基于PERK/ATF4/CHOP信號通路研究滋陰明目方含藥血清對衣霉素誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的作用機制

〔摘要〕 目的 研究滋陰明目方含藥血清對衣霉素誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的影響及其可能機制。方法 構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，將ARPE-19細(xì)胞分為空白組、模型組、空白血清組、滋陰明目方含藥血清組、牛磺熊去氧膽酸組。對細(xì)胞進行形態(tài)觀察，CCK-8檢測細(xì)胞存活率，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測細(xì)胞蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、C/EBP同源蛋白（CHOP）蛋白的表達。結(jié)果 選用濃度50 μmol/L衣霉素干預(yù)ARPE-19細(xì)胞造模。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，滋陰明目方含藥血清組和牛磺熊去氧膽酸組ARPE-19細(xì)胞較模型組細(xì)胞數(shù)量增多，生長較均勻，漂浮的死亡ARPE-19細(xì)胞及碎片減少。與空白組相比，模型組和空白血清組的細(xì)胞存活率下降（P＜0.01），凋亡率明顯上升（P＜0.01），PERK、ATF4、CHOP蛋白表達上調(diào)（P＜0.01）。與模型組相比，滋陰明目方含藥血清組細(xì)胞存活率上升（P＜0.01），凋亡率明顯下降（P＜0.01），PERK、ATF4、CHOP蛋白表達下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論 滋陰明目方含藥血清可以減少ARPE-19細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型的凋亡，其分子機制與調(diào)控PERK-ATF4-CHOP信號通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 滋陰明目方；ARPE-19細(xì)胞；衣霉素；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型；PERK/ATF4/CHOP信號通路

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.010

Mechanism of action of Ziyin Mingmu Formula medicated serum on tunicamycin-induced ARPE-19 cells based on PERK/ATF4/CHOP

signaling pathway

XIE Wei1， PENG Jun1，2， SONG Houpan1， OU Chen1，2*， PENG Qinghua1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Ziyin Mingmu Formula （ZYMMF） medicated serum on tunicamycin （TM）-induced ARPE-19 cells and its potential mechanism. Methods The endoplasmic reticulum stress injury model was constructed and ARPE-19 cells were divided into blank control， model， blank control serum， ZYMMF medicated serum， and taurodeoxycholic acid groups. Cell morphology was observed， cell survival rate was determined by CCK-8， cell apoptosis was tested by TUNEL， and protein expressions of PERK kinase （PERK）， activating transcription factor 4 （ATF4）， and transcription factor CHOP （CHOP） were measured by Western blot. Results ARPE-19 cells were treated with 50 μmol/L tunicamycin for modeling. Compared with the model group， the number of ARPE-19 cells in ZYMMF medicated serum and taurodeoxycholic acid groups increased with more uniform growth and reduced floating dead ARPE-19 cells and fragments. Compared with blank control group， the cell survival rate in model group and blank control serum group decreased （Plt;0.01）， the apoptosis rate increased significantly （Plt;0.01）， and the protein expressions of PERK， ATF4， and CHOP were significantly up-regulated （Plt;0.01）. Compared with the model group， the survival rate of ZYMMF medicated serum group increased （Plt;0.01）， the apoptosis rate decreased significantly （Plt;0.01）， and the protein expressions of PERK， ATF4， and CHOP were significantly down-regulated （Plt;0.01）. Conclusion ZYMMF medicated serum can reduce the apoptosis of endoplasmic reticulum stress injury model of ARPE-19 cells， and its molecular mechanism is related to the regulation of PERK/ATF4/CHOP signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Ziyin Mingmu Formula; ARPE-19 cells; tunicamycin; endoplasmic reticulum stress injure model; PERK/ATF4/CHOP signaling pathway

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、加工、運輸和維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[1]。多種因素如缺氧、營養(yǎng)缺乏、溫度或pH變化、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等可能擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有助于機體抵御外來刺激、恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)；而持續(xù)性的、強烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反而會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失代償，啟動相關(guān)細(xì)胞凋亡程序[3]。PERK-ATF4-CHOP信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路[4]。

視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞是位于光感受器和Bruch膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體之間富含色素的單層上皮細(xì)胞，在視覺功能中起著至關(guān)重要的作用，若結(jié)構(gòu)和功能受損會導(dǎo)致多種視網(wǎng)膜退行性疾病[5]。研究表明，視網(wǎng)膜退行性疾病中RPE細(xì)胞的損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切[6-7]。本團隊自20世紀(jì)90年代一直從事視網(wǎng)膜退行性疾病的防治研究，優(yōu)化出滋陰明目方，臨床療效顯著[8-9]。前期研究證實，滋陰明目方可增加視網(wǎng)膜厚度、改善視網(wǎng)膜功能[10]。本研究借助衣霉素誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，以PERK/ATF4/CHOP信號通路為切入點，探討滋陰明目方調(diào)控ARPE-19細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的潛在機制。

1 材料

1.1" 細(xì)胞

實驗細(xì)胞為ARPE-19細(xì)胞（批號：GNHu45），即人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2" 藥物

實驗藥物為滋陰明目方（熟地黃、枸杞子、黃精、丹參、川芎、牛膝各15 g），所有藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。枸杞子，產(chǎn)地：寧夏，批號：NG21112803；丹參，產(chǎn)地：山東，批號：TH21102403；熟地黃，產(chǎn)地：河南，批號：2108203；黃精，產(chǎn)地：河北，批號：2021102508；川芎，產(chǎn)地：四川彭州，批號：2106076；牛膝，產(chǎn)地：河南，批號：TH21092601。

1.3" 主要試劑

衣霉素（批號：M4798）、牛磺熊去氧膽酸（貨號：M5158）、CCK-8試劑盒（貨號：M4839）購自美國Abmole Bioscience公司；Tunel凋亡檢測試劑盒（貨號KTA2010）購自美國Abbkine公司；12-230 kDa Wes分離試劑盒（貨號SM-W004）、Wes抗兔檢測試劑盒（貨號：DM-001）購自美國ProteinSimple公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：5174S）、PERK抗體（貨號：5683）、ATF4抗體（貨號：11815）購自美國Cell Signaling Technology公司；CHOP抗體（貨號：NB600-1335SS）購自美國Novus Biologicals公司。

1.4" 主要儀器

HERAcell vios 250i型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher Scientific公司）；IncuCyte S3型多時間動態(tài)細(xì)胞功能分析系統(tǒng)（美國Essen BioScience公司）；Panoramic MIDI型全景掃描儀（匈牙利3D HISTECH公司）；Wes全自動蛋白表達分析系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）。

2 方法

2.1" 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型構(gòu)建

采用衣霉素干預(yù)ARPE-19細(xì)胞，構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型[11]。ARPE-19細(xì)胞用DMEM/F12液體培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液制備細(xì)胞懸液，接種于96孔板。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度控制在6 000個細(xì)胞/孔。衣霉素設(shè)置7個濃度組（1、2、5、10、20、50、100 μmol/L），采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。每組設(shè)4個復(fù)孔，放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，采用微孔板分光光度計在450 nm處檢測吸光度OD值，計算細(xì)胞存活率和IC50值，得出最佳干預(yù)濃度。

2.2" 滋陰明目方含藥血清制備

20只成年健康雄性SD大鼠隨機分成空白組、含藥血清組，每組10只。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)“動物與人體質(zhì)量的每千克質(zhì)量等效劑量折算系數(shù)”計算動物給藥臨床等效劑量，折算系數(shù)W=6.25。取5倍大鼠臨床等效劑量水煎制成滋陰明目方混懸液，用以含藥血清組灌胃，空白組予以蒸餾水灌胃，每日1次。連續(xù)灌胃7 d后麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，收集血液于15 mL的無菌離心管內(nèi)，顛倒混勻后靜置。4 ℃、3 500 r/min（離心半徑10 cm），離心10 min，收集上清液于無菌50 mL離心管。56 ℃水浴滅活30 min，在超凈工作臺用一次性無菌注射器和0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

2.3" 實驗分組及干預(yù)方法

實驗分為空白組、模型組、空白血清組、滋陰明目方含藥血清組、牛磺熊去氧膽酸組5組。正常未處理的ARPE-19細(xì)胞設(shè)為空白組，其余組均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型。依據(jù)前期實驗結(jié)果，牛磺熊去氧膽酸組加入100 μmol/L牛磺熊去氧膽酸干預(yù)24 h[12]。空白血清組和滋陰明目方含藥血清組分別加入10%濃度的空白血清和滋陰明目方含藥血清干預(yù)24 h。

2.4" 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1" 細(xì)胞形態(tài)觀察" 干預(yù)24 h后，使用多時間動態(tài)細(xì)胞功能分析系統(tǒng)對各組細(xì)胞進行形態(tài)觀察。

2.4.2" CCK-8檢測細(xì)胞活力" 干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入110 μL按9∶1用新鮮養(yǎng)基培稀釋CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，采用微孔板分光光度計在450 nm檢測吸光度OD值，計算存活率。

2.4.3" TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡" 干預(yù)24 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，加入破膜工作液孵育30 min，PBS洗滌3次。然后滴加50 μL反應(yīng)混合液，37 ℃孵育2 h后，PBS洗滌，行DAPI核染色10 min，使用全景切片掃描儀采集圖像，Image J軟件統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)量。

2.4.4" Western blot檢測蛋白的表達" 干預(yù)24 h后，用RIPA組織細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)12-230 kDa Wes分離試劑盒說明書要求進行操作，配制DTT、Loading Buffer和Marker，將配制好的細(xì)胞樣品放在95 ℃變性5 min后，冰上冷卻5 min，每孔加入3 μL樣品。按1∶25稀釋ATF4和CHOP抗體，1∶50稀釋PERK抗體，1∶100稀釋GAPDH抗體，每孔加入10 μL抗體稀釋液。再依次加入Streptavidin-HRP、二抗、發(fā)光液、Wash Buffer，室溫下2 500 r/min離心5 min（離心半徑10 cm）。使用全自動蛋白表達分析系統(tǒng)檢測，結(jié)果用Compass for SW software 5.0.1進行分析。

2.5" 統(tǒng)計分析

本研究采用Graphpad Prism 8進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及繪圖。符合正態(tài)分布的計量資料以“ｘ±s”描述。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 衣霉素對細(xì)胞活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，衣霉素對細(xì)胞有抑制作用并呈劑量趨勢，顯示隨著濃度的增高，細(xì)胞存活率下降得越明顯。通過SPSS計算每組抑制率IC50為51.05，故本次實驗采用濃度50 μmol/L衣霉素干預(yù)ARPE-19細(xì)胞進行后續(xù)實驗。詳見圖1。

3.2" 各組細(xì)胞形態(tài)比較

空白組ARPE-19細(xì)胞貼壁，呈梭形，具有上皮細(xì)胞特征，細(xì)胞生長均勻。模型組ARPE-19細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細(xì)胞核變圓、腫大，細(xì)胞數(shù)量減少，生長不均勻，可見漂浮的死亡ARPE-19細(xì)胞及碎片。滋陰明目方含藥血清組和牛磺熊去氧膽酸組ARPE-19細(xì)胞較模型組細(xì)胞數(shù)量增多，生長較均勻，漂浮的死亡ARPE-19細(xì)胞及碎片減少。詳見圖2。

3.3" 各組細(xì)胞存活率比較

CCK-8結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、空白血清組、滋陰明目方含藥血清組存活率均下降（P＜0.01）。與模型組相比，空白血清組數(shù)值差異不大（P＞0.05），滋陰明目方含藥血清組和牛磺熊去氧膽酸組細(xì)胞存活率上升（P＜0.01）。詳見表1。

3.4" 各組細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL法染色結(jié)果顯示，與空白組相比，各組細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞比例上升（P＜0.01）。與模型組相比，空白血清組數(shù)值差異不大（P＞0.05），滋陰明目方含藥血清組和牛磺熊去氧膽酸組細(xì)胞凋亡率均明顯下降（P＜0.01）。詳見表2。

3.5" 各組細(xì)胞PERK、ATF4、CHOP蛋白表達比較

Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、空白血清組PERK、ATF4、CHOP蛋白表達上調(diào)。滋陰明目方含藥血清組PERK、CHOP蛋白表達上調(diào)，牛磺熊去氧膽酸PERK、ATF4蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，滋陰明目方含藥血清組和牛磺熊去氧膽酸組PERK、ATF4、CHOP蛋白表達下調(diào)（P＜0.01）。詳見圖3。

4 討論

RPE細(xì)胞是位于光感受器和Bruch膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體之間富含色素的單層六角形上皮細(xì)胞，其主要作用是吞噬感光細(xì)胞脫落的外節(jié)膜盤[13]。研究認(rèn)為，視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)生是因為RPE對感光細(xì)胞脫落的膜盤吞噬功能下降，致使其在視網(wǎng)膜外層堆積，結(jié)構(gòu)紊亂，從而引起視覺功能障礙[14]。同時RPE細(xì)胞還能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、參與視循環(huán)代謝、發(fā)揮血-視網(wǎng)膜屏障作用，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[15-16]。視網(wǎng)膜退行性疾病患者RPE細(xì)胞的色素顆粒減少，局部增生形成色素團塊。部分色素細(xì)胞移位到動靜脈周圍，優(yōu)先獲得血液供給，使得視網(wǎng)膜血液供給減少，進而加重視網(wǎng)膜的損害[17]。

視網(wǎng)膜退行性疾病與肝腎密切相關(guān)，主要病機為先天稟賦不足或后天目失所養(yǎng)，致神光衰微。腎藏精，肝藏血，精與血二者相互為用，相互滋生，故中醫(yī)治療眼科疾病時有肝腎同源、肝腎同治之說[18]。臨床上治療該病多以“滋補肝腎，活血明目”為基本法則。滋陰明目方中熟地黃補肝腎、益真陰為君藥，枸杞子益精明目、黃精補氣養(yǎng)陰為臣藥，佐以丹參、川芎活血化瘀，使以牛膝補肝腎、引火下行。諸藥合之，共奏滋補肝腎、活血明目之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，熟地黃粗提取物對光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷有保護作用，可能與抗氧化和促進抗炎基因表達有關(guān)[19]。枸杞子中的胡蘿卜素能促進視網(wǎng)膜內(nèi)視紫紅質(zhì)的再生或合成，有效保護視神經(jīng)[20]。黃精含有的黃精多糖能逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜電圖振幅的降低，緩解視網(wǎng)膜血管的異常和滲漏，減少視網(wǎng)膜TUNEL陽性細(xì)胞，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[21]。

衣霉素是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的常用化合物，能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白糖基化途徑中十四糖二磷酸長萜醇的生成，使新生蛋白質(zhì)不能正確折疊而堆積[22]。本實驗用衣霉素構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，通過計算IC50篩選出濃度50 μmol/L衣霉素干預(yù)ARPE-19細(xì)胞造模。研究結(jié)果顯示，模型組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞核變圓、腫大，細(xì)胞數(shù)量減少，活力降低，凋亡率升高，證實了模型構(gòu)建成功。牛磺熊去氧膽酸是熊膽汁中主要有效成分，常用來作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，對神經(jīng)退行性疾病也有潛在治療作用，可作為實驗的陽性對照[23]。

細(xì)胞凋亡是生理或病理條件下的一種由遺傳基因控制的細(xì)胞主動死亡形式，對維持機體的正常發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。本實驗通過TUNEL法檢測ARPE-19細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)滋陰明目方含藥血清可降低衣霉素誘導(dǎo)后細(xì)胞的凋亡率，而空白血清效果不明顯，提示滋陰明目方對過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡有抑制作用。PERK-ATF4-CHOP信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，GRP78與跨膜蛋白PERK發(fā)生解離，同時與未折疊蛋白結(jié)合，導(dǎo)致下游相關(guān)信號通路激活[24]。PERK通過激活eIF2α磷酸化，阻止新合成的蛋白進入處于應(yīng)激狀態(tài)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。磷酸化的起始因子2的α亞單位（eIF2α）選擇性增強ATF4 mRNA的翻譯，上調(diào)CHOP的表達[25]。CHOP通過調(diào)控線粒體途徑和死亡受體途徑兩大經(jīng)典方式執(zhí)行細(xì)胞凋亡。本實驗采用Westen blot檢測ARPE-19細(xì)胞中PERK、ATF4、CHOP蛋白的表達，與空白組相比，模型組PERK、ATF4、CHOP蛋白表達上調(diào)。滋陰明目方含藥血清干預(yù)后，PERK、ATF4、CHOP表達降低，提示滋陰明目方含藥血清可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減少RPE細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究利用衣霉素成功誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，采用滋陰明目方含藥血清進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)滋陰明目方含藥血清可以減少ARPE-19細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型的凋亡，其分子機制與調(diào)控PERK-ATF4-CHOP信號通路有關(guān)。該研究為RP潛在機制研究提供了新思路，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

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（本文編輯" 蘇" 維）

〔收稿日期〕2023-10-11

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金面上項目（82074196，82004427）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2023JJ40474）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（23B0347）；中醫(yī)藥防治五官科疾病湖南省重點實驗室建設(shè)項目（2017TP1018）。

〔通信作者〕*彭清華，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：pengqinghua@hnucm.edu.cn；歐" 晨，男，博士，E-mail：465325286@qq.com。