理沖湯對卵巢癌荷瘤小鼠的免疫調節及抗腫瘤作用

〔摘要〕 目的 探討理沖湯對卵巢癌荷瘤小鼠的免疫調節及抗腫瘤作用。方法 按隨機數字表法將48只C57BL/6雌性小鼠隨機分為空白組8只和造模組40只。采用腋下注射ID8細胞方法制備卵巢癌荷瘤小鼠模型。造模成功的40只小鼠隨機分為模型組、紫杉醇組[10 mg/（kg·3 d）]、理沖湯低劑量組[17.89 g/（kg·d）]、理沖湯中劑量組[35.78 g/（kg·d）]和理沖湯高劑量組[71.56 g/（kg·d）]，每組8只。空白組及模型組灌胃蒸餾水[10 mL/（kg·d）]。每組干預21 d。計算抑瘤率及臟器指數，HE染色觀察腫瘤組織病理形態變化；流式細胞術檢測脾臟中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）細胞亞群比例；流式微球陣列技術檢測血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平；免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Wnt家族成員-1（Wnt family member-1，Wnt-1）、β-連環蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白細胞分化抗原4（cluster of differentiation 4，CD4）、白細胞分化抗原8（cluster of differentiation 8，CD8）蛋白表達水平；RT-PCR法檢測腫瘤組織Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、叉頭蛋白P3（forkheadbox protein 3，Foxp3）mRNA表達水平。結果 與空白組比較，模型組脾臟指數及血清中TNF-α、IL-2水平顯著降低（P＜0.01），血清中IL-6、IL-10水平及脾臟中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，理沖湯各劑量組脾臟指數升高（P＜0.05，P＜0.01），各治療組腫瘤指數顯著降低（P＜0.01）。模型組小鼠腫瘤組織病理形態學病變顯著，各治療組干預后均有一定程度改善。與模型組比較，各治療組脾臟中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例及血清IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；紫杉醇組和理沖湯中劑量組TNF-α水平升高（P＜0.05）；理沖湯高劑量組TNF-α、IL-2水平升高（P＜0.01），IL-6水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，理沖湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β、CD4蛋白的表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Wnt-1、MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；理沖湯中、高劑量組CD8蛋白表達顯著升高（P＜0.01），β-catenin蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，各治療組GSK-3β mRNA表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01），Wnt-1、β-catenin、Foxp3 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。結論 理沖湯具有抑制卵巢癌荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，該作用可能與降低CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例，提高機體免疫，調節Wnt/β-catenin信號通路有關。

〔關鍵詞〕 理沖湯；卵巢癌；Wnt/β-catenin通路；腫瘤微環境；免疫逃逸；調節性T細胞

〔中圖分類號〕R271" " " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.006

Immunomodulatory and anti-tumor effects of Lichong Decoction on ovarian cancer-bearing mice

ZHOU Jinhong1， WU Xiaolan1， ZHANG Jiaheng1， LI Yueheng2， DU Yu2， LIU Qiying3*， LIU Huiping1，4*

1. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China; 3. Changsha Hospital for Maternal amp; Child Health Care， Changsha， Hunan 410007， China; 4. School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the immunomodulatory and anti-tumor effects of Lichong Decoction （LCD） on ovarian cancer-bearing mice. Methods Forty-eight C57BL/6 female mice were randomized into blank group （n=8） and modeling group （n=40） by random number table method， and the ovarian cancer-bearing mouse model was prepared by subaxillary injection of ID8 cells. Forty mice with successful modeling were randomly subdivided into model group， paclitaxel group [10 mg/（kg·3d）]，" low-， medium-， and high-dose [17.89 g/（kg·d）， 35.78 g/（kg·d）， 71.56 g/（kg·d）] LCD groups， with eight mice in each group. The blank group and model group were given distilled water [10 mL/（kg·d）]， and each group was intervened for 21 d. The tumor inhibition rate and organ indexes were calculated; HE staining was used to observe histopathological and morphological changes in tumor tissue; the proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell （Treg） subpopulations in spleen was checked by flow cytometry， Cytometric Bead Array （CBA） was used to determine the serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-2 （IL-2）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-10 （IL-10）; immunohistochemistry was performed to examine the protein expression levels of Wnt family member 1 （Wnt1）， β-catenin， glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β）， matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， cluster of differentiation 4 （CD4）， and cluster of differentiation 8 （CD8）; the mRNA expression levels of Wnt-1， β-catenin， GSK-3β， and forkheadbox protein 3 （Foxp3） were determined by RT-PCR. Results Compared with the blank group， both the spleen index and the serum levels of TNF-α and IL-2 in the model group were significantly lower （Plt;0.01）， while the proportion of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cell subpopulations in the spleen and the serum levels of IL-6 and IL-10 were significantly higher （Plt;0.01）. Compared with the model group， the spleen index in each dose of LCD group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）， the tumor index in each treatment group significantly reduced （Plt;0.01）， and the histopathological and morphological lesions in tumor tissue of the model group were significant， and there were variable degrees of improvement in all treatment groups after intervention. Compared with the model group， the proportion of CD4+CD25+Foxp3+ Treg subpopulations in the spleen and the serum level of IL-10 were significantly reduced in each treatment group （Plt;0.01）， the TNF-α level in the paclitaxel and medium-dose LCD groups increased （Plt;0.05）， and the serum levels of TNF-α and IL-2 in high-dose LCD group increased （Plt;0.01）， while the IL-6 level decreased （Plt;0.05）. Compared with the model group， the protein expressions of GSK-3β and CD4 in tumor tissue of mice in each dose of LCD group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）， the protein expressions of Wnt-1 and MMP-9 decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）， and the CD8 protein expression in the medium- and high-dose LCD groups significantly increased （Plt;0.05， Plt;0.01）， while β-catenin protein expression reduced （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the GSK-3β mRNA expression level in each treatment group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）， while the mRNA expression levels of Wnt-1， β-catenin， and Foxp3 decreased （Plt;0.01）. Conclusion Lichong Decoction can inhibit tumor growth in ovarian cancer-bearing mice， which may be related to reducing the proportion of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cell subpopulations， improving immunity， and regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Lichong Decoction; ovarian cancer; Wnt/β-catenin pathway; tumor microenvironment; immune escape; regulatory T cell

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是全球女性的第三大威脅性惡性腫瘤，可發生于任何年齡，早期病變隱匿，患者常缺乏特異性的癥狀，晚期常缺乏有效的治療手段，嚴重危害婦女健康[1]。據2023年美國癌癥統計數據顯示，OC是繼子宮體癌之后發病率排名第2位的生殖系統腫瘤，也是排名第2位的女性致死性腫瘤，死亡率僅次于乳腺癌[2]。我國OC總體發病率與死亡率呈上升趨勢[3]，晚期OC患者平均5年生存率低于30%[4]。目前，臨床上以根治性手術為主，同時采用化學治療、放射治療OC，然而這些治療手段可能會降低患者的免疫功能，所以尋找安全有效的腫瘤治療藥物已成為OC研究中的熱點和難點。

理沖湯出自清代著名醫家張錫純的《醫學衷中參西錄·治女科方》，由黃芪、黨參、三棱、莪術等9味中藥組成，具有健脾補氣、化瘀消癥的功效。理沖湯在臨床上常用于治療子宮肌瘤、宮頸癌、OC等多種疾病，且臨床療效顯著[5-7]。實驗研究表明，理沖湯對癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且可以促進其凋亡[8-10]。因此，本實驗建立OC荷瘤小鼠模型，并用理沖湯進行干預，通過動物實驗研究，觀察理沖湯對OC荷瘤小鼠的免疫調節作用，并探討其可能的通路，為中醫藥治療OC提供實驗依據。

1 材料

1.1" 實驗動物

48只健康C57BL/6雌性小鼠，SPF級，6～8周齡，體質量（18±2） g。所有小鼠均委托湖南中醫藥大學實驗動物中心購買，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（湘）2019-0009]。飼養環境恒溫恒濕，室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，光照12 h，予標準動物飼料喂養，自由飲水。本實驗所有操作均經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：LL2022061204）。

1.2" 實驗細胞

鼠源OC的細胞株ID8（浙江美森細胞科技有限公司，批號：CTCC-003-0111）。

1.3" 藥物

理沖湯（黃芪9 g、黨參6 g、白術6 g、山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術9 g、雞內金9 g）藥材購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。將上述飲片，加入10倍量的蒸餾水浸泡30 min，煮沸后再煎煮30 min，過濾取出藥液。然后將殘渣加蒸餾水1.5 L，再煎20 min之后過濾取出藥液，將兩次所得藥液混勻合并，在70 ℃水浴鍋上蒸發濃縮。紫杉醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：P106869，規格250 mg）。

1.4" 主要試劑及儀器

FITC標記抗小鼠白細胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）3抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）/Cyanine7標記抗小鼠CD4抗體、別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標記抗小鼠CD25抗體、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）/Cyanine5.5標記抗小鼠CD45抗體、PE標記抗小鼠叉頭蛋白P3（forkheadbox protein 3，Foxp3）抗體、LEGENDPlexTM多因子流式檢測試劑盒（美國BioLegend公司，批號分別為100203、103131、102011、100527、126403、741050）；Wnt家族成員-1（Wnt family member-1，Wnt-1）抗體、β-連環蛋白（β-Catenin）抗體、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抗體、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體（武漢三鷹生物技術公司，批號分別為27935-1-AP、51067-2-AP、21112-1-AP、10375-2-AP）；CD4抗體、CD8抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為bs-0647R、bs-0648R）；HRP標記山羊抗兔IgG抗體（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：BL003A）。

Spark型多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州安泰公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；HERAcell 150i型CO2培養箱（美國Thermo公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；RM2235型切片機、HI1210型攤片機、DMLB2型雙目顯微鏡（德國Leica公司）；Motic BA410型生物顯微鏡（德國麥克奧迪實業集團公司）；cyto FLEX型流式細胞儀（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1" 細胞培養及動物造模

ID8細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基常規培養于37 ℃、含5% CO2的孵育箱中。將ID8細胞培養至對數生長期，并用PBS將密度調整為5×107個/mL。小鼠右側腋下常規消毒后，接種單細胞懸液0.1 mL/只，若1周左右瘤體體積達到30 mm3，提示造模成功[11]；空白組小鼠于右側腋下注射0.1 mL生理鹽水。

2.2" 動物分組及給藥

采用隨機數字表法將48只C57BL/6雌性小鼠隨機分8只作為空白組[10 mL/（kg·d），蒸餾水，灌胃]，其余40只為造模組。將造模成功的小鼠隨機分為模型組[10 mL/（kg·d），蒸餾水，灌胃]、紫杉醇組[10 mg/（kg·3 d），腹腔注射][12]、理沖湯低劑量組[17.89 g/（kg·d），灌胃]、理沖湯中劑量組[35.78 g/（kg·d），灌胃]、理沖湯高劑量組[71.56 g/（kg·d），灌胃]，其中低劑量是小鼠與60 kg成人臨床用量等效劑量，中劑量和高劑量分別為等效劑量的2倍與4倍[13]。每組干預21 d。

2.3" 抑瘤率及臟器指數計算

處死小鼠后摘除腫瘤及脾臟組織，稱重記錄。抑瘤率=（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%。臟器指數（mg/g）=臟器質量（mg）/小鼠體質量（g）。

2.4" 流式微球陣列技術檢測小鼠血清中細胞因子含量

末次給藥12 h后，小鼠眼球取血，分離血清，凍存備用。嚴格按照LEGENDPlexTM多因子流式檢測試劑盒說明書檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）含量。

2.5" HE染色觀察腫瘤組織病理變化

將各組小鼠1/2的瘤體組織固定于4%多聚甲醛中12～24 h，石蠟包埋，切成3～4 μm的切片。常規脫水后，進行HE染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察。

2.6" 流式細胞術檢測小鼠脾臟淋巴細胞亞群CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例

取出小鼠脾臟置于1×PBS中，研磨脾臟，使細胞散于PBS中。用300目濾網過濾，以1 500 r/min離心5 min（離心半徑20 cm），棄上清液。每份組織用500 μL紅細胞裂解液，吹打渦旋后靜置10 min。裂解反應結束后，以3 000 r/min離心5 min（離心半徑20 cm），棄上清液。PBS洗滌，細胞計數，調整濃度為1×107個/mL。取100 μL細胞液，將樣本移至V底板中進行染色，加入FITC標記抗小鼠CD3、PE/Cyanine7標記抗小鼠CD4、APC標記抗小鼠CD25、PerCP/Cyanine5.5標記抗小鼠CD45抗體，混勻后，室溫孵育15～20 min。每孔加入200 μL Foxp3固定/破膜工作液，室溫孵育30～60 min，以800 r/min離心5 min（離心半徑20 cm），棄上清液。用1×破膜液將體積調節至約100 μL，不洗滌，加入PE標記抗小鼠Foxp3抗體，室溫避光孵育30 min以上。加入200 μL

1×破膜液，在室溫下以800 r/min離心5 min（離心半徑20 cm），棄上清液。用至少0.5 mL細胞染色緩沖液重懸染色后的細胞，上機檢測分析。

2.7" 免疫組織化學法檢測瘤組織中Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、MMP-9、CD4、CD8蛋白表達水平

4%多聚甲醛固定瘤組織，常規石蠟包埋、切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，檸檬酸抗原修復液修復抗原，PBS洗滌5 min×3次，切片放入3%過氧化氫溶液中室溫避光孵育25 min，BSA室溫封閉30 min，分別滴加一抗Wnt-1（1∶200）、β-catenin（1∶1 000）、GSK-3β（1∶200）、MMP-9（1∶200）、CD4（1∶200）、CD8（1∶200），4 ℃濕盒內孵育過夜。第2天PBS洗滌5 min×3次，加相應二抗HRP標記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育50 min，DAB顯色后蘇木素復染，脫水、封片，顯微鏡觀察，Image J軟件進行圖像分析。

2.8" RT-PCR法檢測小鼠腫瘤組織Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、Foxp3 mRNA 表達水平

采用總RNA提取試劑盒提取腫瘤組織RNA，測定純度和濃度后逆轉錄合成cDNA，并進行RT-PCR檢測，反應條件為95 ℃反應1 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環45次。以GAPDH為內參，運用2-？葒？葒Ct法計算Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、Foxp3 mRNA相對表達水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

2.9" 統計學分析

采用SPSS 26.0統計軟件進行分析。所有實驗數據均采用“ｘ±s”形式表示。多組計量資料先進行方差齊性分析，若符合方差齊性，則各組間數據采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；若不符合方差齊性，則采用非參數秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 理沖湯對荷瘤小鼠的抑瘤作用

與模型組比較，各治療組瘤體質量顯著減輕（P＜0.01）。與紫杉醇組比較，理沖湯低、中劑量組瘤體質量升高（P＜0.05，P＜0.01），抑瘤率降低（P＜0.05，P＜0.01）；理沖湯高劑量組瘤體質量顯著降低（P＜0.01），抑瘤率顯著升高（P＜0.01）。與理沖湯低、中劑量組比較，理沖湯高劑量組瘤體質量顯著降低（P＜0.01），抑瘤率顯著升高（P＜0.01）。詳見圖1、表2。

3.2" 理沖湯對荷瘤小鼠臟器指數的影響

與空白組比較，模型組的脾臟指數明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，理沖湯各劑量組脾臟指數升高（P＜0.05， P＜0.01），各治療組腫瘤指數顯著降低（P＜0.01）；與紫杉醇組比較，理沖湯中、高劑量組脾臟指數升高（P＜0.05， P＜0.01），理沖湯低、中劑量組腫瘤指數顯著升高（P＜0.01），理沖湯高劑量組腫瘤指數顯著降低（P＜0.01）；與理沖湯低、中劑量組比較，理沖湯高劑量組腫瘤指數顯著降低（P＜0.01）。詳見表3。

3.3" 理沖湯對荷瘤小鼠血清中細胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組的血清TNF-α、IL-2水平顯著降低（P＜0.01），IL-6、IL-10水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組的血清IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；紫杉醇組和理沖湯中劑量組TNF-α水平升高（P＜0.05）；理沖湯高劑量組TNF-α、IL-2水平顯著升高（P＜0.01），IL-6水平降低（P＜0.05）。與紫杉醇組，理沖湯低、中劑量組比較；理沖湯高劑量組TNF-α、IL-2水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表4。

3.4" 理沖湯對荷瘤小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞亞群的影響

與空白組比較，其余各組CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例均顯著降低（P＜0.01）；與紫杉醇組、理沖湯低劑量組比較，理沖湯中、高劑量組CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例顯著降低（P＜0.01）；與理沖湯中劑量組比較，理沖湯高劑量組CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例顯著降低（P＜0.01）。詳見表5、圖2。

3.5" 理沖湯對荷瘤小鼠腫瘤組織病理變化的影響

模型組腫瘤組織細胞增殖旺盛，排列緊密，大小不一，未見明顯腫瘤壞死灶。各治療組均可觀察到腫瘤細胞的減少，細胞核出現變形和破碎，甚至部分細胞核發生裂解，呈現不同程度的腫瘤壞死灶。詳見圖3。

3.6" 理沖湯對荷瘤小鼠腫瘤組織中的Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、MMP-9、CD4和CD8蛋白表達的影響

與模型組比較，理沖湯各劑量組GSK-3β、CD4蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Wnt-1、MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），理沖湯中、高劑量組CD8蛋白表達升高（P＜0.01），β-catenin蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。與紫杉醇組比較，理沖湯各劑量組MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；理沖湯中、高劑量組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；理沖湯高劑量組GSK-3β、CD4、CD8蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。與理沖湯低劑量組比較，理沖湯中劑量組β-catenin蛋白表達顯著降低（P＜0.01），CD4蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；理沖湯高劑量組β-catenin、MMP-9蛋白表達顯著降低（P＜0.01），CD4、CD8蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。詳見表6、圖4。

3.7" 理沖湯對小鼠腫瘤組織Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、Foxp3 mRNA表達的影響

與模型組比較，各治療組Wnt-1、β-catenin、Foxp3 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），GSK-3β表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。與紫杉醇組比較，理沖湯中、高劑量組GSK-3β mRNA表達顯著升高（P＜0.01），β-catenin、Foxp3 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；理沖湯低劑量組GSK-3β mRNA表達降低（P＜0.05），β-catenin、Wnt-1 mRNA表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；理沖湯高劑量組Wnt-1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）。與理沖湯低劑量組比較，理沖湯中、高劑量組Wnt-1、β-catenin、Foxp3 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），GSK-3β mRNA表達顯著升高（P＜0.01）。與理沖湯中劑量組比較，理沖湯高劑量組Wnt-1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）。詳見表7。

4 討論

OC屬于中醫學“癥瘕”“腸覃”“積聚”等范疇。OC為本虛標實證，臟腑氣血虛弱為本，瘀血、濕毒、痰飲、濕濁為標，日久氣滯血結或痰濕凝聚，或濕（熱）毒壅滯，與血相搏，而致“癌濁”[14]。目前，中醫藥在治療OC中得到了廣泛應用，且有數據表明中醫藥輔助治療OC有明顯積極治療作用，如降低OC患者術后化學治療的不良反應，緩解化學治療后的不適癥狀，提高患者機體的免疫力，延長生存時間等[15]。

理沖湯由黃芪、黨參、白術、山藥、天花粉、知母、三棱、莪術和雞內金組成，方中三棱、莪術為君藥，活血化瘀、破氣消積；黃芪、黨參、白術為臣，護脾胃之元氣，君臣為伍，則補而不滯、祛瘀而不傷正；以山藥、知母、天花粉、雞內金為佐使藥，健脾消積、益氣行血。全方配伍“補而不滯，攻而不峻，寓攻于補”，共奏健脾補氣、化瘀消癥之功，為治療婦人癥瘕的臨床常用方。本研究建立ID8 OC荷瘤小鼠模型，經理沖湯干預后，各劑量組小鼠瘤體質量及腫瘤指數降低、抑瘤率升高，其中理沖湯高劑量組對小鼠腫瘤生長的抑制作用最為顯著，提示理沖湯具有抑制OC荷瘤小鼠腫瘤生長的作用。

免疫逃逸是指腫瘤細胞采取各種手段逃避免疫系統的識別和攻擊，從而在體內得以生存和增殖的現象[16]。Treg屬于具有調節免疫功能的CD4+ T細胞亞群，其經典表型為CD4+CD25+Foxp3+，在腫瘤微環境中，Treg可被傳統T細胞誘導分化，具有較強的免疫抑制功能，以促進腫瘤的發生發展，是介導免疫逃逸的關鍵T細胞亞群之一[17]。Treg通過釋放抑制性細胞因子，如IL-10、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），或通過細胞與細胞之間的直接接觸，從而抑制其他免疫細胞的活性，保持免疫耐受[18]；或通過靶向IL-2和CD25消耗Treg，發揮抗腫瘤作用[19]。田璐等[20]研究顯示，扶正抗癌湯可以提高OC荷瘤大鼠血清中TNF-α、IL-2水平及CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T細胞比例，改善機體免疫功能，進而抑制腫瘤生長，發揮抗腫瘤作用。本研究中，理沖湯高劑量組可降低小鼠血清IL-6、IL-10水平，降低脾臟中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例及腫瘤組織中MMP-9蛋白及Foxp3 mRNA水平，提高小鼠脾臟指數，血清TNF-α、IL-2水平及腫瘤組織CD4、CD8蛋白的表達。提示理沖湯可能通過調節免疫細胞比例降低免疫抑制因子分泌水平，增強機體抗腫瘤免疫應答反應，從而減少腫瘤細胞免疫逃逸，抑制OC荷瘤小鼠腫瘤生長。

Wnt/β-catenin連環蛋白通路，又稱Wnt經典信號通路，已被確定為與免疫逃逸相關的最重要的致癌信號通路之一[21-23]。Wnt/β-catenin信號通路在非激活狀態下，細胞內的β-catenin主要位于細胞膜附近；在激活狀態下，Wnt蛋白通過結合細胞表面的受體卷曲蛋白和核心受體脂蛋白受體相關蛋白5/6來啟動信號傳導，抑制GSK-3β酶活性，阻止β-catenin的降解。未降解的β-catenin在細胞內逐漸積累并進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子結合，調節多個基因的轉錄，進而通過影響細胞的增殖、分化、炎癥免疫等促進腫瘤的發生和發展[24-25]。研究表明，癌細胞釋放的Wnt配體可以誘導樹突狀細胞的經典Wnt信號通路，導致IL-10分泌增加，白細胞介素-12產生受限，吲哚胺2，3-雙加氧酶上調，有助于Treg的產生和隨后細胞毒性淋巴細胞活性的抑制[26]。抑制Wnt/β-catenin通路可增強OC的抗腫瘤免疫力[27]。朱文雄等[28]研究顯示，益腎通癃顆粒可下調人前列腺癌PC3細胞荷瘤裸鼠Wnt-1、β-catenin 蛋白及mRNA的表達，上調GSK-3β蛋白及mRNA的表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路，發揮抗腫瘤作用。本研究中，理沖湯各劑量組腫瘤組織GSK-3β蛋白及mRNA表達升高，Wnt-1、β-catenin蛋白及mRNA表達降低，提示理沖湯可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路的表達抑制腫瘤生長及腫瘤細胞的免疫逃逸。

綜上所述，理沖湯具有抑制OC荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，該作用可能與降低CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞亞群比例，提高機體免疫，調節Wnt/β-catenin信號通路有關。

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（本文編輯" 田夢妍）

〔收稿日期〕2024-02-08

〔基金項目〕湖南省自然科學基金項目（2022JJ30035）；湖南省中醫藥科研計劃項目（D2022039）；湖南省衛生健康委員會科研項目重點指導項目（202305017379）；長沙市自然科學基金項目（kq2202038）；湖南省高校中醫腫瘤重點實驗室；湖南省研究生創新基金項目（CX20220784）；湖南中醫藥大學研究生創新項目（2023CX28，2023CX107）；國家級大學生創新創業計劃訓練項目（S202310541063）；湖南省大學生創新創業計劃訓練項目（S202310541063）。

〔通信作者〕*劉慧萍，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：1074983953@qq.com；劉奇英，女，碩士，副主任醫師，E-mail：2843403653@qq.com。