臨床等效劑量，確定肺心湯低、中、高劑量組大鼠每天給藥劑量依次為5.85、11.7、23.4 g·kg-1（相當于臨床等效劑量的0.5、1、2倍），灌胃體積為10 mL/kg，肺心湯灌胃濃度依次為0.585、1.17、2.34 g·mL-1，其余各組采用灌胃方式給予等體積蒸餾水，在缺氧的同時給予大鼠灌胃，連續干預28 d。

2.2" 超聲心動圖

超聲心動圖是臨床上常用的評估和臨床前診斷PH的工具，肺動脈加速時間/肺動脈射血時間（pulmonary acceleration time/pulmonary ejection time，PAT/PET）主要反映右心室后負荷大小，三尖瓣環收縮期位移（tricuspid annulus plane systolic excursion，TAPSE）反映右心室收縮功能，右心室前壁厚度（right ventricular anterior wall thickness，RVAWT）增厚表示慢性右心功能障礙。造模28 d結束后，將大鼠固定后使用3%異氟烷吸入麻醉。麻醉后，用脫毛膏褪去大鼠胸部的毛，使用經胸超聲心動圖系統測量PAT、PAT/PET、TAPSE、RVAWT。

2.3" 大鼠右心室壓力和右心室肥厚指數測定

右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）是檢測PH金指標[9]，右心室肥厚指數（right ventricular hypertrophy index，RVHI）是評價右心室重構的重要指標[10]，與HPH的嚴重程度呈正相關。超聲心動圖檢測結束后繼續采用異氟烷維持麻醉，將大鼠固定后用剪刀剪開大鼠的右側頸部皮膚，鈍性分離右側頸外靜脈使血管充分暴露，用縫合線結扎遠心端，近心端用顯微剪小心剪一“V”形切口，導管與壓力傳感器連接，經右側頸外靜脈到達上腔靜脈再到右心房，緩慢進入右心室，可見導管有節律的抖動，依據波形調整導管，直至出現典型的右心室波形并穩定后，16導聯生理信號采集系統記錄RVSP并分析。在冷凍臺上迅速解剖肺和心臟，濾紙吸干多余的血液，分別稱量右心室、左心室與室間隔的重量，代入公式：RVHI=右心室/（左心室+室間隔）重量比（RV/LV+S；富爾頓指數），以此作為評估右心室肥厚程度的指標。每組收集3個樣本，放入4%多聚甲醛中固定，其余樣本保存在-80 ℃冰箱中，以備進一步檢測。

2.4" HE染色法檢測肺動脈重塑

經預冷PBS灌流后，分離大鼠肺組織，取左下肺葉，置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并連續切片、HE染色，在顯微鏡下，選擇同一光強度，每張切片隨機選取3個視野，取3條直徑為50～100 μm的肺小動脈，用Image J軟件分析，測量并計算肺小動脈管壁厚度占血管直徑的百分比（the percentage of wall thickness of pulmonary arterioles to vascular diameter， WT%），WT%=（血管外徑-血管內徑）/血管外徑×100%，以評估肺血管重塑程度[10]。

2.5" 免疫熒光法檢測肺組織中α-SMA、PCNA蛋白共表達情況

蠟塊切片，厚度約4 μm，依次脫蠟水化，抗原修復，加入自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，然后滴加BSA封閉30 min。用抗α-SMA（1∶200）和抗PCNA（1∶500）抗體的混合物在4 ℃下染色過夜。孵育后，用PBS沖洗切片，并與用于α-SMA的山羊抗小鼠IgG Hamp;L（HRP）和用于PCNA的山羊抗兔IgG Hamp;L（HRP）避光室溫下孵育50 min。沖洗后，DAPI復染細胞核，最后使用抗熒光淬滅封片劑封片，并在顯微鏡下觀察。

2.6" 透射電鏡檢測肺動脈平滑肌細胞中自噬溶酶體的數量

取新鮮肺組織剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，迅速投入電鏡固定液，4 ℃固定2～4 h，0.1 mol·mL-1磷酸緩沖液PBS（pH=7.4）漂洗3次，1%鋨酸中室溫固定2 h，然后依次進行脫水、滲透、包埋、切片、染色后，透射電鏡下觀察自噬溶酶體形態和數量，采集圖像并分析。

2.7" 免疫組織化學法檢測肺組織中p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1和p62蛋白陽性表達情況

蠟塊切片，厚度約4 μm，依次脫蠟水化，抗原修復，3%過氧化氫去離子水滅活，3% BSA封閉液封閉30 min，加入適量p-AMPK（1∶800）、p-mTOR（1∶800）、LC3B（1∶200）、Beclin1（1∶200）、p62（1∶200）一抗4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。二抗室溫孵育50 min，再次PBS沖洗，滴加DAB顯色液，蘇木素復染細胞核，最后進行梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取3張切片，顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析積分光密度值（IOD）并計算面積（Area），以IOD/Area表示陽性信號表達情況。

2.8" 統計學方法

采用GraphPad Prism 9.0統計軟件對實驗數據進行分析。數據用“ｘ±s”表示，兩組間均數比較采用獨立樣本ｔ檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 肺心湯對HPH大鼠右心室收縮壓和右心室肥厚指數的影響

與正常組比較，模型組大鼠的RVSP及RVHI升高（P＜0.01），表明HPH模型復制成功；與模型組比較，各給藥組大鼠的RVSP均降低（P＜0.01），肺心湯高劑量組RVHI顯著降低（P＜0.01）。詳見圖1、表1。

3.2" 肺心湯對HPH大鼠右心功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠的PAT/PET、TAPSE降低（P＜0.01），RVAWT升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組PAT/PET、TAPSE升高（P＜0.05，P＜0.01），RVAWT降低（P＜0.01）；與西地那非組比較，肺心湯低、中劑量組TAPSE降低（P＜0.01）；與肺心湯低劑量組比較，肺心湯高劑量組PAT/PET、TAPSE升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，對于改善HPH大鼠右心功能，各給藥組均有效，其中肺心湯高劑量組效果最為明顯。詳見圖2、表2。

3.3" 肺心湯對HPH大鼠肺動脈α-SMA和PCNA蛋白共定位的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺動脈平滑肌細胞層PCNA染色增強，α-SMA（綠色）和PCNA（紅色）共定位增強；與模型組比較，各給藥組大鼠肺動脈平滑肌細胞層PCNA染色減少，α-SMA（綠色）和PCNA（紅色）共定位減少。表明肺心湯能夠抑制PASMC增殖。詳見圖3。

3.4" 肺心湯對HPH大鼠肺血管結構的影響

與正常組比較，模型組大鼠的肺組織病理變化明顯，肺動脈中膜增厚及管腔狹窄，WT%顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺動脈中膜增厚程度減輕，WT%顯著降低（P＜0.01）；與西地那非組比較，肺心湯低、中劑量組肺動脈中膜增厚程度增加，WT%增加（P＜0.01）；與肺心湯低劑量組比較，肺心湯高劑量組肺動脈中膜增厚程度減輕，WT%顯著降低（P＜0.01）；與肺心湯中劑量組比較，肺心湯高劑量組肺動脈中膜增厚程度減輕，WT%降低（P＜0.05）。結果表明，肺心湯能明顯抑制HPH大鼠肺動脈中膜增厚，顯著改善大鼠肺血管重構，并呈劑量依賴性。詳見表3、圖4。

3.5" 肺心湯對HPH大鼠PASMC中自噬溶酶體數量的影響

與正常組比較，模型組大鼠PASMC中自噬溶酶體數量明顯增加；與模型組比較，各給藥組大鼠PASMC中自噬溶酶體數量明顯減少。表明各給藥組可抑制PASMC自噬。詳見圖5。

3.6" 肺心湯對HPH大鼠肺組織中p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1和p62蛋白陽性表達水平的影響

p-AMPK陽性表達主要定位于細胞核和細胞漿，p-mTOR陽性表達主要定位于細胞漿，LC3B陽性表達主要定位于細胞漿和部分胞核，Beclin1陽性表達主要定位于細胞膜和細胞漿，p62陽性表達主要定位于細胞漿。與正常組比較，模型組大鼠肺組織中p-AMPK、LC3B、Beclin1蛋白陽性表達均升高（P＜0.01），p-mTOR、p62蛋白陽性表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織中p-AMPK、LC3B、Beclin-1蛋白陽性表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），p-mTOR、p62蛋白陽性表達升高（P＜0.01）；與西地那非組比較，肺心湯低、中劑量組p-AMPK蛋白陽性表達升高（P＜0.01），肺心湯高劑量組p-AMPK蛋白陽性表達降低（P＜0.05）；肺心湯低劑量組p-mTOR蛋白陽性表達降低（P＜0.01）；與肺心湯低劑量組比較，肺心湯中劑量組p-AMPK蛋白陽性表達降低（P＜0.01），肺心湯中、高劑量組p-mTOR蛋白陽性表達升高（P＜0.01），肺心湯高劑量組LC3B蛋白陽性表達降低（P＜0.01）；與肺心湯中劑量組比較，肺心湯高劑量組p-AMPK蛋白陽性表達降低（P＜0.01）。結果表明，肺心湯能下調HPH大鼠肺組織中p-AMPK、LC3B、Beclin1蛋白陽性表達，上調p-mTOR、p62蛋白陽性表達，可能通過調控AMPK/mTOR信號通路，抑制自噬。詳見圖6、表4。

4 討論

中醫藥治療HPH療效確切，且具有多靶點和多途徑等優勢。PH的病因復雜，涉及血管收縮/舒張失衡、基因突變、原位血栓形成、炎癥反應和氧化應激[12]。然而，大多數藥物都強調對一種細胞、一種細胞因子或一種基因的作用，而沒有考慮PH的復雜過程[13]。在復雜疾病的長期治療中，中醫藥其公認的療效引起了越來越多的關注。麻杏芎葶合劑可通過抑制Rho-kinase信號通路，減輕低氧引起的PH，改善右心室肥厚[14]。血府逐瘀湯可通過抑制mTOR信號通路和NF-κB激活相關機制減輕HPH大鼠肺血管重構和右心肥厚[15]。葛根芩連湯可通過多個靶點、多個信號通路，關鍵藥效分子和核心靶點穩定結合來治療PH[16]。HPH歸屬于中醫學“肺脹”“胸痹”范疇，課題組認為HPH多病久體虛，易耗盡主之氣，則肺氣虛衰，致肺失治節，可致心陽虛衰，無力鼓動血運，血液不循常道成瘀，津液代謝失常則聚飲成痰，血瘀、痰濁、水飲交錯蘊結為患，致肺系經脈受阻，絡脈失常，進而凌射心肺發為心肺兩虛、痰瘀互結證。故痰濁和血瘀是貫穿病程始終的兩個重要病理因素。肺心湯由生黃芪、白參、制附子、葶藶子、茯苓、白術、桃仁、紅花、赤芍、車前子、麥冬、知母組成。方中黃芪、白參補元氣、益脾肺，共用為君藥，入脾經培土而生金，共奏健脾益肺之功。制附子溫心陽、補腎陽以扶正；葶藶子瀉肺平喘利水；茯苓、白術健脾化濕利水；桃仁、紅花、赤芍活血祛瘀，均用以為臣。佐以車前子滲濕利水；麥冬甘寒，養陰生津，潤肺止咳，可防溫燥利水太過損傷肺陰；知母清熱生津潤燥，以防制附子溫熱化燥。諸藥合用，共奏補肺化痰祛瘀之效。本實驗結果發現，模型組大鼠RVSP、RVHI、WT%明顯升高，表明HPH模型復制成功。肺心湯給藥治療后，大鼠RVSP、RVHI、WT%明顯降低，表明肺心湯對HPH大鼠有保護作用。

自噬通過自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現某些細胞器的更新和細胞本身的代謝需要。自噬作為一種有助于細胞穩態的重要生物學過程，已經被認為是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）存活的重要介質[17-18]。大量研究[19-21]發現，PH的發展過程中，抑制自噬可以減輕PASMC的增殖，最終改善PH的發展，進一步證實了PASMC的自噬在PH病理生理進展中具有重要作用。

AMPK/mTOR信號通路是調控自噬的重要信號通路之一。AMPK是一種關鍵能量傳感器，是一種由α、β和γ亞基組成的異源三聚體，并且完全激活需要蘇氨酸（Thr-172）位點的磷酸化，AMPKα1的激活刺激細胞自噬，促進PASMC存活[22]。mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能受到氨基酸、能量變化、氧化應激、激素等多種因素的調節，是細胞生長、代謝和衰老的重要調控因子[23]。PCNA在細胞核內形成，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，作為細胞增殖標志物，檢測PCNA的表達可以反應細胞的增殖狀態；α-SMA是PASMC的特異性標志物。本實驗通過對PCNA和α-SMA免疫熒光共定位，結果證實肺心湯可改善HPH大鼠PASMC異常增殖。LC3B作為自噬所必需的關鍵蛋白，可作為自噬的診斷性指標，其表達水平與自噬活性呈正相關[24]。p62作為自噬降解底物，可結合待降解蛋白將其運輸至自噬體中，并隨蛋白一起降解，當自噬被抑制時，p62會在細胞質中累積[25]，Beclin1為自噬啟動蛋白，也是自噬體形成的關鍵蛋白，其表達強度與自噬活性呈正相關[26]。研究表明，低氧可顯著上調大鼠PASMC自噬水平，上調PASMC中p-AMPK和LCB-Ⅱ蛋白表達水平，下調p-mTOR和p62蛋白表達水平[27]。本實驗中，HPH模型大鼠肺組織中p-AMPK、LC3B和Beclin1蛋白表達水平與正常組比較均明顯上調，而p-mTOR和p62蛋白表達水平下調，表明模型組自噬激活，與研究報道結果相一致。與模型組比較，肺心湯可下調大鼠肺組織中p-AMPK、LCB和Beclin1蛋白表達水平，上調p-mTOR和p62蛋白表達水平，提示AMPK/mTOR信號通路上調PASMC自噬可能是HPH發生發展時肺血管重構的誘因之一，肺心湯可能通過抑制AMPK/mTOR信號通路下調PASMC自噬，從而抑制 PASMC增殖，改善HPH的發生發展。目前，針對PH的藥物治療主要是聯合應用靶向治療血管內皮紊亂的特異性藥物[1，28-29]。然而，這些療法不能逆轉疾病，并且有一些不良反應。因此，新的藥物干預對于HPH患者的治療非常重要。本研究表明，肺心湯可以改善血流動力學參數、肺血管重塑和右心室功能。因此，肺心湯有望成為新一代治療HPH的藥物。然而，本研究存在一定的不足，需要體外細胞實驗進一步證實其作用機制。

綜上所述，肺心湯可能通過調控AMPK/mTOR信號通路抑制PASMC自噬，從而改善肺血管重塑，延緩HPH疾病進程，其更深層次的機制仍有待闡明。

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（本文編輯" 蘇" 維）

〔收稿日期〕2023-12-21

〔基金項目〕國家自然科學基金面上項目（82370069，82200066）；國家自然科學基金青年項目（82305214）；湖南省自然科學基金項目（2021JJ30017，

2022JJ40308）；中國博士后科學基金面上項目（2021M690982）；湖南省中醫藥科研計劃重點項目（C2022001）；湖南省研究生科研創新項目（2022CX196）。

〔通信作者〕*戴愛國，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：daiaguo@hnucm.edu.cn。