羥基積雪草酸對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響

〔摘要〕 目的 探討羥基積雪草酸（madecassic acid，MA）對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響。方法 將MCF-7細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、不同濃度的MA（80、100、120、140、160 μmol/L）組、不同濃度的他莫昔芬（10、20、30、40、50、35 μmol/L）組，干預(yù)24、36、48 h。初步確定MA發(fā)揮抗乳腺癌作用的最佳濃度和最佳時(shí)間后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算相應(yīng)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；JC-1熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位變化；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖蛋白細(xì)胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、自噬蛋白芐氯素-1（Beclin-1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ/Ⅰ（microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ/Ι，LC3Ⅱ/Ι）、螯合體1（protein 62，p62）的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。透射電鏡檢測(cè)自噬小體。結(jié)果 發(fā)揮抗腫瘤作用的他莫昔芬最佳濃度為35 μmol/L，MA最佳濃度為140 μmol/L，最佳時(shí)間均為48 h。與陰性對(duì)照組相比，MA140 μmol/L組和他莫昔芬35 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞熒光相對(duì)強(qiáng)度以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；PCNA、P62蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。與MA 140 μmol/L組相比，他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞熒光相對(duì)強(qiáng)度以及Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。陰性對(duì)照組MCF-7細(xì)胞膜完整，核膜清晰，細(xì)胞形態(tài)良好；MA 140 μmol/L組細(xì)胞膜、細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，線(xiàn)粒體基質(zhì)密度較高、嵴擴(kuò)張，可見(jiàn)自噬小體；他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞膜局部溶解、破損，可見(jiàn)雙核仁，線(xiàn)粒體腫脹、基質(zhì)溶解，可見(jiàn)自噬小體。結(jié)論 MA可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。

〔關(guān)鍵詞〕 乳腺癌；羥基積雪草酸；增殖；凋亡；自噬；MCF-7細(xì)胞

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R271" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.008

Effects of madecassic acid on proliferation， apoptosis， and autophagy of breast cancer MCF-7 cells

XIE Zhuzhu1， YANG Kehong1， FENG Wenjing1， ZOU Pan2， QIAN Rongkang3， QIAN Ronghua1*

1. School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Key Laboratory of Vascular Biology and Translational Medicine of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guilin， Guangxi 541002， China; 3. Qian Rongkang Clinic， Loudi， Hunan 417700， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of madecassic acid （MA） on the proliferation， apoptosis， and autophagy of breast cancer MCF-7 cells. Methods MCF-7 cells were assigned into negative control group， MA （80， 100， 120， 140， 160 μmol/L） groups with different concentrations， and tamoxifen （10， 20， 30， 40， 50， 35 μmol/L） groups with different concentrations， and they were treated for 24， 36， and 48 h respectively. After the optimal concentration and time of MA anti-breast cancer effect were preliminarily determined， the cell viability was checked by MTT， and the corresponding half maximal inhibitory concentration （IC50） value was calculated. Flow cytometry was taken to detect apoptosis. JC-1 fluorescent probe was applied to check mitochondrial membrane potential changes. Western blot was used to determine the relative expression levels of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， autophagy protein Beclin-1， microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ （LC3Ⅱ/Ⅰ）， and chelate 1 （protein 62， p62）. Transmission electron microscopy was used to detect autophagosomes. Results The optimal concentration of tamoxifen and MA were 35 μmol/L and 140 μmol/L respectively， and the optimal time was 48 h. Compared with the negative control group， the apoptosis rate， fluorescence relative intensity， and relative expression levels of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin-1 protein in the MA 140 μmol/L group and tamoxifen 35 μmol/L group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）， and the relative expression levels of PCNA and p62 decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the MA 140 μmol/L group， the apoptosis rate， fluorescence relative intensity， and relative expression level of Beclin-1 protein in the tamoxifen 35 μmol/L group were significantly higher （Plt;0.01）， and the relative expression level of PCNA protein was significantly lower （Plt;0.01）. In the negative control group， the cell membrane of MCF-7 was intact， the nuclear membrane was clear， and the cell morphology was good; the cell membrane and nuclear morphology of the MA 140 μmol/L group were irregular， the mitochondrial matrix density was high， the ridge was expanded， and autophagosomes were visible; and the cell membrane of the tamoxifen 35 μmol/L group was partially dissolved and damaged， mitochondrial were swelling， matrix lysis was seen， and the double nucleoli and autophagosomes were visible. Conclusion MA can inhibit the proliferation of breast cancer MCF-7 cells and induce cell apoptosis and autophagy.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 breast cancer; madecassic acid; proliferation; apoptosis; autophagy; MCF-7 cells

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年中國(guó)女性乳腺癌新增病例數(shù)約42萬(wàn)，死亡例數(shù)約12萬(wàn)[1]。臨床上治療乳腺癌的方法包括乳腺癌根治術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等[2]，但也存在較大的不良反應(yīng)，患者預(yù)后不理想。細(xì)胞自噬在腫瘤中發(fā)揮雙重作用，受腫瘤分期、突變和細(xì)胞環(huán)境的影響[3]。細(xì)胞凋亡是對(duì)刺激、感染或損傷等正常生理細(xì)胞的死亡反應(yīng)，主要由胱天蛋白酶家族、線(xiàn)粒體途徑和死亡受體誘導(dǎo)配體途徑調(diào)控[4]。他莫昔芬是一種非甾體抗雌激素藥物，其結(jié)構(gòu)式與雌激素相似，可與雌二醇爭(zhēng)奪雌激素受體，從而抑制雌激素的作用[5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥基于整體辨證觀(guān)治療乳腺癌有著獨(dú)特的作用，如可以改善患者臨床癥狀、降低患者臟器毒性，提高患者生活質(zhì)量等[5-6]。石見(jiàn)穿含有多種活性成分，如中藥單體熊果酸[7]、齊墩果酸[8]、五味子甲素[9]及羥基積雪草酸（madecassic acid，MA）[10]。MA分子式為C30H48O6，相對(duì)分子質(zhì)量為504.7[11]。已有研究表明，MA具有鎮(zhèn)痛[12]、抗氧化[13]、預(yù)防急性肺損傷[14]、抑制骨破壞[15]等藥理作用。課題組前期已證實(shí)，中藥石見(jiàn)穿能通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、促使乳腺癌細(xì)胞凋亡起到抗乳腺癌的作用[16-17]。本研究從細(xì)胞增殖、凋亡和自噬方面對(duì)MA抗乳腺癌的作用進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1" 細(xì)胞株

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由課題組傳代培養(yǎng)。

1.2" 主要試劑與藥物

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50 mL瓶裝特級(jí)胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（含酚紅）、無(wú)血清非程序凍存液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)分別為PM150110、164210-50、PB180120、PB180226、PB180438-100）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0010、P0012A）；RIPA裂解液（強(qiáng)）、膜聯(lián)蛋白V-FITC/P細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β-actin（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為G2002、G1511、GC203002、GB15003）；線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-CK-A301）；兔抗細(xì)胞增殖蛋白細(xì)胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、自噬蛋白芐氯素-1（Beclin-1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ（microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ/Ι，LC3Ⅱ/Ι）、螯合體1（protein 62，p62）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為60097-1-Ig、18420-1-AP、11306-1-AP、14600-1-AP）；他莫昔芬粉劑標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)MCE公司，批號(hào)：HY-13757A）；MA粉劑標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20970）；山羊抗兔二抗（長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司，批號(hào)：AWS0002a）。

1.3" 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：il60）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：Eppendor5810R）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，型號(hào)：SPARK）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：ChemiDocXRS+）；干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：MK200-2）；臺(tái)式恒溫振蕩器（美國(guó)Crystal Technology and Industries公司，型號(hào)：IS-RDD3）；倒置顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司，型號(hào)：Axio Vert.A1）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1" 藥物制備

MA加入396 μL DMSO溶解，制備成100 mmol/L的儲(chǔ)備液；他莫昔芬粉劑加入20 mL DMSO溶解，制備成67.29 mmol/L的儲(chǔ)備液。藥物分裝避光保存于-80 ℃冰箱，配藥時(shí)用1640完全培養(yǎng)基稀釋。

2.2" 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱設(shè)置參數(shù)為5% CO2、37 ℃。

2.3" MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，96孔板每孔細(xì)胞密度為4 000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為：陰性對(duì)照組、不同濃度的MA（80、100、120、140、160 μmol/L）組、不同濃度的他莫昔芬（10、20、30、40、50 μmol/L）組。

細(xì)胞貼壁后，空白孔只加200 μL的1640完全培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組加入200 μL的MCF-7細(xì)胞懸液，各藥物組加入相應(yīng)的200 μL藥液，干預(yù)24、36、48 h后，加入50 μL MTT，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄上清液，加入150 μL DMSO，490 nm處檢測(cè)OD值。細(xì)胞增殖率=（各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白孔OD值）×100%。采用軟件Graphpad Prism 8.0計(jì)算相應(yīng)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

2.4" 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，均勻種在小皿中，將細(xì)胞分為3組：陰性對(duì)照組、MA 140 μmol/L組、他莫昔芬35 μmol/L組，藥物干預(yù)48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化重懸細(xì)胞，以1 000 r/min離心3 min（離心半徑9 cm）。

PBS清洗2次，按照試劑盒說(shuō)明，1×Binding buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，各孔加入5 μL AnncxinV-FITC和PI染料，避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)，雙熒光細(xì)胞分析儀軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5" JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)細(xì)胞凋亡

相同方法處理細(xì)胞后，均勻種在6孔板中，藥物分組同“2.4”，藥物干預(yù)48 h后，按照試劑盒說(shuō)明，先配制JC-1工作液和1×JC-1緩沖液，吸棄培養(yǎng)上清液，用1×JC-1緩沖液清洗細(xì)胞一次，每孔加入1 mL

JC-1工作液，37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后，再用1×JC-1緩沖液清洗細(xì)胞一次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下拍照。

2.6" Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

將對(duì)數(shù)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于大皿，藥物分組同“2.4”，藥物干預(yù)48 h后，提取蛋白，按照BCA定量試劑盒定量，配樣、點(diǎn)樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃過(guò)夜孵育一抗PCNA（1∶30 000）、p62（1∶10 000）、Beclin-1（1∶5 000）、LC3Ⅱ/Ι（1∶5 000）、β-actin（1∶1 500）。洗膜、室溫孵育二抗（1∶10 000）1.5 h，洗膜，Image Lab上機(jī)顯影。Image J分析條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7" 透射電鏡檢測(cè)自噬小體

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于小皿，藥物分組同“2.4”，處理48 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以1 000 r/min低速離心3 min（離心半徑9 cm）。棄上清液，加入電鏡固定液，細(xì)胞團(tuán)吹散重懸，室溫避光固定30 min，轉(zhuǎn)入4 ℃，離心、脫水、包埋、超薄切片后，透射電鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成情況。

2.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad Prism 8.0繪圖軟件分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布者，數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 他莫昔芬和MA抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間

與陰性對(duì)照組比較，他莫昔芬各濃度組在干預(yù)MCF-7細(xì)胞24、36、48 h后對(duì)細(xì)胞活力有明顯的抑制作用（Plt;0.01），且隨他莫昔芬濃度增加，MCF-7細(xì)胞活力逐漸降低（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖1。經(jīng)計(jì)算，24、36、48 h的IC50值分別為36.20、35.25、34.58 μmol/L，故選擇48 h和35 μmol/L他莫昔芬作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

與陰性對(duì)照組、MA 80 μmol/L組、MA 100 μmol/L組比較，在MA干預(yù)24、36 h后MA 120 μmol/L組、MA 140 μmol/L組、MA 160 μmol/L組細(xì)胞活力下降（P＜0.01）。MA干預(yù)36 h，與陰性對(duì)照組比較，MA 80 μmol/L組、MA 100 μmol/L組細(xì)胞活力下降（P＜0.05，P＜0.01）；與MA 80 μmol/L組比較，MA 100 μmol/L組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）。與MA

120 μmol/L組比較，干預(yù)36、48 h的MA 140 μmol/L組細(xì)胞活力下降（P＜0.01）；與MA 120 μmol/L組、MA 140 μmol/L組比較，干預(yù)24、36、48 h后的MA 160 μmol/L組細(xì)胞活力下降（P＜0.01）。與陰性對(duì)照組、MA 80 μmol/L組、MA 100 μmol/L組、MA 120 μmol/L組、MA 140 μmol/L組比較，他莫昔芬35 μmol/L組在他莫昔芬干預(yù)24、36 h后細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與MA 160 μmol/L組比較，干預(yù)24 h后細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）。干預(yù)48 h后，與陰性對(duì)照組、MA 80 μmol/L組、MA 100 μmol/L組、MA 120 μmol/L組比較，他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與MA 160 μmol/L組比較，他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。經(jīng)計(jì)算24、36、48 h的IC50分別為184.6、164.2、140.3 μmol/L，選擇48 h和140 μmol/L MA作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

3.2" MA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較，干預(yù)48 h后MA 140 μmol/L組和他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0.01），且他莫昔芬35 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率高于MA 140 μmol/L組（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖3、表1。

3.3" MA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

與陰性對(duì)照組相比，干預(yù)48 h后MA 140 μmol/L組和他莫昔芬35 μmol/L組視野下MCF-7細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的減少，可見(jiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞的綠色熒光明顯增多、紅色熒光減少，細(xì)胞熒光相對(duì)強(qiáng)度呈現(xiàn)不同程度的升高（Plt;0.01）；與MA 140 μmol/L組比較，他莫昔芬35 μmol/L組的細(xì)胞數(shù)量更少，細(xì)胞碎片更多，熒光相對(duì)強(qiáng)度升高更明顯（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖4—5。

3.4" MA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞PCNA、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ι蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

與陰性對(duì)照組相比，MA 140 μmol/L組和他莫昔芬35 μmol/L組的自噬蛋白p62、增殖蛋白PCNA的蛋白相對(duì)表達(dá)量呈不同程度的下降趨勢(shì)（Plt;0.05，Plt;0.01），自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ι的蛋白相對(duì)表達(dá)量呈不同程度的升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。與MA 140 μmol/L組比較，他莫昔芬組35 μmol/L組的增殖蛋白PCNA相對(duì)表達(dá)量降低更明顯（Plt;0.01），自噬蛋白Beclin-1的相對(duì)表達(dá)量升高更明顯（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖6。

3.5" MA對(duì)乳腺癌MCF-7自噬小體的影響

陰性對(duì)照組細(xì)胞膜完整，膜周?chē)梢?jiàn)微絨毛，染色質(zhì)均勻，核膜清晰，線(xiàn)粒體膜完整，基質(zhì)均勻，嵴存在，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見(jiàn)明顯擴(kuò)張。MA 140 μmol/L組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核不規(guī)則，局部凹陷，線(xiàn)粒體膜及膜內(nèi)基質(zhì)密度較高，嵴輕微擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略顯擴(kuò)張，可見(jiàn)自噬小體。他莫昔芬35 μmol/L組細(xì)胞形態(tài)明顯不規(guī)則，細(xì)胞膜局部明顯溶解、破損，細(xì)胞核不規(guī)則，可見(jiàn)雙核仁，線(xiàn)粒體明顯腫脹，基質(zhì)較多溶解，嵴斷裂、消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略顯擴(kuò)張，脂滴數(shù)量較多，形態(tài)皺縮，可見(jiàn)自噬小體。詳見(jiàn)圖7。

4 討論

臨床上將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、人表皮生長(zhǎng)因子受體2型和三陰性乳腺癌4種亞型[18]。乳腺癌的發(fā)生與肥胖[19]、激素水平[20]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[21]等因素相關(guān)，體內(nèi)的乳腺癌易感基因1和乳腺癌易感基因2發(fā)生基因突變則女性患乳腺癌的概率會(huì)比普通人增加數(shù)倍[22]。手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療是治療乳腺癌的首選，但治療后仍存在一定的不良反應(yīng)[23]。中醫(yī)藥管理局認(rèn)可的95種中藥中，有許多被證實(shí)對(duì)乳腺癌具有一定的療效，其中，活血化瘀類(lèi)中藥能夠改善微循環(huán)，糾正腫瘤組織的缺氧狀態(tài)[24-25]。中藥方劑具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)[26-28]。近年來(lái)中醫(yī)藥被證實(shí)在治療乳腺癌方面具有多種獨(dú)特作用，如改善患者生存期、減輕化學(xué)治療不良反應(yīng)[6]、緩解乳腺癌術(shù)后上肢淋巴水腫[29]、減少術(shù)后皮下積液產(chǎn)生[30]、延長(zhǎng)乳腺癌患者內(nèi)分泌耐藥的無(wú)進(jìn)展生存期[31]等。中醫(yī)藥可通過(guò)湯劑、中藥注射液、穴位、針灸、食療、足浴等方法改善乳腺癌患者化學(xué)治療后的相關(guān)不良反應(yīng)[32]。本研究在課題組前期基礎(chǔ)上，選取中藥單體MA——石見(jiàn)穿提取物活性化學(xué)成分之一進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

本研究首先用MTT法確定了MA和他莫昔芬干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最佳濃度和處理時(shí)間，即48 h，他莫昔芬35 μmol/L、MA 140 μmol/L，以此為實(shí)驗(yàn)條件。用Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測(cè)MA誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，MA能明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞以早期凋亡為主，而他莫昔芬35 μmol/L組MCF-7細(xì)胞凋亡效果優(yōu)于MA 140 μmol/L組，其晚期凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)量均多于MA 140 μmol/L組。在正常細(xì)胞內(nèi)，線(xiàn)粒體膜電位較高，JC-1以多聚體形式存在于線(xiàn)粒體基質(zhì)中，顯示紅色熒光；凋亡早期，線(xiàn)粒體膜電位降低，JC-1以單體形式存在于線(xiàn)粒體基質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果提示，陰性對(duì)照組紅色熒光多、視野內(nèi)細(xì)胞聚集，而MA 140 μmol/L組和他莫昔芬35 μmol/L組均呈現(xiàn)了不同程度的綠色熒光增多、視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，可見(jiàn)細(xì)胞碎片，表明MA和他莫昔芬處理MCF-7細(xì)胞48 h后使細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位降低，他莫昔芬比MA降低更明顯。PCNA是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)[33]，Western blot結(jié)果顯示，MA干預(yù)MCF-7細(xì)胞后增殖蛋白PCNA的相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明MA抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞自噬在腫瘤中具有雙重作用，生理?xiàng)l件下一定程度的自噬能夠清除機(jī)體中的代謝廢物，但病理?xiàng)l件下的自噬不足或自噬過(guò)度則會(huì)使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[34]。自噬過(guò)程受自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related" proteins，ATG）的調(diào)控。為確定MA干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞自噬的效應(yīng)，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平。p62與LC3是自噬形成的關(guān)鍵蛋白[35]，Beclin-1是自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Beclin-1的表達(dá)水平可以影響自噬反應(yīng)[36]。Western

blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，MA和他莫昔芬處理MCF-7細(xì)胞后使自噬p62的蛋白相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白相對(duì)表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，表明MA能夠誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬，而他莫昔芬誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬的效果強(qiáng)于MA。自噬的特征在于形成有雙膜囊泡的自噬體，可以降解和回收細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)[37]。通過(guò)透射電鏡觀(guān)察乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)的自噬小體情況，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，加入MA和他莫昔芬后MCF-7的細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體、核仁、染色質(zhì)等形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則變化，可見(jiàn)自噬小體，表明MA和他莫昔芬使乳腺癌MCF-7細(xì)胞的自噬水平升高，他莫昔芬誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬水平發(fā)生高于MA。

綜上所述，通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、線(xiàn)粒體膜電位染色、透射電鏡、Western blot法證實(shí)了MA能夠抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，與降低增殖蛋白PCNA、自噬p62蛋白表達(dá)水平，升高自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。本研究初步探討了MA抗乳腺癌的作用，后續(xù)將對(duì)MA是否通過(guò)信號(hào)通路發(fā)揮抗乳腺癌的作用進(jìn)一步研究，為中醫(yī)藥治療乳腺癌提供新的方案。

參考文獻(xiàn)

[1] XIA C F， DONG X S， LI H， et al. Cancer statistics in China and United States， 2022： Profiles， trends， and determinants[J]. Chinese Medical Journal， 2022， 135（5）： 584-590.

[2] KERR A J， DODWELL D， MCGALE P， et al. Adjuvant and neoadjuvant breast cancer treatments： A systematic review of their effects on mortality[J]. Cancer Treatment Reviews， 2022， 105： 102375.

[3] DEBNATH J， GAMMOH N， RYAN K M. Autophagy and autophagy-related pathways in cancer[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2023， 24（8）： 560-575.

[4] MORANA O， WOOD W， GREGORY C D. The apoptosis paradox in cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（3）： 1328.

[5] 李萍萍. 中醫(yī)藥治療乳腺癌述評(píng)[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 46（11）： 1616-1622.

[6] 楊國(guó)旺. 乳腺癌中西醫(yī)結(jié)合治療研究進(jìn)展[J]. 北京中醫(yī)藥， 2024， 43（1）： 2-6.

[7] 周文靜， 馬艷苗， 張" 萌， 等. 石見(jiàn)穿治療肺癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2020， 31（6）： 677-684.

[8] 劉利艷， 施" 旻， 陳" 力， 等. 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)分析石見(jiàn)穿在治療癌癥中的作用機(jī)制[J]. 實(shí)用癌癥雜志， 2021， 36（10）： 1572-1576.

[9] 彭" 勍， 任鈞國(guó)， 劉建勛. 石見(jiàn)穿化學(xué)成分[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2016， 22（7）： 82-84.

[10] 黃雯潔， 阮" 帥， 溫" 芳， 等. 基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的石見(jiàn)穿化學(xué)成分分析及其治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 57（6）： 1198-1208.

[11] 金貝貝， 劉馨. 羥基積雪草酸抑制人舌癌Tca8113細(xì)胞增殖的機(jī)制研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志， 2020， 36（11）： 1528-1530.

[12] 白溪山， 鄧超銳， 李育曉， 等. 羥基積雪草酸的鎮(zhèn)痛活性及其作用機(jī)制研究[J/OL]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 1-8[2024-04-22]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/32.1157.R.20240227.0917.002.html.

[13] 鄭" 旭， 李世豪， 王雨萌， 等. 羥基積雪草酸抗氧化作用及機(jī)制研究[C]//中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì). 中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第十八屆年會(huì)摘要集. 天津： 大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系， 2022： 2.

[14] 韓" 振， 宋衛(wèi)東， 梁宇平， 等. 羥基積雪草酸預(yù)防膿毒癥小鼠急性肺損傷的作用[J]. 遵義醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 46（9）： 841-845， 855.

[15] 喻偉光， 田振峰， 李彥敏， 等. 羥基積雪草酸通過(guò)調(diào)控MMPs的表達(dá)抑制大鼠炎性骨破壞的作用研究[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制， 2021， 37（1）： 57-60， 103.

[16] 劉" 媛. 石見(jiàn)穿誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制研究[D]. 長(zhǎng)沙： 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 2018.

[17] 劉" 媛， 錢(qián)榮康， 錢(qián)榮華. 石見(jiàn)穿及其提取物抗腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2018， 27（30）： 3417-3420.

[18] QIU D， ZHANG G J， YAN X X， et al. Prospects of immunotherapy for triple-negative breast cancer[J]. Frontiers in Oncology， 2021， 11： 797092.

[19] 阮" 慧， 鄧顯光， 范洪橋， 等. 肥胖影響乳腺癌發(fā)病的機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 浙江醫(yī)學(xué)， 2024， 46（4）： 429-433.

[20] 魏" 萬(wàn)， 唐" 杰， 封紫玉， 等. 雄激素受體有望成為乳腺癌中新的生物標(biāo)志物[J]. 安徽醫(yī)藥， 2023， 27（12）： 2343-2346.

[21] 周小妹， 羅" 波. 影響三陰性乳腺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的潛在生物學(xué)因素[J]. 腫瘤， 2023， 43（2）： 143-150.

[22] 楊琛擘， 宋" 穎， 申培紅， 等. 乳腺癌易感基因1/2和特異性基因1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究， 2019， 28（5）： 956-958.

[23] KHOSRAVI-SHAHI P， CABEZQN-GUTIQRREZ L， APARICIO SALCEDO M I. State of art of advanced triple negative breast cancer[J]. The Breast Journal， 2019， 25（5）： 967-970.

[24] BAI J， KWOK W C， THIERY J P. Traditional Chinese Medicine and regulatory roles on epithelial-mesenchymal transitions[J]. Chinese Medicine， 2019， 14： 34.

[25] ZHAI B T， ZHANG N N， HAN X M， et al. Molecular targets of β-elemene， a herbal extract used in traditional Chinese medicine， and its potential role in cancer therapy： A review[J]. Biomedecine amp; Pharmacotherapie， 2019， 114： 108812.

[26] JIANG M Y， ZHAO S J， YANG S S， et al. An \"essential herbal medicine\"-licorice： A review of phytochemicals and its effects in combination preparations[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 249： 112439.

[27] JIANG M Y， SHENG F Y， ZHANG Z， et al. Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees and its major constituent andrographolide as potential antiviral agents[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2021， 272： 113954.

[28] JIANG H J， LI J， WANG L， et al. Total glucosides of paeony： A review of its phytochemistry， role in autoimmune diseases， and mechanisms of action[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 258： 112913.

[29] 陳虎虎， 周姣含， 邱" 倩， 等. 中醫(yī)藥治療乳腺癌的研究進(jìn)展[J]. 西部中醫(yī)藥， 2023， 36（12）： 152-155.

[30] 楊" 帆， 全建峰. 中醫(yī)藥治療乳腺癌根治術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥研究進(jìn)展[J]. 河北中醫(yī)， 2023， 45（11）： 1924-1928.

[31] 王魯嬌， 李育林， 司文濤， 等. 中醫(yī)藥治療乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)腫瘤學(xué)雜志， 2023， 5（5）： 84-94.

[32] 李晶晶， 孫" 濤. 中醫(yī)藥改善乳腺癌化療不良反應(yīng)概況[J]. 中醫(yī)臨床研究， 2020， 12（14）： 133-135.

[33] 李紅玉， 陳碩然， 戴" 安， 等. PCNA在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2020， 41（1）： 118-119， 122.

[34] DEBNATH J， GAMMOH N， RYAN K M. Autophagy and autophagy-related pathways in cancer[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2023， 24（8）： 560-575.

[35] 羅" 成， 葉遠(yuǎn)航， 凃晉文， 等. 中藥調(diào)控自噬相關(guān)通路抗肺癌的研究進(jìn)展[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 39（11）： 1155-1164.

[36] PRERNA K， DUBEY V K. Beclin1-mediated interplay between autophagy and apoptosis： New understanding[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2022， 204： 258-273.

[37] HOLLENSTEIN D M， KRAFT C. Autophagosomes are formed at a distinct cellular structure[J]. Current Opinion in Cell Biology， 2020， 65： 50-57.

（本文編輯" 田夢(mèng)妍）

〔收稿日期〕2023-11-17

〔基金項(xiàng)目〕湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014FJ3085）；湖南省教育廳基金項(xiàng)目（14C0858）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（2021XJJJ001）；廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥局自籌經(jīng)費(fèi)科研課題項(xiàng)目（GXZYC20230219）。

〔通信作者〕*錢(qián)榮華，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：rhqian@hnucm.edu.cn。