甘草甜素調節HMGB1/RAGE信號通路對高糖誘導的心肌細胞凋亡和自噬的影響

潘娟 王琪 田艷妮

摘要? 目的：甘草甜素（Gly）調節高遷移率族蛋白（HMGB1）/晚期糖基化終產物受體（RAGE）信號通路對高糖誘導的心肌細胞凋亡和自噬的影響。方法：體外培養大鼠心肌細胞H9c2，將其分為7組：對照組、高糖組、高糖＋Gly組、高糖＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組。細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞活力；V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）法檢測細胞凋亡率；透射電鏡觀察細胞自噬；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測B細胞淋巴瘤/白血病基因-2相關X蛋白基因（Bax）、微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）和Beclin-1凋亡、自噬相關蛋白表達；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針法檢測活性氧（ROS）水平；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測HMGB1、RAGE mRNA表達水平。結果：與對照組比較，高糖組H9c2細胞活力下降，細胞凋亡率、自噬小體數量及Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達增加，IL-1β、TNF-α、ROS水平及HMGB1、RAGE mRNA表達增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞活力升高，細胞凋亡率、自噬小體數量及Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達減少，IL-1β、TNF-α、ROS水平及HMGB1、RAGE mRNA表達減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞活力下降，細胞凋亡率、自噬小體數量及Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達增加，IL-1β、TNF-α、ROS水平及HMGB1、RAGE mRNA表達增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：Gly能夠減輕高糖誘導的H9c2細胞炎癥和氧化應激反應，抑制其凋亡和自噬，可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路有關。

關鍵詞? 甘草甜素；高遷移率族蛋白；晚期糖基化終產物受體；高糖；心肌細胞；細胞凋亡；細胞自噬；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.007

Effects of Glycyrrhizin Modulating HMGB1/RAGE Signaling Pathway on Apoptosis and Autophagy of Cardiomyocytes Induced by High Glucose

PAN Juan， WANG Qi， TIAN Yanni

Xian Yang Central Hospital， Xianyang 712000， Shaanxi， China

Corresponding Author? ?TIAN Yanni， E-mail： tianyn0516@163.com

Abstract? Objective：To investigate the effect of glycyrrhizin（Gly） on apoptosis and autophagy induced by high glucose in cardiomyocytes by regulating the high mobility group box protein（HMGB1）/receptor for advanced glycation end products（RAGE） signaling pathway.Methods：Rat cardiomyocytes H9c2 were cultured in vitro and divided into control（Ctrl） group，high glucose group，high glucose＋Gly group，high glucose＋pcDNA3.1 empty vector group，high-glucose＋pcDNA3.1-HMGB1 group，high glucose＋Gly＋pcDNA3.1 empty vector group，and high glucose＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1 group.Cell viability was detected by cell counfing kit-8（CCK-8） assay.Apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC/propyl iodide（PI） method.Autophagy was observed by transmission electron microscopy.The expression of B-cell lymphoma/leukemia gene-2-related X protein gene（Bax），microtubule-related protein 1 light chain 3（LC3） and Beclin-1 apoptosis and autophagy-related protein were detected by Western Blot.The levels of interleukin-1β（IL-1β） and tumor necrosis factor α（TNF-α） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.2，7-dichlorofluorescein diacetate（DCFH-DA） fluorescence probe method was performed to detect reactive oxygen species（ROS）.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR） was performed to detect the mRNA expression levels of HMGB1 and RAGE.Results：Compared with Ctrl group，H9c2 cell viability inhigh glucose group decreased，apoptosis rate，autophagosome number and protein expression of Bax，LC3 and Beclin-1 increased，IL-1β，TNF-α，ROS levels and mRNA expression of HMGB1 and RAGE increased，with statistical significance（P＜0.05）.Compared with the high glucose group，the H9c2 cell viability was increased in the high glucose＋Gly group，the apoptosis rate，the number of autophagosomes and the expression of Bax，LC3 and Beclin-1 protein decreased，and the levels of IL-1β，TNF-α and ROS and the mRNA expressions of HMGB1 and RAGE decreased，with statistical significance（P＜0.05）.Compared with the high glucose＋Gly group，the viability of H9c2 cells in the high glucose＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1 group decreased，the apoptosis rate，the number of autophagosomes and the expression of Bax，LC3 and Beclin-1 protein increased，the levels of IL-1β，TNF-α and ROS and the expression of HMGB1 and RAGE mRNA increased.The differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Gly can reduce the inflammation and oxidative stress response of H9c2 cells induced by high glucose，inhibit their apoptosis and autophagy，which may be related to the inhibition of HMGB1/RAGE signaling pathway.

Keywords? glycyrrhizin; high mobility group box protein; receptor for advanced glycation end products;high glucose; cardiomyocytes; apoptosis; autophagy; experimental study

糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，

通訊作者? 田艷妮，E-mail：tianyn0516@163.com

引用信息? 潘娟，王琪，田艷妮.甘草甜素調節HMGB1/RAGE信號通路對高糖誘導的心肌細胞凋亡和自噬的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（11）：1961-1966.

DCM）是一種以心臟結構和功能的異常改變為特征的糖尿病并發癥，也是引發糖尿病病人死亡的常見原因之一［1］。研究顯示，炎癥和氧化應激反應在DCM的發生進展中發揮著關鍵性作用，過度累積的炎性因子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）可誘導心臟收縮功能受損，促進心肌細胞凋亡和自噬［2-3］。因此，抑制炎癥和氧化應激反應是防治DCM的重要方向。

甘草甜素（glycyrrhizin，Gly）是從中藥甘草的根中分離得到的一種三萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節、抗潰瘍等廣泛的藥理生物活性［4］。有研究顯示，Gly對心臟損傷有一定的保護作用［5］。但關于Gly對DCM的作用及潛在機制目前仍不清楚。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）/晚期糖基化終產物受體（receptor of advanced glycation end-product，RAGE）作為在誘導炎癥和氧化應激反應中發揮重要作用的信號通路已被廣泛研究，且研究顯示HMGB1/ RAGE參與糖尿病及相關并發癥的發生進展［6-7］。此外，有研究報道稱Gly可通過抑制HMGB1/RAGE信號通路而改善2，4-二硝基氯苯誘導的小鼠特應性皮炎癥狀或減輕腦靜脈竇阻塞再通引發的腦損傷［8-9］。本研究利用高糖誘導大鼠心肌細胞H9c2損傷，觀察Gly對H9c2細胞凋亡和自噬的影響，同時分析HMGB1/RAGE信號通路在其中的作用，初步揭示Gly在DCM疾病中的調控機制。

1? 材料與方法

1.1? 材料

ATCC來源大鼠H9c2細胞購自上海雅吉生物科技有限公司；Gly購自上海恒斐生物科技有限公司；pcDNA3.1空載體及pcDNA3.1-HMGB1購自上海吉瑪制藥公司；Lipofectamine-2000購自上海玉博生物科技有限公司；細胞計數（CCK-8）試劑盒、V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒、ROS

2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針試劑盒、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自上海碧云天生物公司；大鼠白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司；Trizol購自上海聯碩生物科技有限公司；HMGB1、RAGE引物由北京全式金生物公司設計合成；兔源一抗anti-B細胞淋巴瘤/白血病基因-2相關X蛋白基因（B-cell lymphoma/leukemia gene-2 associated X Protein，Bax）、anti-微管相關蛋白1輕鏈3（microtu-bule associated protein 1 light chain 3，LC3）、anti-Beclin-1和山羊抗兔二抗購自Abcam公司。

1.2? 細胞處理及分組

H9c2細胞采用低糖（5.5 mmol/L）杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。待細胞密度約80%時收集，以1×106個/孔接種至6孔板內，待細胞密度約80%時利用Lipofectamine-2000分別將pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-HMGB1轉染至H9c2細胞中，同時設置未轉染的H9c2細胞，48 h后經實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測轉染效果。

實驗分為對照組、高糖組、高糖＋Gly組、高糖＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組。對照組、高糖組將未轉染的H9c2細胞分別用低糖（5.5 mmol/L）DMEM培養基、高糖（35 mmol/L）DMEM培養基重懸［10］；高糖＋Gly組將未轉染的H9c2細胞用含20 μmol/L Gly［11］的高糖DMEM培養基重懸；高糖＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1空載體組、高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組將轉染pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-HMGB1的H9c2細胞分別用高糖DMEM培養基、含20 μmol/L Gly的高糖DMEM培養基重懸。

1.3? CCK-8法檢測各組H9c2細胞活力

將各組H9c2細胞以1×104個/孔接種至96孔板內，培養48 h后加入CCK-8試劑并繼續培養2 h，借助Thermo MultiskanTMFC酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）。細胞活力與OD450值成正比。

1.4? Annexin V-FITC/PI法檢測各組H9c2細胞凋亡率

將各組H9c2細胞以5×104個/孔接種至24孔板內，培養48 h后收集。將H9c2細胞轉移至流式管內（100 μL中2×105個），加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃孵育15 min，而后加入5 μL的PI，4 ℃孵育5 min，借助BD FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5? 透射電鏡觀察各組H9c2細胞自噬

細胞培養處理同1.4，將H9c2細胞依次經戊二醛固定2 h、鋨酸固定2 h，磷酸緩沖液洗后進行乙醇梯度脫水，而后進行包埋、超薄切片（60～80 nm），醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色15 min，于低壓小型透射電鏡（LVEM）下觀察并分析。

1.6? 蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測凋亡和自噬相關蛋白表達情況

細胞培養處理同1.4，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定濃度后進行定量、變性，隨后進行凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉，孵育兔源一抗anti-Bax、anti-LC3、anti-Beclin-1和anti-GAPDH（4 ℃過夜），次日孵育山羊抗兔二抗（室溫2 h），最后滴加增強化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL），置于Tocan360凝膠成像分析系統中拍照，借助Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析。

1.7? H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平檢測

細胞培養處理同1.4，收集培養上清，利用ELISA試劑盒測定上清中IL-1β、TNF-α水平；而后向各孔中加入無血清培養液稀釋的DCFH-DA熒光探針（終濃度10 μmol/L），37 ℃孵育20 min后收集細胞，借助BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測平均熒光強度。ROS水平與平均熒光強度成正比。

1.8? qRT-PCR檢測各組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達水平

細胞培養處理同1.4，加入Trizol提取總RNA，經反轉錄合成cDNA，而后利用ABI7500 qRT-PCR儀擴增cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2－△△CT法分析HMGB1、RAGE表達水平。引物序列：HMGB1正向引物為5′-CTAGCCCTGTCCTGGTGGTATT-3′，反向引物為5′-CCAATTTACAACCCCCAGACTGT-3′；RAGE正向引物為5′-AGGAAAGCCCTCCTGTCAACA-3′，反向引物為5′-CACAGAGCCTGCAGCTTGTC-3′；GAPDH正向引物為5′-GAAGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向引物為5′-CATGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.9? 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較行One-way ANOVA分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結? 果

2.1? 各組H9c2細胞活力比較

與對照組比較，高糖組H9c2細胞活力下降（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞活力升高（P＜0.05），高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞活力下降（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞活力下降（P＜0.05）。詳見表1。

2.2? 各組H9c2細胞凋亡和自噬情況比較

與對照組比較，高糖組H9c2細胞凋亡率、自噬小體數量增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞凋亡率、自噬小體數量減少（P＜0.05），高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞凋亡率、自噬小體數量增加（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞凋亡率、自噬小體數量增加（P＜0.05）。詳見圖1、圖2、表2。

2.3? 各組H9c2細胞凋亡和自噬相關蛋白表達情況

與對照組比較，高糖組H9c2細胞Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達減少（P＜0.05），高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達增加（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞Bax、LC3、Beclin-1蛋白表達增加（P＜0.05）。詳見表3、圖3。

2.4? 各組H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平比較

與對照組比較，高糖組H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平減少（P＜0.05），高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平增加（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞IL-1β、TNF-α及ROS水平增加（P＜0.05）。詳見表4。

2.5? 各組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達水平比較

與對照組比較，高糖組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達減少（P＜0.05），高糖＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達增加（P＜0.05）；與高糖＋Gly組比較，高糖＋Gly＋pcDNA3.1-HMGB1組H9c2細胞HMGB1、RAGE mRNA表達增加（P＜0.05）。詳見表5。

3? 討? 論

DCM是一種獨立于其他疾病的心臟損傷，由糖尿病本身引起，發病早期表現為心室舒張功能異常，后期表現為收縮功能障礙，若治療不當，可發展為心力衰竭、心律失常、心源性休克甚至猝死［12］。據報道，DCM的發病機制涉及糖脂代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應、心肌鈣調節機制受損等多種途徑，其中炎癥和氧化應激反應日益受到關注［13］。高血糖可促進ROS和炎性因子的過量產生，進而誘導心肌細胞凋亡和心功能損傷［14-15］。本研究中，H9c2細胞經高糖處理后，其IL-1β、TNF-α、ROS水平明顯升高，同時細胞活力下降，細胞凋亡率、自噬小體數量及自噬、凋亡相關蛋白Bax、LC3、Beclin-1表達增加，表明高糖誘導H9c2細胞發生了炎癥氧化應激反應，促進其凋亡和自噬。

Gly是甘草的主要活性成分之一，在各種疾病模型中，Gly已顯示出抗炎和抗氧化應激的巨大潛力。Gly可通過抑制炎癥反應減輕偶氮氧甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導的結直腸癌小鼠的癌變［16］。Gly可通過抑制炎癥和氧化應激反應改善Ⅱ型膠原誘導的關節炎癥［17］。此外，Xu等［18］研究發現Gly可通過調節炎癥和氧化狀態改善心肌缺血損傷，其作用機制可能與激活核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1、抑制核因子κB信號通路有關。本研結果顯示，與高糖組比較，高糖＋Gly組H9c2細胞IL-1β、TNF-α、ROS水平下降，同時細胞活力升高，凋亡和自噬現象好轉，表明Gly能夠減輕高糖誘導的H9c2細胞炎癥和氧化應激反應，抑制其凋亡和自噬。

炎癥和氧化應激反應過程涉及諸多信號通路的調節，其中HMGB1/RAGE發揮著關鍵性作用，HMGB1是一種因在凝膠電泳時遷移速度快而得名的高度保守的核蛋白，當受到外界刺激時HMGB1被釋放到胞外，與膜受體RAGE相結合而促進多種炎性因子的表達，誘導或加重炎癥和氧化應激反應［19］。研究顯示，HMGB1/RAGE信號通路參與肺部疾?。?0］、風濕性疾?。?1］、膿毒癥［22］、糖尿病及其相關并發癥［6-7］等多種疾病的病理過程。本研究發現，H9c2細胞經高糖處理后HMGB1、RAGE表達增加，且過表達HMGB1后，H9c2細胞中IL-1β、TNF-α、ROS水平升高，細胞活力下降，凋亡和自噬現象加重，表明HMGB1/RAGE信號通路參與了高糖誘導的H9c2細胞損傷。為了探究抑制HMGB1/RAGE信號通路是否為Gly減輕高糖誘導的H9c2細胞損傷的潛在機制，首先檢測了高糖致損傷的H9c2細胞在經Gly干預后其HMGB1、RAGE表達的差異，結果顯示HMGB1、RAGE表達減少；然后在Gly干預的同時通過轉染使HMGB1過表達，結果發現，Gly減輕高糖誘導的H9c2細胞炎癥和氧化應激反應，抑制其凋亡和自噬的作用被削弱，上述結果綜合表明抑制HMGB1/RAGE信號通路為Gly的潛在機制。

綜上所述，Gly能夠減輕高糖誘導的H9c2細胞炎癥和氧化應激反應，抑制其凋亡和自噬，可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路有關。

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（收稿日期：2022-12-05）

（本文編輯郭懷印）